Name: monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples
Uploaded: 2021-05-21T14:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples at JoVE.com

Bu proje, Alman Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (FKZ 82DZL004A1'den M.A.A.M'a) ve Alman Araştırma Vakfı'ndan (SFB-TR84TP B08'den M.A.M'ye) verilen hibelerle desteklenmiştir. Bu yazıda açıklanan çalışmalar Alman Akciğer Araştırmaları Merkezi (DZL) ve EMBL Heidelberg tarafından M.G. için doktora bursu ile desteklenmiştir. J. Schatterny, S. Butz ve H. Scheuermann'a uzman teknik yardımları için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase,+proteinase+3+and+cathepsin+G:+Physicochemical+properties,+activity+and+physiopathological+functions.">Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions.</a> Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).</li><li>Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granule+Protein+Processing+and+Regulated+Secretion+in+Neutrophils.">Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils.</a> Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).</li><li>Pham, C. T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+Specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Gehrig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+neutrophil+elastase+reduces+inflammation,+mucus+hypersecretion,+and+emphysema,+but+not+mucus+obstruction,+in+mice+with+cystic+fibrosislike+lung+disease.">Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).</li><li>McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+proteases+in+cystic+fibrosis+lung+disease+paradigms,+progress,+and+potential.">Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).</li><li>Clancy, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Neutrophil+Proteases+Are+Efficient+Regulators+of+IL-1,+IL-33,+and+IL-36+Cytokine+Activity+but+Poor+Effectors+of+Microbial+Killing.">Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing.</a> Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).</li><li>Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adaptations+upon+recruitment+to+the+lung:+New+concepts+and+implications+for+homeostasis+and+disease.">Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).</li><li>Sly, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+Factors+for+Bronchiectasis+in+Children+with+Cystic+Fibrosis.">Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).</li><li>Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-bound+elastase+and+cathepsin+G+on+human+neutrophils:+A+novel,+non-oxidative+mechanism+by+which+neutrophils+focus+and+preserve+catalytic+activity+of+serine+proteinases.">Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases.</a> Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Margaroli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+Exocytosis+by+Airway+Neutrophils+Associates+with+Early+Lung+Damage+in+Cystic+Fibrosis+Children.">Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).</li><li>Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-bound+elastase+and+cathepsin+G+on+human+neutrophils:+a+novel,+non-oxidative+mechanism+by+which+neutrophils+focus+and+preserve+catalytic+activity+of+serine+proteinases.">Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases.</a> The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).</li><li>Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bright+Future+for+Precision+Medicine:+Advances+in+Fluorescent+Chemical+Probe+Design+and+Their+Clinical+Application.">A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application.</a> Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).</li><li>Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+monitoring+of+neutrophil+elastase+activity+with+ratiometric+fluorescent+reporters.">Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).</li><li>Guerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+G+Activity+as+a+New+Marker+for+Detecting+Airway+Inflammation+by+Microscopy+and+Flow+Cytometry.">Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry.</a> ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).</li><li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mouse+tumors+by+a+lipidated+cathepsin+S+substrate.">In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).</li><li>Korkmaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+elastase,+proteinase+3+and+cathepsin+G+activities+at+the+surface+of+human+neutrophils+with+fluorescence+resonance+energy+transfer+substrates.">Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates.</a> Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).</li><li>Craven, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-silent+FRET+Sensor+Enables+Live+Cell+Imaging+and+Flow+Cytometric+Stratification+of+Intracellular+Serine+Protease+Activity+in+Neutrophils.">Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).