Name: monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples
Uploaded: 2021-05-21T14:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples at JoVE.com

このプロジェクトは、ドイツ教育研究省(FKZ 82DZL004A1からM.A.M)とドイツ研究財団(SFB-TR84TP B08からM.A.Mへの助成金によって支援されました。この原稿に記載されている作業は、ドイツ肺研究センター(DZL)とEMBLハイデルベルクのM.G.の博士課程のフェローシップによって支援されました。J.シャターニー、S.ブッツ、H.シャイアーマンの専門家の技術支援に感謝します。

<ol>
	<li>Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase,+proteinase+3+and+cathepsin+G:+Physicochemical+properties,+activity+and+physiopathological+functions.">Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions.</a> Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).</li><li>Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granule+Protein+Processing+and+Regulated+Secretion+in+Neutrophils.">Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils.</a> Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).</li><li>Pham, C. T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+Specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Gehrig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+neutrophil+elastase+reduces+inflammation,+mucus+hypersecretion,+and+emphysema,+but+not+mucus+obstruction,+in+mice+with+cystic+fibrosislike+lung+disease.">Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).</li><li>McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+proteases+in+cystic+fibrosis+lung+disease+paradigms,+progress,+and+potential.">Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).</li><li>Clancy, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Neutrophil+Proteases+Are+Efficient+Regulators+of+IL-1,+IL-33,+and+IL-36+Cytokine+Activity+but+Poor+Effectors+of+Microbial+Killing.">Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing.</a> Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).</li><li>Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. 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A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-bound+elastase+and+cathepsin+G+on+human+neutrophils:+a+novel,+non-oxidative+mechanism+by+which+neutrophils+focus+and+preserve+catalytic+activity+of+serine+proteinases.">Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases.</a> The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).</li><li>Garland, M., Yim, J. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mouse+tumors+by+a+lipidated+cathepsin+S+substrate.">In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).</li><li>Korkmaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+elastase,+proteinase+3+and+cathepsin+G+activities+at+the+surface+of+human+neutrophils+with+fluorescence+resonance+energy+transfer+substrates.">Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates.</a> Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).</li><li>Craven, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-silent+FRET+Sensor+Enables+Live+Cell+Imaging+and+Flow+Cytometric+Stratification+of+Intracellular+Serine+Protease+Activity+in+Neutrophils.">Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).</li><li>Mu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+fret+reporter+for+the+real-time+visualization+of+cell-surface+proteolytic+enzyme+functions.">A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).</li><li>Hagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+rapid+and+dynamic+quantification+of+elastase+activity+on+sputum+neutrophils+from+patients+with+cystic+fibrosis+using+flow+cytometry.">New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry.</a> European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).</li><li>Dittrich, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+activity+on+sputum+neutrophils+correlates+with+severity+of+lung+disease+in+cystic+fibrosis.">Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).</li><li>Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+FRET+probe+visualizes+MMP12+activity+in+pulmonary+inflammation.">Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation.</a> Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).</li><li>Hu, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+and+other+fluorescent+proteinase+probes.">FRET-based and other fluorescent proteinase probes.</a> Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).</li><li>Trojanek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+obstruction+triggers+macrophage+activation+and+matrix+metalloproteinase+12-dependent+emphysema.">Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).</li><li>Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+matrix+metalloproteinase+12+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease.</a> Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).</li><li>Gaggar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease.</a> The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).</li><li>Guerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+FRET+Reporters+Targeting+Neutrophil+Extracellular+Traps.">Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).</li><li>Middleton, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor+for+Cystic+Fibrosis+with+a+Single+Phe508del+Allele.">Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele.</a> New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).</li></ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

