Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY024710, RO1 AI139768 en RO1 EY029426) aan D.S. A.A. werd ondersteund door een F30EY025981-beurs van het National Eye Institute, NIH. Studie werd uitgevoerd met behulp van de varkens hoornvliezen verkregen van Park Packing bedrijf, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Al het varkensweefsel dat in deze studie werd gebruikt, werd geleverd door een externe particuliere organisatie en geen van de dierbehandeling werd uitgevoerd door personeel van de Universiteit van Illinois in Chicago.
1. Materialen
<ol><li>
Reagentia
	<ol>
<li>Gebruik de volgende reagentia voor plaquetest: poedermethylcellulose, Dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), penicilline en streptomycine (P / S) voor plaquetest.</li>
		<li>Gebrui...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Eerder onderzoek heeft aangetoond dat BX795 een veelbelovende rol speelt als antiviraal middel tegen HSV-1-infectie; door het TANK-bindende kinase 1 (TBK1)16te remmen . Zowel TBK1 als autofagie hebben een rol gespeeld bij het helpen remmen van HSV-1-infectie, zoals aangetoond op menselijke cornea-epitheelcellen. BX795 bleek maximaal effectief te zijn met antivirale activiteit bij een concentratie van 10μM en met behulp van zowel western blot-analyse als virale plaque-analyse van belangrijke viral...

Mensen die lijden aan ooginfecties lopen vaak verlies van hetgezichtsvermogen op 1. Met een hoge seroprevalentie wereldwijd lijden HSV-geïnfecteerde personen aan terugkerende ooginfecties die leiden tot cornealittekens, stromale keratitis en neovascularisatie2,3,4,5. HSV-infecties hebben ook aangetoond dat ze minder vaak een reeks ernstige aandoeningen veroorzaken bij immuungecompromitteerde, onbehandelde patiënten zoals encefalitis en systemische morbiditeit6,7,8. Geneesmiddelen zoals Acyclovir (ACV) en zijn nucleoside-analogen hebben consistent succes getoond bij het beteugelen van HSV-1-infectie en zelfs controlereactivering, maar het langdurige gebruik van deze geneesmiddelen is geassocieerd met nierfalen, foetale afwijkingen en het niet beperken van de opkomst van geneesmiddelresistentie tegen evoluerende virale stammen9,10,11,12,13. Complexiteiten geassocieerd met HSV-1 oculaire infecties, zijn eerder in vitro bestudeerd met behulp van monolagen en 3D-culturen van menselijke hoornvliescellen en in vivo met behulp van muizen- of konijnenoculaire infecties. Hoewel deze in vitro modellen significante gegevens opleveren over de cellulaire biologische componenten van HSV-1-infecties, slagen ze er echter niet in om de ingewikkelde complexiteit van hoornvliesweefsel na te bootsen en doen ze weinig om de dendritische verspreiding van het virus te verlichten14. Hoewel in vivo systemen daarentegen inzichtelijker zijn in het aantonen van infectieverspreiding in hoornvliezen en immuunactivatieresponsen tijdens HSV-1-infectie, komen ze met het voorbehoud dat ze getrainde onderzoekers en grote faciliteiten voor dierenverzorging nodig hebben om de experimenten over het hoofd te zien.
Hier gebruiken we varkenshoornvliezen als een ex vivo model om het door HSV-1-infectie geïnduceerde wondsysteem te onderzoeken. Zowel de potentiële farmacologie van bepaalde geneesmiddelen als de cel- en moleculaire biologie van het wondsysteem veroorzaakt door de infectie kunnen worden bestudeerd door middel van weefselexplantatieculturen. Dit model kan ook worden aangepast voor het gebruik voor andere virale en bacteriële infecties. In deze studie werden varkenshoornvliezen gebruikt om de antivirale werkzaamheid van een preklinisch klein molecuul, BX795, te testen. Het gebruik van varkenshoornvliezen had de voorkeur vanwege de gemakkelijke toegang en de kosteneffectiviteit. Bovendien zijn varkens corneamodellen goede modellen van menselijke ogen, waarbij de hoornvliezen gemakkelijk te isoleren zijn, voldoende groot zijn voor infectie en visualisatie en robuust zijn om15te verwerken . Varkenshoornvliezen zijn ook vergelijkbaar met de complexiteit van menselijke hoornvliesmodellen in zowel trans corneapermeabiliteit als systemische absorptie15. Door dit model voor de studie te gebruiken, konden we ophelderen hoe BX795 het waard is om verder te worden onderzocht als een competente remmer van HSV-1-virusinfectie en voegt het toe aan de literatuur van het classificeren als een potentiële antivirale verbinding met klein molecuul16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Virussen en bacteriën kunnen een verscheidenheid aan oculaire oppervlaktedefecten en degeneratie veroorzaken, zoals wonden en zweren door hoornvliesinfectie. Met een seroprevalentie die wereldwijd varieert van 60-90%, veroorzaakt het Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) vaak mucocutane laesies van het orofaciale gebied die zich ook manifesteren als laesies en infectiegerelateerde blindheid. Hoewel de huidige antivirale geneesmiddelen effectief zijn, vereist het ontstaan van resistentie en persistentie van toxische bijwerkingen de ontwikkeling van nieuwe antivirale middelen tegen deze alomtegenwoordige ziekteverwekker. Hoewel in vitro beoordeling enkele functionele gegevens oplevert met betrekking tot een opkomend antiviraal middel, tonen ze de complexiteit van oculair weefsel in vivo niet aan. In vivo studies zijn echter duur en vereisen getraind personeel, vooral bij het werken met virale agentia. Vandaar dat ex vivo modellen efficiënte maar goedkope stappen zijn voor antivirale testen. Hier bespreken we een protocol om infectie door HSV-1 te bestuderen met behulp van varkenshoornvliezen ex vivo en een methode om ze topisch te behandelen met behulp van bestaande en nieuwe antivirale geneesmiddelen. We demonstreren ook de methode om een plaque-assay uit te voeren met behulp van HSV-1. De gedetailleerde methoden kunnen worden gebruikt om vergelijkbare experimenten uit te voeren om infecties te bestuderen die lijken op de HSV-1-ziekteverwekker.