</li><li>Mu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+fret+reporter+for+the+real-time+visualization+of+cell-surface+proteolytic+enzyme+functions.">A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).</li><li>Hagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+rapid+and+dynamic+quantification+of+elastase+activity+on+sputum+neutrophils+from+patients+with+cystic+fibrosis+using+flow+cytometry.">New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry.</a> European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).</li><li>Dittrich, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+activity+on+sputum+neutrophils+correlates+with+severity+of+lung+disease+in+cystic+fibrosis.">Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).</li><li>Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+FRET+probe+visualizes+MMP12+activity+in+pulmonary+inflammation.">Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation.</a> Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).</li><li>Hu, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+and+other+fluorescent+proteinase+probes.">FRET-based and other fluorescent proteinase probes.</a> Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).</li><li>Trojanek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+obstruction+triggers+macrophage+activation+and+matrix+metalloproteinase+12-dependent+emphysema.">Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).</li><li>Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+matrix+metalloproteinase+12+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease.</a> Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).</li><li>Gaggar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease.</a> The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).</li><li>Guerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+FRET+Reporters+Targeting+Neutrophil+Extracellular+Traps.">Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).</li><li>Middleton, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor+for+Cystic+Fibrosis+with+a+Single+Phe508del+Allele.">Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele.</a> New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bildirilen protokoller, insan balgam örneklerinde nötrofil elastaz ve katepsin G'nin aktivitesini ölçmek için farklı yaklaşımları açıklamamaktadır. Başarılı bir enzim aktivitesi ölçümü için kritik noktalar i) operatif prosedürün hassas zamanlaması ve standardizasyonu ve ii) güvenilir negatif ve pozitif kontrollerin kullanılmasıdır. Bu durumlar karşılanırsa, açıklanan yöntemler balgamla sınırlı değildir, aynı zamanda kan, bronkoalveoler lavaj sıvıları ve doku bölümleri veya homojenatlardaki proteaz aktivitesinin analizine kolayca uyarlanabilir.
Üç tekniğin her birinin, genellikle birbirini tamamlayan güçlü ve sınırlamaları vardır. Örneğin, akış sitometrisi nadir hücre popülasyonlarının yanı sıra hücre fenotiplemenin hızlı analizini sağlar, ancak mikroskopi ile elde edilebilen mekansal çözünürlük bilgilerinden yoksundur. Bunun yerine, plaka okuyucu ölçümleri, çeşitli örneklerin veya koşulların yüksek verimli bir şekilde paralel olarak değerlendirilmesine izin sağlar. Taze balgam hücreleri dondurulamadığından ve depolanamadığından, üç yöntem numunelerin balgam sürücüden sonra hızlı bir şekilde işlenmesini gerektirir. Bu, membranla ilişkili aktivite ölçümlerinin esnekliğini veya verimini sınırlar. Prob ilavesi ve enzimatik bölünmeden sonra hücrelerin sabitlenebilen bir akış sitometri protokolünün geliştirilmesi, daha yüksek sayıda tüpün paralel ölçümüne açılacaktır. Ayrıca, FRET problarının taşınmasına ve depolanmasına özellikle dikkat edilmelidir. Aslında, peptit substratında bulunan metiyonin gibi bazı aminoasitler oksidasyona uğrar ve bu da muhabir duyarlılığının azalmasına neden olan bir oksidasyona uğrar. Muhabirin raf ömrünü artırmak için (20 °C'de yaklaşık üç ay olduğu tahmin edilir), Azot veya Argon gibi inert gaz altında küçük hacimli aliquotlarda (1-2 μL) saklanabilirler.
CF ve diğer kronik inflamatuar akciğer hastalıklarında iltihabı mümkün olduğunca erken tespit etmek önemlidir ve güvenilir biyobelirteçler böyle bir hedefe ulaşma potansiyeline sahiptir. Çevredeki doku için zararlı olduğu gösterilen yüzeye bağlı NSP aktivitesini, ayrıca serbest NE aktivitesi olmadığı veya az olduğu durumlarda tespit etme imkanı, mevcut diğeryöntemlerleneredeyse hiç elde edilebilen başka bir değerli bilgi seviyesi ekler 4,11.
Muhabirler, membranla ilişkili NSP aktivitesinin akciğer hastalığının şiddeti ve ilerlemesi ile olan bağlantısını incelemek için kullanılabilir, özellikle erken başlangıcında. Yöntemler, tedavi etkinliğini izlemek (örneğin, antienflamatuar tedaviler veya son derece etkili CFTR modülatörleri ve potentiatörleri28)izlemek ve nötrofil güdümlü iltihabın ortaya çıkan sönümlenliğini araştırmak için kullanılabilir. Ek olarak, protokoller hasta için çok düşük risk taşıyan ve bu nedenle çok geniş ölçekte kullanılabilen ve çok sayıda heyecan verici uygulamaya kapı açabilen non-invaziv örnek prosedürlere dayanmaktadır.

