Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
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Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse (R01 EY024710, RO1 AI139768 und RO1 EY029426) an D.S. A.A. unterstützt, die durch einen F30EY025981-Zuschuss des National Eye Institute, NIH, unterstützt wurden. Die Studie wurde mit den Schweinehornhäuten der Park Packing Company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609, durchgeführt.

Das gesamte in dieser Studie verwendete Schweinegewebe wurde von einer privaten Drittorganisation zur Verfügung gestellt, und keiner der Tierhandhabung wurde von Mitarbeitern der University of Illinois in Chicago durchgeführt.
1. Materialien
<ol><li>
Reagenzien
	<ol>
<li>Verwenden Sie folgende Reagenzien für den Plaque-Assay: Pulvermethylcellulose, Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM), fetales Rinderserum (FBS), Penicillin und Streptomycin (P / S) für den Plaque-As...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Frühere Forschungen haben gezeigt, dass BX795 eine vielversprechende Rolle als antivirales Mittel gegen HSV-1-Infektionen spielt. durch Hemmung der TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1)16. Sowohl TBK1 als auch Autophagie haben eine Rolle bei der Hemmung der HSV-1-Infektion gespielt, wie sie an menschlichen Hornhautepithelzellen gezeigt wurde. BX795 erwies sich als maximal wirksam bei antiviraler Aktivität in einer Konzentration von 10μM und sowohl unter Verwendung der Western-Blot-Analyse als auch der...

Menschen, die an Augeninfektionen leiden, erleiden häufig Sehverlust1. Mit einer weltweit hohen Seroprävalenz leiden HSV-infizierte Personen an wiederkehrenden Augeninfektionen, die zu Hornhautvernarbungen, Stromakeratitis und Neovaskularisation führen2,3,4,5. HSV-Infektionen haben auch gezeigt, dass sie weniger häufig eine Reihe von schweren Erkrankungen bei immungeschwächten, unbehandelten Patienten wie Enzephalitis und systemische Morbidität verursachen6,7,8. Medikamente wie Aciclovir (ACV) und seine Nukleosidanaloga haben einen konsistenten Erfolg bei der Eindämmung der HSV-1-Infektion und sogar der Kontrolle der Reaktivierung gezeigt, aber der längere Gebrauch dieser Medikamente ist mit Nierenversagen, fetalen Anomalien und dem Versagen verbunden, die Entstehung von Arzneimittelresistenzen gegen sich entwickelnde Virusstämme einzuschränken9,10,11,12,13. Komplexitäten im Zusammenhang mit HSV-1-Augeninfektionen wurden zuvor in vitro mit Monoschichten und 3D-Kulturen menschlicher Hornhautzellen und in vivo mit murinen oder Kaninchen-Augeninfektionen untersucht. Während diese In-vitro-Modelle signifikante Daten über die zellbiologischen Komponenten von HSV-1-Infektionen liefern, können sie jedoch die komplizierte Komplexität des Hornhautgewebes nicht nachahmen und tun wenig, um die dendritische Ausbreitung des Virus zubeleuchten 14. Im Gegensatz dazu, obwohl In-vivo-Systeme aufschlussreicher sind, um die Ausbreitung von Infektionen in Hornhäuten und Immunaktivierungsreaktionen während der HSV-1-Infektion zu zeigen, haben sie den Vorbehalt, dass sie geschulte Ermittler und große Einrichtungen für die Tierpflege benötigen, um die Experimente zu übersehen.