報告されたプロトコルは、ヒト痰サンプル中の好中球エラスターゼおよびカテプシンGの活性を定量化するためのさまざまなアプローチを説明する。酵素活性測定を成功させるための重要なポイントは、i)正確なタイミングと術手順の標準化、ii)信頼性の高い陰性および陽性対照の使用である。これらの条件が満たされる場合、記載された方法は痰に限定されるものではなく、血液中のプロテアーゼ活性の分析に容易に適応することができるが、気管支肺胞洗浄液および組織切片または均質化物である。
3つの技術のそれぞれは、しばしば互いを補完する強みと限界を持っています。例えば、フローサイトメトリーは、希少細胞集団の迅速な分析と細胞表現型の迅速な分析を可能にするが、顕微鏡で達成できる空間分解能情報を欠いている。代わりに、プレートリーダーの測定により、ハイスループットの方法で複数のサンプルまたは条件の並列評価が可能になります。新しい喀痰細胞は凍結して保存できないため、3つの方法では、サンプルを出物後に迅速に処理する必要があります。これにより、膜結合活性測定の柔軟性またはスループットが制限されます。プローブの追加および酵素的切断後に細胞を固定することを可能にするフローサイトメトリープロトコルの開発は、より多くのチューブの並列測定に開かれるであろう。さらに、FRETプローブの取り扱いと保管には特に注意が必要です。実際、メチオニンなどのペプチド基質に存在するアミノ酸の中には、酸化を受け、レポーター感度の低下を招くものがあります。レポーターの保存期間(20°Cで約3ヶ月と推定される)を長くするために、窒素やアルゴンなどの不活性ガスの下で少量のアリコート(1-2 μL)に保存することができます。
CFおよび他の慢性炎症性肺疾患では、できるだけ早く炎症を検出することが重要であり、かつ信頼性の高いバイオマーカーは、そのような目標を達成する可能性を有する。周囲の組織に有害であることが示されている表面結合NSP活性を検出する可能性は、また、遊離NE活性がまったくない場合またはほとんどない条件においても、他の既存の方法4,11によってほとんど達成できない貴重な情報の別のレベルを追加する。
レポーターは、特に早期発症時に、肺疾患の重症度および進行に伴う膜結合関連NSP活性の関連を研究するために使用することができる。この方法は、治療効果(例えば、抗炎症治療または高効率CFTRモジュレーターおよび強力剤28)を監視し、好中球駆動炎症の結果として生じる湿気を調査するために利用することができる。さらに、プロトコルは患者のための非常に低い危険を運ぶ非侵襲的なサンプルプロシージャに基づいている、したがって、非常に広い規模で使用され、多数の刺激的な適用への扉を開くことができる。