Om de werkzaamheid van de experimentele antivirale middelen te begrijpen, moeten ze uitgebreid worden getest voordat ze worden verzonden voor in vivo klinische onderzoeken bij mensen. In dit verband moeten positieve controle-, negatieve controle- en testgroepen worden geïdentificeerd. Trifluorothymidine (TFT) wordt al lang gebruikt als de voorkeursbehandeling om herpes keratitis topisch te behandelen16. Gebruikt als een positieve controle, vertonen de tft behandelde hoornvliesgroepen een lagere i...

Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

We beschrijven het gebruik van een varkenshoornvlies om de antivirale werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen te testen.

Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Het begrijpen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in diermodellen is kosten- en arbeidsintensief. Ons protocol dat een ex vivo weefselexplantatiemodel gebruikt, is aanzienlijk lager, zowel in termen van kosten als wetenschappelijk personeel dat nodig is om het onderzoek uit te voeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van varkensogen, die anatomie en fysiologie hebben die erg lijken op menselijke ogen in tegenstelling tot sommige andere kleine diermodellen.Wanneer we geneesmiddelen in vitro testen, kunnen ze werkzaamheid vertonen die mogelijk afwezig is in dier- of menselijke modellen. Ex vivo weefselsystemen zijn de beste manier om te begrijpen of onze in vitro systemen al dan niet kunnen worden vertaald in dier- en mensproeven. Het varkenshoornvliessysteem, hoewel minder arbeidsintensief, vereist trainbare vaardigheden om de medicijnen te isoleren, te onderhouden, te infecteren en te behandelen, vooral het proces van isolatie van het hoornvlies van het hele varkensoog is lastig uit te drukken in woorden, maar vereist visuele demonstratie.Na ontvangst van varkensogen van een geschikte verkoper, bewaar de weefsels op ijs tot de verwerking en trek de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen aan. Desinfecteer de werkruimte met 70% ethanol en bevestig een bankafdekking op de werkplek. Wanneer het werkgebied klaar is, plaatst u de ogen op een stuk gaas van 50 millimeter en gebruikt u het gaas om het achterste gedeelte met één hand vast te pakken.Maak met behulp van een naald van 30 gauge zorgvuldig een enkele punctie in ongeveer het midden van het epitheeloppervlak van het oog, zorg ervoor dat het stroma niet wordt beschadigd en gebruik een scherp gesteriliseerd mes om een kleine incisie op de sclera te maken op een afstand van één millimeter van het hoornvlies. Gebruik een snelle en soepele roterende actie van de hand en zorg ervoor dat de glasvochthumor niet lekt, snijd de rand van het hoornvlies af en houd het hoornvlies aan de rand van het hoornvlies-sclera met een plat pincet, gebruik het mes om de resterende tethering membranen af te snijden. Terwijl elk hoornvlies wordt geïsoleerd, plaatst u de weefsels met de voorkant naar boven in individuele putten van een 12-putplaat met twee milliliter hoornvliesmedium per put en voegt u vijf microliter van vijf keer 10 toe aan de vijfde plaquevormende eenheid van 17 GFP-virusoplossing aan de gedebrideerde plaats op elk hoornvliesoppervlak.Wanneer alle hoornvliezen zijn verzameld, plaatst u de plaat in 37 graden Celsius, 5% kooldioxide-incubator gedurende 72 uur en spuit u eventuele extra ogen die niet in het experiment zijn gebruikt met 10% bleekmiddel voor hun veilige verwijdering in biohazard-zakken. Plaats elke dag vóór de toevoeging van geneesmiddelen de plaat hoornvliezen onder een stereomicroscoop en selecteer het GFP-filter en een blootstellingstijd van 500 microseconden. Leg de beelden vast met de laagste vergroting voordat je de hoornvliezen in beeld stelt met een reeks toenemende vergrotingen totdat alle virale verspreiding en dendrietvorming duidelijk kan worden gevisualiseerd.Wanneer alle hoornvliezen in beeld zijn gebracht, brengt u de plaat terug naar de weefselkweekincubator. Was de dag voor de infectie twee keer een confluente vero-celcultuur met 10 milliliter PBS per wasbeurt en behandel de cellen met één milliliter van 0,05% trypsine per put gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, gebruikt u negen milliliter heel medium om ervoor te zorgen dat de cellen zich volledig losmaken van het kolfoppervlak en de resulterende celsuspensie overbrengen naar een centrifugebuis van 15 milliliter.Voeg 300 microliter cellen toe aan elke put van een nieuwe zes