Hier verwenden wir Schweinehornhäute als Ex-vivo-Modell, um das HSV-1-infektionsinduzierte Wundsystem zu untersuchen. Sowohl die potenzielle Pharmakologie bestimmter Medikamente als auch die Zell- und Molekularbiologie des durch die Infektion verursachten Wundsystems können durch Gewebeentsteigungskulturen untersucht werden. Dieses Modell kann auch für die Verwendung bei anderen viralen und bakteriellen Infektionen geändert werden. In dieser Studie wurden Schweinehornhäute verwendet, um die antivirale Wirksamkeit eines präklinischen kleinen Moleküls, BX795, zu testen. Die Verwendung von Schweinehornhäuten wurde aufgrund des einfachen Zugangs und der Kosteneffizienz bevorzugt. Darüber hinaus sind Schweinehornhautmodelle gute Modelle der menschlichen Augen, wobei die Hornhäute leicht zu isolieren sind, ausreichend für Infektionen und Visualisierungen dimensioniert und robust sind, um15zu handhaben. Schweinehornhäute sind auch vergleichbar mit der Komplexität menschlicher Hornhautmodelle sowohl in der transkornealen Permeabilität als auch in der systemischen Absorption15. Durch die Verwendung dieses Modells für die Studie konnten wir aufklären, wie BX795 als kompetenter Inhibitor der HSV-1-Virusinfektion einer weiteren Untersuchung würdig ist und die Literatur zur Klassifizierung als potenzielle niedermolekulare antivirale Verbindungergänzt 16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Viren und Bakterien können eine Vielzahl von Augenoberflächendefekten und Degenerationen wie Wunden und Geschwüre durch Hornhautinfektionen verursachen. Mit einer Seroprävalenz, die weltweit zwischen 60 und 90% liegt, verursacht das Herpes-Simplex-Virus Typ-1 (HSV-1) häufig mukokutane Läsionen der orofazialen Region, die sich auch als Läsionen und infektionsbedingte Blindheit manifestieren. Während aktuelle antivirale Medikamente wirksam sind, erfordert das Auftreten von Resistenzen und die Persistenz toxischer Nebenwirkungen die Entwicklung neuartiger antiviraler Medikamente gegen diesen allgegenwärtigen Erreger. Obwohl die In-vitro-Bewertung einige funktionelle Daten zu einem aufkommenden antiviralen Mittel liefert, zeigen sie nicht die Komplexität des Augengewebes in vivo. In-vivo-Studien sind jedoch teuer und erfordern geschultes Personal, insbesondere bei der Arbeit mit viralen Wirkstoffen. Daher sind Ex-vivo-Modelle effiziente und dennoch kostengünstige Schritte für antivirale Tests. Hier diskutieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Infektion mit HSV-1 unter Verwendung von Schweinehornhäuten ex vivo und eine Methode, um sie topisch mit bestehenden und neuartigen antiviralen Medikamenten zu behandeln. Wir demonstrieren auch die Methode zur Durchführung eines Plaque-Assays mit HSV-1. Die detaillierten Methoden können verwendet werden, um ähnliche Experimente durchzuführen, um Infektionen zu untersuchen, die dem HSV-1-Erreger ähneln.