Nötrofil elastaz (NE), katepsin G (CG), proteinaz 3 (PR3) ve nötrofil serine proteaz 4 (NSP4) dört nötrofil serin proteaz (NSP)1'dir. Miyeoperoksidaz ile birlikte nötrofil birincil veya azurofilik granüller içinde saklanırlar. Yüksek proteolitik içerikleri nedeniyle, birincil granüllerin salgılanması sıkı bir şekilde düzenlenir ve nötrofiller astarlama ve aktifleştirme uyaranları ile ardışık olarak zorlanması gerekir2.
Fagolysozomun içinde, NSP'ler hücre içi bakterisidal ajanlar olarak işlev görür3. Salgılandığında, NSP'ler iltihabın güçlü arabulucuları haline gelir: sitokinleri ve yüzey reseptörlerini ayırırlar, paralel pro-enflamatuar yolları aktive ederler3. Daha da önemlisi, enflamatuar durumlar kontrolsüz bir NSPs salgılanmasına sahiptir. Örneğin, iltihaplı hava yollarında, aşırı NE aktivitesi mukus hipersecretion, kadeh hücreleri metaplazi, CFTR inaktivasyonu ve hücre dışı matris remodeling4,5neden olur. Cathepsin G de inflamasyona katılır: özellikle IL-1 ailesinin iki bileşenini, IL-36α ve IL-36β6'yıayırır ve aktive eder. NE ile birlikte, CG hava yolu epitelinde proteaz ile aktive reseptörleri ayırır ve ayrıca TNF-α ve IL-1β'yi aktive eder.
Alfa-1-antitripsin, alfa-1-antikimyatripsin ve salgı lökosit proteaz inhibitörü gibi endojen anti-proteazlar nötrofil elastaz ve katepsin G aktivitesini düzenler5. Bununla birlikte, akciğer hastalığının ilerlemesi sırasında, proteazların sürekli salgılanması stoichiometrik olarak anti-proteaz kalkanını aşar, hava yollarında çözülmeyen nötrofilere, iltihaplanmanın kötüyelmesine ve doku hasarına yol açar5,7. Hasta hava yollarının çözünür fraksiyonlarında NE konsantrasyonu ve aktivitesinin hastalıkşiddetininumut verici bir biyobelirteci olduğu gösterilmiş olsa da 8 , NE ve CG ayrıca nötrofil plazma zarı ve anti-proteazlar için daha az erişilebilir hale geldikleri elektrostatik etkileşimler9,10 yoluyla hücre dışı DNA ile ilişkilidir. Daha da önemlisi, preklinik çalışmalar hücre yüzeyi ile ilişkili proteaz aktivitesinin çözünür muadili4,11'dendaha erken ve/veya bağımsız olarak göründüğü bir senaryo tanımlamıştır. Aslında, tespit edilebilir hale gelmek için, serbest proteaz aktivitesinin önce anti-proteaz kalkanını bastırması gerekir. Bunun yerine, hücre yüzeyinde, membran bağlı proteaz aktivitesi, büyük inhibitörlerin hücre plazma membranına erişilmemesi nedeniyle en azından kısmen bozulmadan kalır12. Bu tür karmaşık proteaz davranışı nötrofil aracılı inflamasyon başlangıcı ve yayılması üzerinde önemli sonuçlar doğurur ve bu nedenle hassas ve bilgilendirici araçlarla araştırılması gerekir.
Yıllar içinde, Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı problar, insan örneklerinde belirli bir proteaz aktivitesini verimli ve hızlı bir şekilde değerlendiren araçlar olarak çok sayıda biyomedikal uygulama buldu13. Proteaz muhabirleri, hedef enzim tarafından tanınan ve bir donör floroforunun enerjiyi bir alıcı moleküle aktardığı fiziksel bir süreç olan FRET'e dayanan bir tanıma motifi (yani bir peptit) oluşur. Enzim tarafından muhabir üzerinde, yani tanıma kısmının bölünmesiyle 2015 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 2018 yılında 20 Bu tür bir okuma kendi kendini normalleştirir ve oranmetriktir, bu nedenle pH ve yerel prob konsantrasyonu gibi çevresel koşullardan sadece marjinal olarak etkilenir. NEmo-114 ve sSAM15, sırasıyla özellikle NE ve CG aktivitesi hakkında rapor veren FRET problarıdır. Bununla birlikte, bu tür muhabirler özellikle herhangi bir hücresel bölmeye yerleşmiyor, bu nedenle insan sıvılarında bulunan proteaz aktivitesini izlemek için kullanılırlar. Proteaz aktivitesini mekansal olarak lokalize bir şekilde izlemek için, biz ve diğerleri moleküler etiketler 14 , 15 , 16 ,17,18,19aracılığıyla hücre altı bileşenlerle ilişkilendiren FRET probları geliştirdik. Böyle sentetik bir strateji, plazma zarını lokalize eden lipid ankrajları ile donatılmış iki FRET probu olan NEmo-2 ve mSAM'ın geliştirilmesine izin verdi. Bu muhabirler kistik fibrozis ve kronik obstrüktif akciğer hastalıklarında NE ve CG proteazlarının daha derin bir şekilde anlaşılmasına neden oldu14,15.
Burada, NEmo ve SAM serisi FRET probları ile insan balgamında çözünür ve membran bağlı NE ve CG faaliyetlerinin görselleştirilmesi ve ölçülmesi için ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır. NSP patofizyolojisinin çeşitli yönlerini ele almak ve kullanıcıya özgü ihtiyaca göre sunulabilecek bir dizi yöntem sağlamak için floresan spektroskopi, floresan mikroskopi ve akış sitometrisi ile yapılan analizler gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>10535253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD, viability dye</td>
			<td>Bio Legend</td>
			<td>420404</td>
			<td>5 &#181;L/100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>PR124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black flat bottom 96 well half area plate</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SG623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G Inhibitor I</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>219372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>EP5401000137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips advanced 1.0 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>0030 089 430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete proteinase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countig chambers improved Neubauer</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>40442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips &#216; 25mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MENZCB00250RA003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (nuclear stain)</td>
			<td>BioStatus Limited</td>
			<td>DR50050</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva software, v8.0.1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td>fiji.sc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo software, v10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoQ Plugin, v3-97</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Sputum Leucocyte Elastase</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SE563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rock-Shaker</td>
			<td>PEQLAB Biotechnologie GmbH</td>
			<td>MR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557742 Lot:8221983</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557820 Lot:8208791</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557833 Lot:8059688</td>
			<td>1:33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305122 Lot:B241921</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipette plus</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-1</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0200</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-2E</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0201</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer</td>
			<td>Pari</td>
			<td>085G3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histokitt (mounting medium)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td>
			<td>6638.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salbutamol</td>
