Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح المعاهد القومية للصحة (R01 EY024710، RO1 AI139768، وRO1 EY029426) إلى D.S. A.A. بدعم من منحة F30EY025981 من المعهد الوطني للعيون، المعاهد القومية للصحة. أجريت دراسة باستخدام القرنيات البورسينية التي تم الحصول عليها من شركة بارك للتعبئة، 4107 شارع آشلاند، نيو سيتي، شيكاغو، IL-60609

تم توفير جميع أنسجة البورسين المستخدمة في هذه الدراسة من قبل منظمة خاصة تابعة لطرف ثالث ولم يتم تنفيذ أي من التعامل مع الحيوانات من قبل موظفي جامعة إلينوي في شيكاغو.
1. المواد
<ol><li>
الكواشف
	<ol>
<li>استخدام الكواشف التالية لالقياس البلاك: مسحوق ميثيلسليلوز، دولبيكو ال...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

وقد أظهرت الأبحاث السابقة BX795 أن يكون لها دور واعد كعامل مضاد للفيروسات ضد عدوى HSV-1; عن طريق تثبيط كيناز تانك ملزمة 1 (TBK1)16. وقد لعبت كل من TBK1 وautphagy دورا في المساعدة على منع العدوى HSV-1 كما هو موضح على الخلايا الظهارية القرنية البشرية. وقد تبين BX795 لتكون فعالة إلى أقصى حد مع النشاط ا?...

الناس الذين يعانون من التهابات العين غالبا ما تتكبد فقدان البصر1. مع ارتفاع مستوى الانتشار المصلي في جميع أنحاء العالم، HSV المصابين الأفراد يعانون من التهابات العين المتكررة التي تؤدي إلى تندب القرنية، التهاب القرنية سترومال والأوعية الدموية الجديدة2،3،4،5. وقد أظهرت العدوى HSV أيضا أن يسبب أقل تواترا, مجموعة من الحالات الخطيرة بين المرضى الذين يعانون من نقص المناعة, غير المعالجة مثل التهاب الدماغ والمراضة الجهازية6,7,8. وقد أظهرت أدوية مثل Acyclovir (ACV) ونظائرها النيوكليوسيد نجاحا ثابتا في الحد من عدوى HSV-1 وحتى إعادة تنشيط السيطرة بعد الاستخدام المطول لهذه الأدوية يرتبط بالفشل الكلوي وتشوهات الجنين وعدم تقييد ظهور مقاومة الأدوية للسلالات الفيروسية المتطورة9و10و11و12و13. التعقيدات المرتبطة بالتهابات العين HSV-1، وقد درست سابقا في المختبر باستخدام monolayers والثقافات 3D من خلايا القرنية البشرية وفي الجسم الحي باستخدام عدوى عين مورين أو أرنب. في حين أن هذه النماذج في المختبر توفر بيانات هامة عن المكونات البيولوجية الخلوية للعدوى HSV-1، إلا أنها تفشل في محاكاة التعقيد المعقد للأنسجة القرنية ولا تفعل الكثير لإلقاء الضوء على الانتشار التشجري للفيروس14. في المقابل ، على الرغم من أن في أجهزة الجسم الحي هي أكثر الثاقبة في إظهار انتشار العدوى في القرنيات واستجابات التنشيط المناعي خلال عدوى HSV -1 ، فإنها تأتي مع التحذير من أنها تتطلب محققين مدربين ومرافق كبيرة لرعاية الحيوان للتغاضي عن التجارب.
هنا نستخدم القرنيات البورسينية كنموذج الجسم الحي السابق لفحص نظام الجرح الناجم عن العدوى HSV-1. يمكن دراسة كل من الصيدلة المحتملة لبعض الأدوية وكذلك الخلية والبيولوجيا الجزيئية لنظام الجروح الناجم عن العدوى من خلال ثقافات الأنسجة. ويمكن أيضا تعديل هذا النموذج لاستخدامها لالتهابات أخرى الفيروسية والبكتيرية كذلك. في هذه الدراسة، استخدمت القرنيات البورسينية لاختبار فعالية مضادة للفيروسات من جزيء صغير قبل السريرية، BX795. ويفضل استخدام القرنيات البورسينية بسبب سهولة الوصول وفعالية التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، نماذج القرنية porcine هي نماذج جيدة من عيون الإنسان مع القرنيات يجري من السهل عزل، الحجم الكافي للعدوى والتصور وقوية للتعامل مع15. القرنيات البورسينية هي أيضا مماثلة لتعقيد نماذج القرنية البشرية في كل من نفاذية القرنية عبر وامتصاص الجهازية15. باستخدام هذا النموذج للدراسة، تمكنا من توضيح كيف BX795 يستحق المزيد من التحقيق كمثبط المختصة من عدوى فيروس HSV-1 ويضيف إلى الأدب لتصنيفه كمركب مضاد للفيروسات جزيء صغير محتمل16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