Um die Wirksamkeit der experimentellen antiviralen Medikamente zu verstehen, müssen sie ausgiebig getestet werden, bevor sie für klinische In-vivo-Studien am Menschen geschickt werden. In diesem Zusammenhang müssen Positivkontroll-, Negativkontroll- und Testgruppen identifiziert werden. Trifluorthymidin (TFT) wird seit langem als bevorzugte Behandlung zur topischen Behandlung von Herpeskeratitiseingesetzt 16. Als Positivkontrolle eingesetzt, zeigen die mit TFT behandelten Hornhautgruppen eine g...

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Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Wir beschreiben die Verwendung einer Schweinehornhaut, um die antivirale Wirksamkeit experimenteller Medikamente zu testen.

Porcine Hornhautgewebe Explant, um die Wirksamkeit von Herpes Simplex Virus-1 Antiviralen zu untersuchen

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Das Verständnis der Wirksamkeit von Medikamenten in Tiermodellen ist kosten- und arbeitsintensiv. Unser Protokoll, das ein Ex-vivo-Gewebe-Explant-Modell verwendet, ist sowohl in Bezug auf die Kosten als auch auf das wissenschaftliche Personal, das für die Durchführung der Studie erforderlich ist, signifikant niedriger. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung von Schweineaugen, deren Anatomie und Physiologie den menschlichen Augen im Gegensatz zu einigen anderen Kleintiermodellen sehr ähnlich ist.Wenn wir Medikamente in vitro testen, können sie eine Wirksamkeit zeigen, die in Tier- oder Humanmodellen fehlen könnte. Ex-vivo-Gewebesysteme sind der beste Weg, um zu verstehen, ob unsere In-vitro-Systeme in Tier- und Humanversuche übersetzt werden können oder nicht. Das Hornhautsystem der Schweine, obwohl weniger arbeitsintensiv, erfordert trainierbare Fähigkeiten, um die Medikamente zu isolieren, zu pflegen, zu infizieren und zu behandeln, insbesondere der Prozess der Isolierung der Hornhaut vom gesamten Schweineauge ist schwierig in Worten auszudrücken, erfordert aber eine visuelle Demonstration.Nachdem Sie Schweineaugen von einem geeigneten Anbieter erhalten haben, lagern Sie die Taschentücher bis zur Verarbeitung auf Eis und legen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und befestigen Sie eine Tischabdeckung auf dem Arbeitsplatz. Wenn der Arbeitsbereich fertig ist, legen Sie die Augen auf ein 50-Millimeter-Stück Gaze und greifen Sie mit der Gaze den hinteren Abschnitt mit einer Hand.Machen Sie mit einer 30-Gauge-Nadel vorsichtig eine einzige Punktion in etwa der Mitte der Epitheloberfläche des Auges, achten Sie darauf, das Stroma nicht zu beschädigen, und verwenden Sie eine scharfe sterilisierte Klinge, um einen kleinen Schnitt an der Sklera in einem Millimeter Abstand von der Hornhaut zu machen. Mit einer schnellen und sanften Rotierenden Aktion der Hand und unter Berücksichtigung der Achtelpatschung, dass der Glaskörper nicht ausläuft, schneiden Sie den Rand der Hornhaut und halten Sie die Hornhaut an der Hornhaut-Sklera-Kante mit einer flachen Pinzette, verwenden Sie die Klinge, um die verbleibenden Bindemembranen abzuschneiden. Wenn jede Hornhaut isoliert ist, legen Sie das Gewebe nach oben in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die zwei Milliliter Hornhautmedium pro Vertiefung enthält, und fügen Sie fünf Mikroliter von fünf mal 10 zur fünften plaquebildenden Einheit von 17 GFP-Viruslösung an die debrided Stelle auf jeder Hornhautoberfläche hinzu.Wenn alle Hornhäute gesammelt sind, legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator für 72 Stunden und sprühen Sie alle zusätzlichen Augen, die im Experiment nicht verwendet wurden, mit 10% Bleichmittel für ihre sichere Entsorgung in Biohazard-Beuteln. Legen Sie jeden Tag vor der Zugabe von Medikamenten die Hornhautplatte unter ein Stereomikroskop und wählen Sie den GFP-Filter und eine Belichtungszeit von 500 Mikrosekunden. Nehmen Sie die Bilder mit der niedrigsten Vergrößerung auf, bevor Sie die Hornhäute mit einer Reihe von zunehmenden Vergrößerungen abbilden, bis die gesamte Virusausbreitung und Dendritenbildung klar visualisiert werden kann.Wenn alle Hornhäute abgebildet sind, bringen Sie die Platte in den Gewebekultur-Inkubator zurück. Waschen Sie am Tag vor der Infektion zweimal eine konfluente Vero-Zellkultur mit 10 Milliliter PBS pro Waschgang und behandeln Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,05% Trypsin pro Vertiefung für fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn sich die Zellen gelöst haben, verwenden Sie neun Milliliter des gesamten Mediums, um sicherzustellen, dass sich die Zellen vollständig von der