好中球エラスターゼ(NE)、カテプシンG(CG)、プロテイン酵素3(PR3)および好中球セリンプロテアーゼ4(NSP4)は、4つの好中球セリンプロテアーゼ(NSP)1である。それらは、ミエロペルオキシダーゼと共に、好中球一次またはアズウロフィル顆粒内に保存される。その高いタンパク質分解性含有量のために、一次顆粒の分泌は厳しく調節され、好中球はプライミングおよび活性化刺激で順次挑戦されなければならない2。
食道内では、NPSは細胞内殺菌剤3として機能する。分泌されると、NSPは炎症の強力なメディエーターになる:彼らはサイトカインおよび表面受容体を切断し、平行な炎症促進経路を活性化する3。重要なことに、炎症性の状態は、制御されていないNSP分泌を特徴とする。例えば、炎症を起こした気道内では、過剰なNE活性が粘液過分泌を引き起こし、ゴブレット細胞は増殖し、CFTR不活性化および細胞外マトリックスリモデリング4、5。カテプシンGは炎症にも関与する:それは特異的にIL-1ファミリーの2つの成分、IL-36αおよびIL-36β6を切断し、活性化する。NEと協調して、CGは気道上皮上皮にプロテアーゼ活性化受容体を切断し、またTNF-αおよびIL-1βを活性化する。
α-1-アンチトリプシン、α-1-抗キトリプシンおよび分泌白血球プロテアーゼ阻害剤などの内因性抗プロテアーゼは、好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性5を調節する。しかし、肺疾患進行の過程で、プロテアーゼの連続分泌は、抗プロテアーゼシールドを量一に超え、気道における非解決性中球性、炎症悪化および組織損傷5,7を引き起こす。NE濃度および患者気道の可溶性分画における活性は、疾患の重症度8の有望なバイオマーカーであることが示されているが、NEおよびCGはまた、静電相互作用を介して好中球形質膜および細胞外DNAに関連付け、抗プロテアーゼにアクセスしにくくなる。重要なことに、前臨床試験では、細胞表面関連プロテアーゼ活性が、可溶性の対応する4、11とは独立して早期に出現するシナリオを定義した。実際、検出可能になるためには、まず遊離プロテアーゼ活性が抗プロテアーゼシールドを圧倒する必要があります。代わりに、細胞表面において、細胞結合プロテアーゼ活性は、細胞原形質膜12に対する大きな阻害剤のアクセス不能のために少なくとも部分的に無傷のままである。このような複雑なプロテアーゼ挙動は、好中球媒介性炎症の発症および伝播に重要な影響を及ぼすため、正確で有益なツールを用いて調査する必要がある。
長年にわたり、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのプローブは、ヒトサンプル13中の特定のプロテアーゼ活性を効率的かつ迅速に評価するツールとして、数多くの生物医学的応用を発見した。プロテアーゼレポーターは、標的酵素によって認識され、励起時にドナー蛍光機がアクセプター分子にエネルギーを伝達する物理的プロセスであるFRETに依存する認識モチーフ(すなわちペプチド)で構成される。レポーター上の酵素によって操作される処理、すなわち認識部の切断は、アクセクサがドナーから拡散する結果となる:酵素活性は、したがって、アクセクター蛍光に対するドナーの時間依存的変化として測定される。このような読み出しは自己正規化とレシオメトリックであり、したがって、pHおよび局所プローブ濃度などの環境条件によってわずかに影響を受けるだけです。NEmo-14およびsSAM15は、それぞれNEおよびCG活性について具体的に報告するFRETプローブである。しかし、そのようなレポーターは、細胞コンパートメントに特異的に局在化しないため、ヒトの流体中に存在するプロテアーゼ活性を監視するために用いられます。我々らは、空間的に局所的にプロテアーゼ活性をモニタリングするために、分子タグ14、15、16、17、18、19を介して細胞内成分に関連付けるFRETプローブを開発した。このような合成戦略は、NEmo-2とmSAM、原形質膜に局地する脂質アンカーを備えた2つのFRETプローブの開発を可能にしました。これらのレポーターは、嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患14,15におけるNEおよびCGプロテアーゼのより深い理解を促進した。
ここでは、FRETプローブのNEmoおよびSAMシリーズによるヒト痰における可溶性および膜結合NEおよびCG活動の可視化および定量化のための詳細なプロトコルが提供される。NsPs病態生理学の多様な側面に対処し、ユーザ固有のニーズに応じて使用できる様々な方法を提供するために、蛍光分光法、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーを用いた分析を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>10535253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD, viability dye</td>
			<td>Bio Legend</td>
			<td>420404</td>
			<td>5 &#181;L/100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>PR124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black flat bottom 96 well half area plate</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SG623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G Inhibitor I</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>219372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>EP5401000137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips advanced 1.0 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>0030 089 430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete proteinase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countig chambers improved Neubauer</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>40442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips &#216; 25mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MENZCB00250RA003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (nuclear stain)</td>
			<td>BioStatus Limited</td>
			<td>DR50050</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva software, v8.0.1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td>fiji.sc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo software, v10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoQ Plugin, v3-97</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Sputum Leucocyte Elastase</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SE563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rock-Shaker</td>
			<td>PEQLAB Biotechnologie GmbH</td>
			<td>MR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557742 Lot:8221983</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557820 Lot:8208791</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557833 Lot:8059688</td>
			<td>1:33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305122 Lot:B241921</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipette plus</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-1</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0200</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-2E</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0201</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer</td>
			<td>Pari</td>
			<td>085G3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histokitt (mounting medium)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td>
			<td>6638.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salbutamol</td>
			<td>Teva GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sivelestat</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>17779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputolysin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>560000-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples

プロテアーゼは無数の生理学的プロセスの調節因子であり、その活動の正確な調査は依然として興味深い生物医学的課題である。ヒトゲノムでコードされる600のプロテアーゼのうち、好中球セリンプロテアーゼ(NSP)は、呼吸器疾患を含む炎症性疾患の発症および進行に関与した場合に徹底的に調査されている。独自に、分泌されたNSPは、細胞外液内で拡散するだけでなく、細胞膜に局地化します。好中球外細胞外トラップ(NET)形成中に、NPSは分泌されたクロマチンの不可欠な部分となる。このような複雑な行動は、NsPsの病態生理学の理解を困難な作業にします。ここでは、精細なプロトコルが、痰サンプルにおける自由および膜結合性好中球エラスターゼ(NE)およびカテプシンG(CG)活動を可視化、定量、および識別することを示している。NEとCGは、嚢胞性線維症(CF)および慢性閉塞性肺疾患(COPD)の病因において多面的な役割を果たす活動を有するNSPである:彼らは組織のリモデリングを促進し、下流の免疫応答を調節し、肺疾患の重症度と相関する。このプロトコルは、流体と細胞分画を分離する方法と、低分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)レポーターを介した酵素活性定量のためのヒト痰からの好中球の分離方法を示しています。NEおよびCG活動の相対的な役割に関する特定の洞察を収集するために、FRET読み出しは異なる技術によって測定することができる:i) インビトロ プレートリーダー測定は、高スループットおよびプロテアーゼ活性のバルク検出を可能にする;ii) 共焦点顕微鏡は、細胞表面における膜結合活性を時間的に解決する。iii) 低分子FRETフローサイトメトリーにより、単細胞プロテアーゼ活性の定量および表現型による抗炎症治療の迅速な評価が可能になります。このような方法の実施は、NPS病理生物学とCFおよびCOPDの疾患重症度のバイオマーカーとしての可能性を探求する扉を開く。その標準化の可能性、堅牢な読み出し、転送のシンプルさを考えると、記載された技術は、研究および診断研究所全体での実装のためにすぐに共有可能です。