يمكن أن تسبب الفيروسات والبكتيريا مجموعة متنوعة من عيوب سطح العين والانحطاط مثل الجروح والقرحة من خلال عدوى القرنية. مع وجود التآكل المصلي الذي يتراوح بين 60-90٪ في جميع أنحاء العالم، وفيروس الهربس البسيط نوع-1 (HSV-1) يسبب عادة الآفات المخاطية في المنطقة الأورو-الوجهية التي تظهر أيضا كآفات والعمى المرتبطة بالعدوى. في حين أن الأدوية المضادة للفيروسات الحالية فعالة ، فإن ظهور مقاومة واستمرار الآثار الجانبية السامة يتطلب تطوير مضادات للفيروسات جديدة ضد هذا الممرض في كل مكان. على الرغم من أن التقييم في المختبر يوفر بعض البيانات الوظيفية المتعلقة بمضادات الفيروسات الناشئة ، إلا أنها لا تثبت تعقيد الأنسجة العينية في الجسم الحي. ومع ذلك ، في دراسات الجسم الحي مكلفة وتتطلب موظفين مدربين ، خاصة عند العمل مع العوامل الفيروسية. وبالتالي نماذج الجسم الحي السابق هي خطوات فعالة ولكنها غير مكلفة للاختبار المضاد للفيروسات. هنا نناقش بروتوكول لدراسة العدوى عن طريق HSV-1 باستخدام القرنيات البرسينية ex vivo وطريقة لعلاجها موضعيا باستخدام الأدوية المضادة للفيروسات الموجودة والجديدة. كما أننا نثبت طريقة إجراء فحص البلاك باستخدام HSV-1. ويمكن استخدام الأساليب المفصلة لإجراء تجارب مماثلة لدراسة العدوى التي تشبه مسببات الأمراض HSV-1.

لفهم فعالية مضادات الفيروسات التجريبية ، يجب اختبارها على نطاق واسع قبل إرسالها للتجارب السريرية البشرية الحية. وفي هذا الصدد، يتعين تحديد مجموعات المراقبة الإيجابية والسيطرة السلبية والاختبار. وقد استخدمت منذ فترة طويلة Trifluorothymidine (TFT) كعلاج المفضل لعلاج التهاب القرنية الهربس موضعيا<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

نحن نصف استخدام قرنية البورسين لاختبار فعالية الأدوية التجريبية المضادة للفيروسات.

Porcine القرنية النسيج Explant لدراسة فعالية الهربس البسيط فيروس -1 مضادات الفيروسات

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

فهم فعالية الأدوية في النماذج الحيوانية هو التكلفة والعمالة الكثيفة. بروتوكولنا الذي يستخدم نموذج اكسبلانت الأنسجة الحية هو أقل بكثير سواء من حيث التكلفة والأفراد العلميين اللازمة لإجراء الدراسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام عيون البورسين ، والتي لها تشريح وعلم وظائف الأعضاء مشابهة جدا للعيون البشرية بدلا من بعض النماذج الحيوانية الصغيرة الأخرى.عندما نختبر الأدوية في المختبر، قد تظهر فعالية قد تكون غائبة في النماذج الحيوانية أو البشرية. نظم الأنسجة الحية السابقة هي أفضل طريقة لفهم ما إذا كان يمكن ترجمة أنظمتنا في المختبر إلى تجارب على الحيوانات والبشر. نظام القرنية porcine، على الرغم من أن أقل كثافة في اليد العاملة، يتطلب مهارات قابلة للتدريب لعزل وصيانة وتصيب وعلاج مع المخدرات، وخاصة عملية عزل القرنية من العين porcine كامل صعبة للتعبير في الكلمات، ولكن يتطلب مظاهرة بصرية.عند تلقي عيون porcine من بائع مناسب ، قم بتخزين الأنسجة على الجليد حتى المعالجة ووضع معدات الحماية الشخصية المناسبة. تطهير منطقة العمل مع 70٪ الإيثانول وتأمين غطاء مقاعد البدلاء على مساحة العمل. عندما تكون منطقة العمل جاهزة، ضع العينين على قطعة من الشاش 50 ملليمتر واستخدم الشاش لفهم القسم الخلفي بيد واحدة.باستخدام إبرة قياس 30، وجعل بعناية ثقب واحد في ما يقرب من مركز السطح الظهاري للعين، مع الحرص على عدم تلف ستروما، واستخدام شفرة معقمة حادة لجعل شق صغير على تصلب على مسافة ملليمتر واحد من القرنية. باستخدام عمل سريع وسلس الدورية من ناحية والحرص على أن الفكاهة الزجاجية لا تسرب، وقطع حافة القرنية وعقد القرنية على حافة القرنية- تصلب مع ملاقط مسطحة، واستخدام شفرة لقطع الأغشية الربط المتبقية. كما يتم عزل كل قرنية، ضع الأنسجة تواجه في الآبار الفردية من لوحة 12 بئرا تحتوي على اثنين من ملليلتر من القرنية المتوسطة لكل بئر وإضافة خمسة ميكرولتر من خمسة أضعاف 10 إلى وحدة تشكيل البلاك الخامسة من محلول فيروس GFP 17 إلى الموقع الحطام على كل سطح القرنية.عندما يتم جمع جميع القرنيات، ضع الطبق في درجة حرارة 37 درجة مئوية، وحاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 72 ساعة ورش أي عيون إضافية لم تستخدم في التجربة مع تبييض 10٪ للتخلص منها بشكل آمن في أكياس الخطر البيولوجي. كل يوم قبل إضافة الأدوية، ضع طبق القرنيات تحت مجهر ستيريو وحدد فلتر GFP ووقت التعرض 500 ميكروثانية. التقاط الصور في أدنى التكبير قبل تصوير القرنيات في سلسلة من التكبير المتزايد حتى يمكن تصور كل من انتشار الفيروسية وتشكيل التشعب بوضوح.عندما يتم تصوير جميع القرنيات، أعد الطبق إلى حاضنة زراعة الأنسجة. في اليوم السابق للعدوى، اغسل زراعة خلايا vero التقاء مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل، وعلاج الخلايا مع ملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين لكل بئر لمدة خمس إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية. عندما تكون الخلايا قد انفصلت، استخدم تسعة ملليلترات من الوسط الكامل لضمان إزاحة الخلايا تماما من سطح القارورة ونقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.إضافة 300 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من لوحة جديدة من ستة جيدا، تليها إضافة اثنين من ملليلتر من المتوسطة إلى كل بئر، ثم وضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، لجمع الفيروس من كل قرنية للقياس الكمي، نقع نصائح مسحة القطن العقيمة في 500 ميكرولتر من المتوسط الخالي من المصل لكل مسحة في أنابيب الطرد الدقيق متعددة في خزانة السلامة البيولوجية لمدة خمس دقائق على الأقل. في نهاية الحضانة، ضع بعناية ثقافات القرنية البرسينية المصابة في الخزانة.