Kolbenoberfläche lösen und die resultierende Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.Fügen Sie 300 Mikroliter Zellen zu jeder Vertiefung einer neuen Sechs-Well-Platte hinzu, gefolgt von der Zugabe von zwei Millilitern Medium zu jeder Vertiefung, und legen Sie die Platte dann über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Um das Virus am nächsten Morgen zur Quantifizierung von jeder Hornhaut zu sammeln, tränken Sie sterile Wattestäbchenspitzen in 500 Mikroliter serumfreiem Medium pro Tupfer in mehreren Mikrozentrifugenröhrchen in einer Biosicherheitswerkbank für mindestens fünf Minuten. Am Ende der Inkubation die infizierten Schweinehornhautkulturen vorsichtig in den Schrank legen.Machen Sie mit den nassen Wattestäbchen drei Umdrehungen im Uhrzeigersinn und drei Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn fünf Millimeter von der Mitte jeder infizierten Schweinehornhaut entfernt, ohne übermäßigen Druck auszuüben. Drehen Sie am Ende der Umdrehungsserie jeden Tupfer in seinem serumfreien, mit medium gefüllten Mikrozentrifugenröhrchen fünfmal im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, bevor Sie die Tupfer schneiden, so dass die Spitzen bei geschlossenem Deckel in jedes Röhrchen passen. Wenn alle Hornhäute abgetupfte sind, wirbeln Sie die Rohre mit hoher Geschwindigkeit für eine Minute.Um die Menge des von jeder Hornhaut gesammelten Virus zu quantifizieren, bereiten Sie eine log10-verdünnte Verdünnung des Virus in serumfreiem Medium in Mikrozentrifugenröhrchen vor, bis eine Verdünnung von einmal 10 auf die negativen acht erreicht ist. Nachdem Sie das Wachstumsmedium aus jeder Zellbohrung abgesaugt haben, übertragen Sie einen Milliliter jeder Virusverdünnung, beginnend bei einem Mal 10 auf die negativen drei auf die plattierten Zellmonoschichten und legen Sie die infizierten Zellen für zwei Stunden in den Zellkulturinkubator. Am Ende der Inkubation jede Vertiefung zweimal vorsichtig mit PBS waschen, bevor Sie zwei Milliliter methylcellulosebeladenes Medium zu jeder Vertiefung für eine 72-stündige Inkubation hinzufügen oder bis die Bildung von Plaques beobachtet werden kann.Nach der Plaquebeobachtung langsam einen Milliliter Methanol in die Ecke jeder Vertiefung geben, um eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur zu erhalten. Am Ende der Inkubation saugen Sie langsam den Inhalt aus jeder Vertiefung ab, ohne die Zellmonoschicht zu stören. Als nächstes beschriften Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter kristallvioletter Arbeitslösung und achten Sie darauf, dass alle Zellen für eine 30-minütige Inkubation vor Licht geschützt sind.Am Ende der Inkubation entsorgen Sie die Lösung und trocknen Sie die Vertiefungen auf einem Blatt saugfähigem Papier, dann zählen Sie die Anzahl der Plaques an der höchsten Verdünnungsbohrung, um den Gesamtvirusgehalt in der Startlösung dreimal zu quantifizieren. Wie in dieser stereoskopischen Fluoreszenzbildgebungsanalyse beobachtet, ist die antivirale Wirksamkeit von BX795 ähnlich wie die von TFT bei der Kontrolle der Virusausbreitung, während Hornhäute, die mit Vehikel behandelt wurden, nur eine Ausbreitung des Virus von der zentralen Infektionszone in die Peripherie bis sechs Tage nach der ersten Virusimpfung zeigen. In ähnlicher Weise zeigen die Augenabstriche, die an den Tagen zwei und vier nach der Infektion entnommen wurden, eine vollständige Hemmung des Virus in der Positivkontrolle und BX795-behandelten Proben, während in den Negativkontrollproben ein starker Anstieg des infektiösen Virustiters beobachtet wird.Die Isolierung der Schweinehornhaut vom gesamten Schweineauge ist der wichtigste Schritt. Die Schritte 2.3 bis 2.6 sind in diesem Prozess am wichtigsten. Unser Modell kann verwendet werden, um die dendritische Ausbreitung des Virus in Schweinehornhäuten zu verstehen.Diese Methode kann auch auf bakterielle und Pilzinfektionen ausgedehnt werden. Diese Methode hat dazu beigetragen, die dendritische Ausbreitung des Virus in Hornhäuten außerhalb eines menschlichen Modells zu visualisieren. Dieses Modell ist hilfreich, um die Wirksamkeit von Medikamenten zu testen, bevor es zu Tier- und Humanversuchen übergeht.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Mit Reverse-Genetics der NSS Gene des Rift Valley Fever Virus MP-12-Stamm zu Vaccine Safety und Wirksamkeit zu verbessern Manipulieren

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Eine Methode, um die Wirksamkeit der Handwäsche für die Entfernung von auftauchenden infektiösen Pathogenen zu testen

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...