			<td>Teva GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sivelestat</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>17779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputolysin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>560000-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples

Proteazlar sayısız fizyolojik işlemin düzenleyicileridir ve faaliyetlerinin hassas bir şekilde araştırılması ilgi çekici bir biyomedikal zorluk olmaya devam etmektedir. İnsan genomu tarafından kodlanan ~600 proteaz arasında, nötrofil serine proteazlar (NSP' ler) solunum yolu hastalıkları da dahil olmak üzere enflamatuar durumların başlangıcında ve ilerlemesinde rol oynadıkları için kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır. Benzersiz olarak, salgılanan NSP'ler sadece hücre dışı sıvılar içinde yayılmakla kalmaz, aynı zamanda plazma membranlarına lokalize olur. Nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumu sırasında, NSP'ler salgılanan kromatin ayrılmaz bir parçası haline gelir. Bu tür karmaşık davranışlar, NSP patofizyolojisinin anlaşılmasını zorlu bir görev haline getirir. Burada, balgam örneklerinde serbest ve zara bağlı nötrofil elastaz (NE) ve katepsin G (CG) aktivitelerini görselleştirmek, ölçmek ve ayırt etmek için ayrıntılı protokoller gösterilmiştir. NE ve CG, kistik fibrozis (CF) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığının (KOAH) patogenezinde pleiotropik rollere sahip olan NSP'lerdir: doku remodelingini teşvik ederler, aşağı akış immün yanıtlarını düzenlerler ve akciğer hastalığı şiddeti ile ilişkilidirler. Protokoller, sıvı ve hücresel fraksiyonun nasıl ayrıştırılacağının yanı sıra küçük moleküllü Förster rezonans enerji transfer tabanlı (FRET) muhabirler aracılığıyla enzimmatik aktivite nicelemesi için nötrofillerin insan balgamından izole edilmesini göstermektedir. NE ve CG faaliyetlerinin göreceli rolü hakkında özel içgörüler toplamak için, bir FRET okuması farklı teknolojilerle ölçülebilir: i) in vitro plaka okuyucu ölçümleri, proteaz aktivitesinin yüksek verim ve toplu olarak algılanmasına izin verir; ii) konfokal mikroskopi mekanotemporal olarak hücre yüzeyindeki membranla ilişkili aktiviteyi çözen; iii) küçük moleküllü FRET akış sitometrisi, tek hücreli proteaz aktivitesi nicelemesi ve fenotipleme yoluyla antienflamatuar tedavilerin hızlı değerlendirilmesini sağlar. Bu tür yöntemlerin uygulanması, NSP patolojisini ve CF ve KOAH için hastalık şiddetinin biyobelirteçleri olarak potansiyellerini keşfetmenin kapılarını açar. Standardizasyon potansiyelleri, sağlam okumaları ve aktarım basitlikleri göz önüne alındığında, açıklanan teknikler araştırma ve tanı laboratuvarlarında uygulanmak üzere hemen paylaşılabilir.

Şekil 1a'da gösterilen sonuçlar temsili bir mikroskopi veri kümesini göstermektedir. Nükleer sinyal nötrofilleri karakteristik parçalı çekirdekleriyle tanımlamak için kullanılır. İlgi alanı (ROI) el ile seçilir (Şekil 1a'dakesikli çizgi). D/A oranı görüntüsü, donör kanalın yoğunluklarının, alıcı kanalın yoğunluklarına piksel bazında bölünmesiyle hesaplanır. Son adımda, hücre başına ortalama D/A oranı (YATıRıM GETIRIsi) hesaplanır. Şekil 1b'de her nokta bir yatırım getirisinin (nötrofil) ortalamasını temsil eder. Durum başına yaklaşık 100 hücrenin görüntülenerek değerlendirilmesi önerilir.
Şekil 2a'datemsili bir akış sitometrisi gating stratejisi gösterilmiştir. Bu tür gating, balgam nötrofillerini ayırt etmeye ve incelemeye izin verir. Floresan dökülmesini veya kompanzasyon yapıtlarını önlemek için, FRET probu floresan tespitine bir lazer hattı (örneğin, mavi lazer) ithaf edilmesi önerilir. Akış sitometrisi floresan kompanzasyonu FRET probu için değil antikorlar için yapılmalıdır. Şekil 2b, muhabir eklemeden sonra 0 ve 10 dakika olan MFI dağılımını tasvir eder. Şekil 2c'deki her satır, 1000 balgam nötrofil için ortalama donör ve kabul eden MFI değerlerini gösterir. D/A oranı, donör ve kabul eden MMI'ler bölünerek hesaplanır. Sağ taraftaki Şekil 2c'deki zaman seyri ölçümün ilerlemesini gösterir: hızlı bir başlangıç artışından sonra, membranla ilişkili enzimin aktivitesine göre D/ A oranı bir platoya ulaşır.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples at JoVE.com

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Burada açıklanan protokoller, nötrofil proteazların insan balgamındaki aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için bir kılavuz sağlar. Bu tür analizlerin uygulamaları anti-enflamatuar tedavilerin değerlendirilmesinden biyobelirteç doğrulamasına, ilaç taramasına ve büyük kohort klinik çalışmalarına kadar yayılmaktadır.