باستخدام مسحات القطن الرطب، وجعل ثلاث ثورات في اتجاه عقارب الساعة وثلاث ثورات عكس اتجاه عقارب الساعة خمسة ملليمترات من وسط كل قرنية porcine المصابة دون تطبيق الضغط المفرط. في نهاية سلسلة من الثورات، تدوير كل مسحة في المتوسط الخالي من المصل شغل أنبوب الطرد الدقيق في اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة خمس مرات قبل قطع مسحات بحيث تناسب نصائح داخل كل أنبوب مع غطاء مغلق. عندما يتم مسح جميع القرنيات ، دوامة الأنابيب بسرعة عالية لمدة دقيقة واحدة.لتحديد كمية الفيروس التي تم جمعها من كل قرنية، قم بإعداد تخفيف log10 مرة واحدة من الفيروس في المتوسط الخالي من المصل في أنابيب الطرد المركزي الدقيق حتى يتم الوصول إلى تخفيف مرة واحدة من 10 إلى ثمانية سالبة. بعد قرصنة متوسط النمو من كل بئر من الخلايا ، قم بنقل ملليلتر واحد من كل تخفيف فيروس بدءا من مرة واحدة 10 إلى ثلاثة سالبة إلى أحاديات الخلية المطلية ووضع الخلايا المصابة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر بلطف مرتين مع PBS قبل إضافة ملليلترين من وسيطة محملة بالميثيلسليلوز إلى كل بئر لاحتضان لمدة 72 ساعة أو حتى يمكن ملاحظة تكوين لويحات.عند مراقبة البلاك، أضف ببطء ملليلتر واحد من الميثانول إلى زاوية كل بئر لاحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، يستنشق ببطء محتويات كل بئر دون إزعاج أحادي الخلية. بعد ذلك ، تسمية كل بئر مع ملليلتر واحد من محلول العمل البنفسجي البلوري ، مع الحرص على تغطية جميع الخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.في نهاية الحضانة ، تجاهل المحلول وتجفيف الآبار على ورقة ماصة ، ثم عد عدد اللويحات في أعلى تخفيف جيد لتحديد إجمالي محتوى الفيروس في محلول البداية ثلاث مرات. وكما لوحظ في تحليل التصوير المجسم المفلور، فإن الفعالية المضادة للفيروسات ل BX795 مماثلة لفعالية TFT في السيطرة على الانتشار الفيروسي، في حين أن القرنيات المعالجة بالمركبة لا تثبت انتشار الفيروس إلا من منطقة العدوى المركزية إلى المحيط بستة أيام بعد التلقيح الفيروسي الأولي. وبالمثل، فإن مسحات العين التي اتخذت في اليومين الثاني والرابع بعد العدوى تظهر تثبيط كامل للفيروس في العينات الإيجابية للسيطرة والعينات المعالجة BX795، في حين لوحظت زيادة حادة في ترتي الفيروس المعدي في عينات المكافحة السلبية.عزل القرنية porcine من العين porcine كله هو أهم خطوة. والخطوات من 2-3 إلى 2-6 هي الأكثر أهمية في هذه العملية. ويمكن استخدام نموذجنا لفهم الانتشار التشجر للفيروس في القرنيات البورسينية.ويمكن توسيع نطاق هذه الطريقة نحو الالتهابات البكتيرية والفطرية كذلك. وقد ساعدت هذه الطريقة في تصور انتشار الفيروس في القرنيات خارج نموذج الإنسان. هذا النموذج مفيد في اختبار فعالية الأدوية قبل التحرك نحو التجارب على الحيوانات والبشر.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

باستخدام علم الوراثة العكسية للتلاعب الجيني NSS لفيروس حمى الوادي المتصدع MP - 12 سلالة لتحسين سلامة وفعالية اللقاحات

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

وهناك طريقة لاختبار فعالية غسل اليدين لإزالة مسببات الأمراض الناشئة الناشئة

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...