Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud (R01 EY024710, RO1 AI139768, og RO1 EY029426) til D.S. A.A. blev støttet af en F30EY025981 tilskud fra National Eye Institute, NIH. Undersøgelsen blev udført ved hjælp af porcine hornhinder opnået fra Park Packing selskab, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Alle de svin væv, der anvendes i denne undersøgelse blev leveret af en tredjepart privat organisation og ingen af de dyr håndtering blev udført af University of Illinois i Chicago personale.
1. Materialer
<ol><li>
Reagenser
	<ol>
<li>Brug følgende reagenser til plaque assay: pulver methylcellulose, Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), føtalt kvægserum (FBS), penicillin og streptomycin (P/S) til plaqueanalyse.</li>
		<li>Brug krystal violette tabletter og ethanol...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Tidligere forskning har vist BX795 at have en lovende rolle som et antiviralt middel mod HSV-1 infektion; ved at hæmme tank-bindende kinase 1 (TBK1)16. Både TBK1 og autofagi har spillet en rolle i at hjælpe hæmme HSV-1 infektion som påvist på humane hornhinde epitelceller. BX795 viste sig at være maksimalt effektiv med antivirale aktiviteter i en koncentration på 10μM og ved hjælp af både western blot analyse og viral plaque analyse af centrale virale proteiner, BX795 viste sig at hæmm...

Personer, der lider af øjeninfektioner, pådrager sig ofte synstab1. Med en høj seroprevalens på verdensplan lider HSV-inficerede personer af tilbagevendende øjeninfektioner, der fører til hornhinde ardannelse, stromal keratitis og neovascularization2,3,4,5. HSV-infektioner har også vist sig at forårsage sjældnere, en række alvorlige tilstande blandt immunkompromitterede, ubehandlede patienter som encephalitis og systemisk sygelighed6,7,8. Lægemidler som Acyclovir (ACV) og dens nukleoside analoger har vist konsekvent succes med at bremse HSV-1 infektion og endda kontrollere reaktivering endnu den langvarige brug af disse stoffer er forbundet med nyresvigt, føtale abnormiteter og manglende begrænsning af fremkomsten af lægemiddelresistens mod udviklende virusstammer9,10,11,12,13. Kompleksiteter forbundet med HSV-1 okulære infektioner, er tidligere blevet undersøgt in vitro ved hjælp af monolayers og 3D kulturer af menneskelige hornhindeceller og in vivo ved hjælp af murin eller kanin okulære infektioner. Mens disse in vitro-modeller giver betydelige data om de cellulære biologiske komponenter i HSV-1-infektioner, undlader de imidlertid at efterligne den indviklede kompleksitet af hornhindevæv og gør meget for at belyse dendritiske spredning af virus14. I modsætning hertil, selv om in vivo systemer er mere indsigtsfulde i at vise infektion spredes i hornhinder og immunaktivering svar under HSV-1 infektion, de kommer med det forbehold, at de kræver uddannede efterforskere og store faciliteter for dyrepleje at overse eksperimenter.
Her bruger vi porcine hornhinde som en ex vivo model til at undersøge HSV-1 infektion induceret sårsystem. Både den potentielle farmakologi af visse lægemidler samt celle- og molekylærbiologien i sårsystemet forårsaget af infektionen kan studeres gennem vævseksplanter. Denne model kan også ændres til brug for andre virale og bakterielle infektioner samt. I denne undersøgelse blev der anvendt hornhinhindeas til at teste den antivirale effekt af et præklinisk lille molekyle, BX795. Brugen af hornhin hornhinde var foretrukket på grund af nem adgang og omkostningseffektivitet. Derudover er porcine hornhin hornhin modeller gode modeller af menneskelige øjne med hornhinder er let at isolere, tilstrækkeligt størrelse til infektion og visualisering og robust til at håndtere15. Porcine hornhin hornhinde er også sammenlignelig med kompleksiteten af menneskelige hornhinde modeller i både trans hornhinde permeabilitet og systemisk absorption15. Ved at bruge denne model til undersøgelsen var vi i stand til at belyse, hvordan BX795 er værd at undersøge nærmere som en kompetent hæmmer af HSV-1-virusinfektion og tilføjer til litteraturen om at klassificere det som en potentiel lillemolekyle antiviral forbindelse16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Vira og bakterier kan forårsage en række okulære overfladefejl og degeneration såsom sår og sår gennem hornhindeinfektion. Med en seroprevalens, der spænder fra 60-90% på verdensplan, forårsager Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) almindeligvis slimhindede læsioner i orofacialområdet, som også manifesterer sig som læsioner og infektionsrelateret blindhed. Mens de nuværende antivirale lægemidler er effektive, kræver fremkomsten af resistens og persistens af giftige bivirkninger udvikling af nye antivirale lægemidler mod dette allestedsnærværende patogen. Selv om in vitro-vurdering giver nogle funktionelle data vedrørende en spirende antiviral, de ikke påvise kompleksiteten af okulært væv in vivo. In vivo-undersøgelser er imidlertid dyre og kræver uddannet personale, især når man arbejder med virale stoffer. Derfor ex vivo modeller er effektive endnu billige trin til antivirale test. Her diskuterer vi en protokol til at studere infektion med HSV-1 ved hjælp af porcine hornhin hornhinde ex vivo og en metode til at behandle dem topisk ved hjælp af eksisterende og nye antivirale lægemidler. Vi demonstrerer også metoden til at udføre en plak assay ved hjælp af HSV-1. De beskrevne metoder kan anvendes til at udføre lignende forsøg for at studere infektioner, der ligner HSV-1 patogenet.