İnsan Balgam Örneklerinde Nötrofil Elastase ve Katepsin G Aktivitesinin İzlenmesi

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

FRET probumuz ve protokollerimiz, nötrofilik hava yolu hastalıkları olan hastalardan balgamda serbest ve yüzeye bağlı elastaz ve katespin G aktivitesinin hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu yöntemler, proteaz patofizyolojisinin farklı yönlerini keşfetmeyi mümkün kınıyor. Plaka okuyucu ölçümleri büyük taramalar için izin alır.Konfokal mikroskopi, hücre altı çözelti ile enzim aktivitesini görselleştirir. Akış sitometrisi iken, kişiselleştirilmiş bir şekilde tek hücreli fenotipleme ve proteaz aktivitesi nicelemesini sağlar. Bu teknik kistik fibrozis, bronşektazi veya KOAH gibi farklı hava yolu hastalıklarına genişletilebilir.Ve kan veya bronş alveola lavaş veya fare örnekleri gibi farklı BioSamples uyarlanabilir. Balgam indüksiyon prosedürüne başlamadan önce, beta 2 reseptör antagonistlerinin 200 mikrogramını salbutamol içine alın. Daha sonra, bir nebülizör kullanarak 15 dakika boyunca hipertonik% 6 salin çözeltisini solu.Balgam salımını petri kabında toplayın. Mukus kümelerini tükürüğe bir pipet ucu yardımıyla bir Petri kabına ayırın. Mukusu tartın, ardından balgama% 10 Sputolysin ve PBS ağırlığı başına dört hacimli parça ekleyin.Mukusu çözmek için karışımı oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika kuluçkaya bırakın. %10 Sputolysin'in her mililitresi için bir mililitre soğuk PBS ekleyerek reaksiyonun söndürünün. Homojen bir çözelti elde etmek için karışımı pipetleyin.Karışımı 100 mikron naylon hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Filtrasyon adımını 40 mikronluk bir süzgeçten tekrarlayın, ardından dört santigrat derecede 300 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatant'ı taze bir tüpe aktarın ve buzda saklayın.Hücre peletini 500 mikrolitre soğuk PBS'de hafifçe yeniden depolayın ve buza yerleştirin. Buz üzerindeki enzimleri çözün ve metin el yazmasında açıklandığı gibi bir enzim standart eğrisi ayarlayın. Standart preparasyona paralel olarak, balgam örneklerini aktivasyon tamponunda seyreltin.Plaka okuyucuda, NE FRET probu NEmo-1 için heyecan dalga boyunu 354 nanometreye ve emisyon dalga boyunu donör için 400 nanometreye ve kabul eden için 490 nanometreye ayarlayın. CG FRET probu için sSam, ekscitasyon dalga boyunu 405 nanometreye ve emisyonu donör için 485 nanometreye ve kabul eden için 580 nanometreye ayarlayın. Siyah 96 kuyu yarım alan plakasının kuyularına 40 mikrolitre numune, standart veya boşluk ekleyin ve ana karışımı ekleyin.Plaka okuyucuyu başlatın ve en az 20 dakika boyunca her 60 ila 90 saniyede bir veya sinyaldeki artış bir platoya ulaşana kadar bağışçıyı kabul eden oran artışına kaydedin. Verileri dışa aktarın ve donör RFU'yu her zaman noktası ve örnek için alıcı RFU'ya bölerek bağışçıyı alıcı oranına hesaplayın. Daha sonra bağışçıyı alıcı oranı ortalamasına ve standart sapmaya hesaplayın.Donörün doğrusal büyümesi içindeki eğimi alıcı oranı değişikliğine belirleyin. Her ölçüm için, 1,5 mililitrelik bir tüpte 50 mikrolitre PBS hacminde 30.000 balgam hücresi yeniden biriktirin. Balgam hücrelerini negatif kontrol olarak belirli bir inhibitör ve oda sıcaklığında 10 dakika pozitif kontrol olarak uygun bir enzim ile kuluçkaya yatırın.2 mikromolar son konsantrasyon elde etmek için her tüpe FRET muhabiri ve bir nükleer leke içeren 50 mikrolitre PBS ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika kuluçkaya bırakın. 