図 1aに示す結果は、代表的な顕微鏡データセットを示しています。核信号は、その特徴的なセグメント化された核によって好中球を同定するために使用される。対象領域 (ROI) は手動で選択します (図 1aの破線)。D/A比画像は、ドナーチャネルの強度をアクシピサチャネルの強度でピクセル単位で割って計算されます。最後のステップでは、セルあたりの平均D/A比(ROI)が計算されます。図1bでは各ドットは1つのROI(好中球)の平均を表す。1つの条件で約100個の細胞を画像化し、評価することをお勧めします。
代表的なフローサイトメトリー測定の測定方法を 図2aに示します。このような格子は、痰好中球を差別し、研究することができます。蛍光波波や補償アーティファクトを避けるために、FRETプローブ蛍光検出にレーザーライン(例えば、青色レーザー)を専用にすることをお勧めします。フローサイトメトリー蛍光補正は、FRETプローブではなく抗体に対して行われるべきである。 図2b は、レポーター追加後0分および10分でのMFI分布を示している。 図2c の各行は、1000個の痰好中球に対する平均ドナーおよびアクセプターMFI値を示す。D/A比は、ドナーとアクサクサのMFIを割って計算されます。右側の 図2c の時間経過は、測定の進行を示す:急速な初期増加の後、D/A比は、膜結合酵素の活性に応じて、高原に達する。

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Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

本明細書に記載されるプロトコルは、ヒト痰中の好中球プロテアーゼの活性を可視化し定量するためのガイドを提供する。このような分析の用途は、抗炎症治療の評価から、バイオマーカーの検証、薬物スクリーニングおよび大規模なコホート臨床研究まで及ぶ。