For at forstå effekten af de eksperimentelle antivirale lægemidler skal de testes grundigt, før de sendes til in vivo humane kliniske forsøg. I den forbindelse skal der identificeres positiv kontrol, negativ kontrol og testgrupper. Trifluorothymidin (TFT) har længe været anvendt som den foretrukne behandling til behandling af herpes keratitis topisk16. Anvendes som en positiv kontrol, TFT behandlet hornhinde grupper viser lavere infektion spredning. Som en negativ kontrol brugte vi DMSO elle...

Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Vi beskriver brugen af en hornhin hornhin til at teste den antivirale effekt af eksperimentelle lægemidler.

Porcine Hornhin Tissue Explant at studere effekten af Herpes Simplex Virus-1 Antivirale lægemidler

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Forståelse af effekten af lægemidler i dyremodeller er omkostninger og arbejdskrævende. Vores protokol, der anvender en ex vivo væv explant model er betydeligt lavere både med hensyn til omkostninger og videnskabeligt personale, der kræves for at gennemføre undersøgelsen. Den største fordel ved denne teknik er brugen af porcine øjne, som har anatomi og fysiologi meget lig menneskelige øjne i modsætning til nogle andre små dyremodeller.Når vi tester lægemidler in vitro, kan de vise effekt, som kan være fraværende i dyre- eller menneskelige modeller. Ex vivo vævssystemer er den bedste måde at forstå, om vores in vitro-systemer kan oversættes til dyre- og menneskeforsøg. Den svin hornhin hornhin system, selv om mindre arbejdskrævende, kræver trainable færdigheder til at isolere, vedligeholde, inficere og behandle med narkotika, især processen med isolering af hornhinden fra hele porcine øjet er vanskelig at udtrykke i ord, men kræver visuel demonstration.Når du modtager porcine øjne fra en passende leverandør, opbevare væv på is, indtil forarbejdning og sat på passende personlige beskyttelsesudstyr. Desinficer arbejdsområdet med 70% ethanol og fastgør et bænkdæksel på arbejdsområdet. Når arbejdsområdet er klar, skal du placere øjnene på et 50 millimeter stykke gaze og bruge gaze til at gribe den bageste sektion med den ene hånd.Ved hjælp af en 30 gauge nål, omhyggeligt gøre en enkelt punktering i omtrent midten af epiteloverfladen af øjet, passe på ikke at beskadige stroma, og bruge en skarp steriliseret klinge til at gøre et lille snit på sclera på en millimeter afstand fra hornhinden. Brug en hurtig og glat roterende handling af hånden og passe på, at glaslegemet humor ikke lækker, skære kanten af hornhinden og holde hornhinden på hornhinden-sclera kanten med en flad pincet, bruge bladet til at afskære de resterende tøjring membraner. Da hver hornhinde er isoleret, placere vævene med billedbrønde af en 12-brønd plade, der indeholder to milliliter hornhinde medium pr brønd og tilføje fem mikroliter af en fem gange 10 til den femte plakdannende enhed af 17 GFP virusopløsning til debrided site på hver hornhinde overflade.Når alle hornhinder er blevet indsamlet, placere pladen i på 37 grader Celsius, 5% kuldioxid inkubator i 72 timer og spray eventuelle yderligere øjne, der ikke anvendes i forsøget med 10% blegemiddel til deres sikker bortskaffelse i biohazard poser. Hver dag før tilsætning af narkotika, placere pladen af hornhinder under et stereomikroskop og vælg GFP filter og en 500 mikrosekund eksponeringstid. Fang billederne ved den laveste forstørrelse, før du billeddannelse hornhinder på en række stigende forstørrelser, indtil alle de virale spredning og dendrit dannelse kan visualiseres tydeligt.Når alle hornhinder er blevet afbildet, returnere pladen til vævskultur inkubatoren. Dagen før infektionen, vaske en sammenflyttet vero celle kultur to gange med 10 milliliter PBS per vask, og behandle cellerne med en milliliter på 0,05% trypsin per brønd i fem til 10 minutter ved 37 grader Celsius. Når cellerne har løsnet sig, skal du bruge ni milliliter af hele medium for at sikre, at cellerne løsner sig helt fra kolbeoverfladen og overfører den resulterende celleophæng til et 15 milliliter centrifugerør.Tilsæt 300 mikroliter af celler til hver brønd af en ny seks