100 mikrolitre buz gibi PBS ekleyerek reaksiyonun söndür ve numuneleri buza yerleştirin.Karışımı mikroskopi slaytlarında cytospin. Daha sonra hava kurutun ve hücreleri 10 dakika boyunca buz gibi% 10 metanol ile sabitleyin. Sabitlemeden sonra, numuneyi uygun bir montaj ortamı ile kurutun ve monte edin.Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın. Kesin istatistikler için durum başına en az 100 hücreyi görüntüleyin. Beş mililitrelik FACS polistiren yuvarlak alt tüpte 100 mikrolitre PBS'de 1 milyon hücreyi yeniden biriktirin ve tüpü buza yerleştirin.Her örneğe iki mikrolitre FC bloğu ekleyin. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Her tüpe antikor ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.Hücreleri iki mililitre soğuk PBS ve santrifüj ile 300 kez G ve dört santigrat derecede yıkayın. Son olarak, 200 mikrolitre PBS'de yeniden dirildi. Süspansiyonu her biri 100 mikrolitre olmak üzere iki tüpe bölün ve beş mikrolitre hücre canlılık lekesi ekleyin.Negatif kontrol tüpüne uygun spesifik NSP inhibitörü ekleyin ve numuneyi karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın. Örneğe PBS ekleyin ve 40 mikron filtreden temiz bir FACS tüpüne filtreleyin. Muhabiri negatif kontrol örneğine ekleyin ve hafifçe girdaplayın.Bu özel inhibitörle inkübe edilmiş hücreleri edinmeye başlayın ve gerekirse, kapıları ve muhabir PMT voltajlarını hafifçe ayarlayın. Membran bağlı proteaz aktivitesi nedeniyle bir oranı kabul etmek için donördeki değişiklikleri kaydetmek için, her tüpten her beş ila 10 dakikada bir 1000 nötrofil kaydedin. FRET oranını, donörün kapılı uygulanabilir tek nötrofiller üzerinde ölçülen numuneler için alıcı kanal değerlerine bölerek hesaplayın.Nötrofillerin 100 mikromolar Sivilestat ile önceden inkübe edilmiş veya muhabir NEmo-2 ilavesinden önce tedavi edilmeden bırakılan görüntüleri burada gösterilmiştir. Nükleer sinyal nötrofilleri karakteristiklerine göre tanımlamak için kullanıldı çekirdekler ve yatırım getirisi manuel olarak seçildi. Balgam nötrofil oranını kabul eden donör çizildi.Her nokta bir yatırım getirisinin ortalamasını temsil eder. Akış sitometrisi gating, balgam nötrofillerini ayırt etmeyi ve incelemeyi mümkün kılar. MFI dağılımı sıfır ve 10 dakika olarak muhabir ilavesi sonrasında gözlendi.1000 balgam nötrofil için ortalama donör ve kabul eden MFI değerleri hesaplandı. D/A oranı ilk artıştan sonra bir platoya ulaştı. Sağlıklı donör balgam indüksiyonu mükemmellik öncesi biraz pratik gerektirir.Balgam sekenden önce rahatlamayı ve aerosolü 10 ila 15 dakika solumeyi unutmayın. Ek olarak, balgam hücrelerini her zaman buz üzerinde tutar ve balgam sürücüden sonra mümkün olan en kısa sürede işler. Yüzeye bağlı proteaz aktivitesinin çocuklarda erken akciğer hasarı ve erişkin CF hastalarında akciğer hastalığının şiddeti ile ilişkili olduğunu bulduk.Bu nedenle, bu yöntemler birlikte nötrofilik hava yolu hastalıklarında erken inflamasyon biyobelirteçleri olarak proteazların araştırılmasını sağlar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Uzun ömürlü plazma hücreleri insan Normal bellek B hücrelerine vitro farklılaştırma modelinde

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...