ヒト痰サンプルにおける好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

当社のFRETプローブとプロトコルは、好中球性気道疾患患者からの痰における自由で表面結合したエラスターゼおよびカテスピンG活性の迅速かつ敏感な定量化を可能にします。これらの方法は、プロテアーゼ病態生理の異なる側面を探索することを可能にする。プレートリーダー測定は、大規模なスクリーニングを可能にします。共焦点顕微鏡は、細胞内の溶液を用いた酵素活性を可視化します。細胞間測定を流しながら、単一細胞表現型およびプロテアーゼ活性の定量をパーソナライズされた方法で可能にします。この技術は、嚢胞性線維症、気管支拡張症またはCOPDなどの異なる気道疾患に拡大することができる。血液や気管支アルベオララバスやマウスのサンプルなど、異なるバイオサンプルに適応することができます。痰誘導手順を開始する前に、200マイクログラムのβ2受容体拮抗薬サルブタモールを吸い込む。その後、ネブライザーを用いて15分間、高トニック6%生理液を吸入する。ペトリ皿に期待された痰を収集します。粘液の塊を唾液からペトリ皿に分け、ピペットチップの助けを借りて。粘液の重量を量り、その後、10%スプトリシンとPBSの重量当たり4つの容積部品を痰に加える。ロッキングシェーカーの室温で15分間インキュベートし、粘液を溶解します。10%スプートリシンのミリリットルごとに冷たいPBSを1ミリリットル加えて反応を焼き付ける。混合物をピペット化し、均一溶液を得た。100ミクロンのナイロンセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに混合物をフィルターします。濾過ステップを40ミクロンのストレーナーを通して繰り返し、その後、摂氏4度で300倍Gで10分間遠心分離機を繰り返します。上清を新鮮なチューブに移し、氷の上に保管します。冷たいPBSの500マイクロリットルで細胞ペレットを静かに再懸濁し、氷の上に置きます。氷上で酵素を解凍し、テキスト原稿に記載されているように酵素標準曲線を設定します。標準的な調製物と並行して、活性化緩衝液中の痰サンプルを希釈する。プレートリーダーでは、NE FRETプローブNEmo-1の励起波長を354ナノメートル、発光波長をドナー用400ナノメートル、アクセプター用490ナノメートルに設定します。CG FRETプローブsSamの場合、励起波長を405ナノメートル、放出をドナー用485ナノメートル、アクセクサ用580ナノメートルに設定しました。黒96ウェルハーフエリアプレートのウェルにサンプル、標準、またはブランクの40マイクロリットルを追加し、マスターミックスを追加します。プレートリーダーを起動し、少なくとも20分間、または信号の増加がプラトーに達するまで、60〜90秒ごとに、または受け入れ率の増加をドナーに記録します。データをエクスポートし、各時点およびサンプルのアクソクターRFUでドナーRFUを割ることによってドナーとアクソパチベーター比を計算する。次に、ドナーから受け入れ者の比率平均と標準偏差を計算します。ドナーの直線的成長の中で、アクテクザクター比の変化に対する傾きを決定する。各測定に対して、1.5ミリリットルチューブ内のPBSの50マイクロリットルの体積に30,000個の痰細胞を再懸濁します。陰性対照として特定の阻害剤を用いて喀痰細胞をインキュベートし、室温で10分間陽性対照として適当な酵素を用いる。FRETレポーターと核染色を含むPBSを50マイクロリットルずつ各チューブに加え、2マイクロモルの最終濃度を得ます。混合物を室温で10〜20分間インキュベートする。100マイクロリットルの氷冷PBSを加えて反応を焼き付け、サンプルを氷の上に置きます。顕微鏡スライド上の混合物を細胞回転させる。その後、空気乾燥し、10分間冷たい10%メタノールで細胞を固定します。固定後、空気乾燥し、適切な取り付け媒体でサンプルを取り付けます。共焦点顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。決定的な統計を得るための、1 つの条件につき少なくとも 100 個のセルを画像化します。5ミリリットルのFACSポリスチレン丸底管にPBSの100マイクロリットルで100万個の細胞を再懸濁し、氷の上にチューブを置きます。各サンプルに2マイクロリットルのFCブロックを加えます。その後、室温で5分間サンプルをインキュベートします。各チューブに抗体を加え、暗闇の中で氷の上で30分間インキュベートします。冷たいPBSと遠心分離機の2ミリリットルで細胞を300倍Gと摂氏4度で洗います。最後に、PBSの200マイクロリットルで再中断します。懸濁液を2つのチューブ、それぞれ100マイクロリットルに分割し、5マイクロリットルの細胞生存性染色を加えます。陰性対照管に適切な特定のNSP阻害剤を加え、暗い温度で10分間サンプルをインキュベートする。PBSをサンプルに加え、40ミクロンのフィルターを通してきれいなFACSチューブにフィルターします。ネガティブコントロールサンプルにレポーターを加え、穏やかに渦を出します。この特定の阻害剤とインキュベート細胞を取得し、必要に応じて、わずかにゲートだけでなく、レポーターのPMTs電圧を調整します。ドナーの変化を記録して膜結合プロテアーゼ活性による比率を受け入れ、各チューブから5~10分ごとに1000個の好中球を記録する。ゲートされた生存性単一好中球で測定されたサンプルのアクセプタチャネル値でドナーを割ってFRET比を計算します。100ミクロモルシビレスタットで事前にインキュベートされた好中球の画像、またはレポーターNEmo-2の追加前に未処理のままにした画像がここに示されています。核信号は、その特性セグメント化された核によって好中球を同定するために使用され、ROIを手動で選択した。痰好中球の比率を受け入れるドナーをプロットした。各ドットは、1 つの ROI の平均を表します。フローサイトメトリーの測定は、痰好中球を判別し、研究することを可能にする。レポーター添加後、0分および10分でMFI分布が観察された。1000個の痰好中球に対する平均ドナーおよびアクセプターMFI値を計算した。D/A比は、最初の増加後に高原に達した。健康なドナー痰誘導は完璧の前にいくつかの練習を取る。リラックスして、エゾルゾルを10〜15分間呼吸することを忘れないでください。また、常に喀痰細胞を氷の上に置いて、出物の後、できるだけ早く処理します。表面結合プロテアーゼ活性は、小児の早期肺損傷および成人CF患者における肺疾患の重症度と相関することを発見した。したがって、これらの方法は、好中球性気道疾患における初期炎症バイオマーカーとしてのプロテアーゼの探索を可能にする。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

通常記憶 B 細胞の長命の形質細胞への分化モデル

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

生体試料中のキチナセ活性の測定

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...