brøndplade, efterfulgt af tilsætning af to milliliter medium til hver brønd, og placer derefter pladen i cellekulturinkubatoren natten over. Næste morgen, for at indsamle virus fra hver hornhinde til kvantificering, blød steril bomuld vatpind tips i 500 mikroliter af serum-fri medium pr vatpind i flere mikrocentrifuge rør i en biosikkerhed kabinet i mindst fem minutter. I slutningen af inkubationen skal du forsigtigt placere de inficerede svin hornhindekulturer i kabinettet.Ved hjælp af de våde vatpinde, lave tre omdrejninger med uret og tre omdrejninger mod uret fem millimeter fra midten af hver inficeret svin hornhinde uden at anvende overdrevent tryk. I slutningen af rækken af omdrejninger skal du rotere hver vatpind i sit serumfrie mediumfyldte mikrocentrifugerør med uret og mod uret fem gange, før du skærer vatpindene, så spidserne passer ind i hvert rør med låget lukket. Når alle hornhinder er blevet podet, hvirvler rørene ved høj hastighed i et minut.For at kvantificere mængden af virus indsamlet fra hver hornhinde, forberede en log10 en gange fortynding af virus i serum-fri medium i mikrocentrifuge rør, indtil en fortynding af en gange 10 til den negative otte er nået. Efter at have aspireret vækstmediet fra hver brønd af celler, overfør en milliliter af hver virusfortynding, der starter ved en gange 10 til de negative tre til de belagt cellemonomer og placerer de inficerede celler i cellekulturinkubatoren i to timer. Ved inkubationens afslutning vaskes hver brønd forsigtigt to gange med PBS, før du tilføjer to milliliter methylcellulosebelastet medium til hver brønd til en 72-timers inkubation, eller indtil dannelsen af plaques kan observeres.Ved plak observation, langsomt tilføje en milliliter methanol til hjørnet af hver brønd for en 15-minutters inkubation ved stuetemperatur. I slutningen af inkubationen aspirerer langsomt indholdet fra hver brønd uden at forstyrre cellemonomeren. Derefter mærkes hver brønd med en milliliter krystal violet arbejdsopløsning, idet du sørger for, at alle cellerne er dækket til en 30-minutters inkubation beskyttet mod lys.I slutningen af inkubationen skal du kassere opløsningen og tørre brøndene på et ark absorberende papir og derefter tælle antallet af plaques ved den højeste fortyndingsvejg for at kvantificere det samlede virusindhold i startopløsningen tre gange. Som observeret i denne stereoskopiske fluorescensbilledanalyse er den antivirale effekt af BX795 den samme som TFT's ved at kontrollere virusspredning, mens hornhinder, der behandles med køretøjet, kun påviser spredning af virus fra den centrale infektionszone til periferien med seks dage efter den første virusvackling. På samme måde udviser de okulære podninger, der er taget på dag to og fire efter infektion, en fuldstændig hæmning af virus i de positive kontrol- og BX795-behandlede prøver, mens der observeres en kraftig stigning i infektiøs virustiter i de negative kontrolprøver.Isoleringen af svin hornhinden fra hele porcine øjet er det vigtigste skridt. Trin 2.3 til 2.6 er de mest afgørende i denne proces. Vores model kan bruges til at forstå dendritiske spredning af virus i porcine hornhinder.Denne metode kan udvides i retning af bakterielle og svampeinfektioner samt. Denne metode har hjulpet med at visualisere dendritisk spredning af virus i hornhinder uden for en menneskelig model. Denne model er nyttig til at teste effekten af lægemidler, før man bevæger sig i retning af dyre- og menneskeforsøg.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Brug af omvendt genetik til at manipulere NSS Gene af Rift Valley Fever virus MP-12 Strain to Improve Vaccine sikkerhed og effekt

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Assays til identifikation af nye Antivirale mod bluetonguevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescensbaseret neuraminidase-inhiberingsassay i vurdering af den følsomhed over influenzavira til neuraminidaseinhibitoren Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

En metode til at teste effektiviteten af ​​håndvask til fjernelse af nye smitsomme patogener

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...