putplaat, gevolgd door de toevoeging van twee milliliter medium aan elke put en plaats de plaat vervolgens een nacht in de celkweekincubator. De volgende ochtend, om het virus uit elk hoornvlies te verzamelen voor kwantificering, week steriele wattenstaafjes in 500 microliter serumvrij medium per wattenstaafje in meerdere microcentrifugebuizen in een bioveiligheidskast gedurende ten minste vijf minuten. Plaats aan het einde van de incubatie voorzichtig de geïnfecteerde varkenshoornvliesculturen in de kast.Maak met behulp van de natte wattenstaafjes drie omwentelingen met de klok mee en drie omwentelingen tegen de klok in vijf millimeter van het midden van elk geïnfecteerd varkenshoornvlies zonder overmatige druk uit te oefenen. Draai aan het einde van de reeks omwentelingen elk wattenstaafje in de serumvrije medium gevulde microcentrifugebuis vijf keer met de klok mee en tegen de klok in voordat u de wattenstaafjes snijdt, zodat de uiteinden in elke buis passen met het deksel gesloten. Wanneer alle hoornvliezen zijn afgeveegd, vortex de buizen gedurende één minuut op hoge snelheid.Om de hoeveelheid virus die uit elk hoornvlies wordt verzameld te kwantificeren, bereidt u een log10 eenvoudige verdunning van het virus in serumvrij medium in microcentrifugebuizen totdat een verdunning van één keer 10 tot de negatieve acht is bereikt. Na het opzuigen van het groeimedium uit elke put van cellen, breng een milliliter van elke virusverdunning beginnend bij één keer 10 naar de negatieve drie naar de vergulde celmonolagen en plaats de geïnfecteerde cellen gedurende twee uur in de celkweekincubator. Was aan het einde van de incubatie elke put voorzichtig twee keer met PBS voordat u twee milliliter methylcellulose-geladen medium aan elke put toevoegt voor een incubatie van 72 uur of totdat de vorming van plaques kan worden waargenomen.Voeg bij plaque-observatie langzaam een milliliter methanol toe aan de hoek van elke put voor een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur. Adem aan het einde van de incubatie langzaam de inhoud uit elke put op zonder de celmonolaag te verstoren. Label vervolgens elke put met een milliliter kristalviolet werkoplossing en zorg ervoor dat alle cellen bedekt zijn voor een incubatie van 30 minuten beschermd tegen licht.Gooi aan het einde van de incubatie de oplossing weg en droog de putjes op een vel absorberend papier en tel vervolgens het aantal plaques bij de hoogste verdunningsput om het totale virusgehalte in de startoplossing drie keer te kwantificeren. Zoals waargenomen in deze stereoscopische fluorescentiebeeldvormingsanalyse, is de antivirale werkzaamheid van BX795 vergelijkbaar met die van TFT bij het beheersen van virale verspreiding, terwijl hoornvliezen die met het medium zijn behandeld, alleen de verspreiding van het virus van de centrale infectiezone naar de periferie vertonen zes dagen na de initiële virale inenting. Evenzo vertonen de ooguitstrijkjes die op dag twee en vier na infectie worden genomen een volledige remming van het virus in de positieve controle- en met BX795 behandelde monsters, terwijl een sterke toename van infectieuze virustiter wordt waargenomen in de negatieve controlemonsters.De isolatie van het hoornvlies van de varkens van het hele varkensoog is de belangrijkste stap. Stap 2.3 tot en met 2.6 zijn het meest cruciaal in dit proces. Ons model kan worden gebruikt om de dendritische verspreiding van het virus in varkenshoornvliezen te begrijpen.Deze methode kan ook worden uitgebreid naar bacteriële en schimmelinfecties. Deze methode heeft geholpen bij het visualiseren van dendritische verspreiding van het virus in hoornvliezen buiten een menselijk model. Dit model is nuttig bij het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen voordat ze overgaan op dier- en menselijke proeven.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescentie gebaseerde neuraminidase remmingstest om de gevoeligheid van de influenza virussen zijn voorgesteld om de neuraminidase remmer Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Een methode om de werkzaamheid van handwashing te testen voor de verwijdering van opkomende infectieuze pathogenen

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpressie en zuivering van het menselijk<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infectie van menselijke lymfoïde weefsels en vrouwelijke genitale Mucosa met Humaan Immunodeficiëntie Virus 1 en Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie