Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

इस अध्ययन NIH अनुदान (R01 EY024710, RO1 AI139768, और RO1 EY029426) द्वारा डीएस एए को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान, NIH से एक F30EY025981 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । पार्क पैकिंग कंपनी, 4107 एशलैंड एवेन्यू, न्यू सिटी, शिकागो, आईएल-60609 से प्राप्त पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करके अध्ययन किया गया था

इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी पोर्सिन ऊतक एक तीसरे पक्ष के निजी संगठन द्वारा प्रदान किया गया था और पशु हैंडलिंग में से कोई भी शिकागो कर्मियों में इलिनोइस विश्वविद्यालय द्वारा किया गया था ।
1. साम...

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	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

पूर्व अनुसंधान एचएसवी-1 संक्रमण के खिलाफ एक एंटीवायरल एजेंट के रूप में एक आशाजनक भूमिका के लिए BX795 दिखाया गया है; टैंक-बाइंडिंग किनेज़ 1 (TBK1)16को रोककर । टीबीके 1 और ऑटोफैगी दोनों ने एचएसवी-1 संक्रमण ?...

नेत्र संक्रमण से पीड़ित लोगों को अक्सर दृष्टि हानि उठानी पड़ती है1. दुनिया भर में एक उच्च सेरोप्रेवलेंस के साथ, एचएसवी संक्रमित व्यक्ति आवर्ती आंखों के संक्रमण से पीड़ित होते हैं जो कॉर्नियल स्कारिंग, स्ट्रोमल केराटिटिस और नियोवैस्कुलराइजेशन2,3,4, 5का कारणबनतेहैं। एचएसवी संक्रमण भी कम बार कारण दिखाया गया है, इम्यूनोसमझौता के बीच गंभीर स्थितियों की एक श्रृंखला, इंसेफेलाइटिस और प्रणालीगत रुग्णता6,7,8जैसे अनुपचारित रोगियों । एसीक्लिवोविर (एसीवी) और इसके न्यूक्लियोसाइड एनालॉग जैसी दवाओं ने एचएसवी-1 संक्रमण को रोकने और यहां तक कि पुनर्सक्रियण को नियंत्रित करने में लगातार सफलता दिखाई है फिर भी इन दवाओं का लंबे समय तक उपयोग गुर्दे की विफलता, भ्रूण असामान्यताओं और विकसित वायरल उपभेदों के लिए दवा प्रतिरोध के उद्भव को प्रतिबंधित करने में विफलता के साथ जुड़ा हुआ है9,10,11, 12,13। एचएसवी-1 नेत्र संक्रमण से जुड़ी जटिलताओं का पहले मोनोलेयर और मानव कॉर्नियल कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों और वीवो में मुरीन या खरगोश नेत्र संक्रमणों का उपयोग करके विट्रो में अध्ययन किया गया है। हालांकि ये इन इन विट्रो मॉडल एचएसवी-1 संक्रमणों के सेलुलर जैविक घटकों पर महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करते हैं, हालांकि, वे कॉर्नियल ऊतक की जटिल जटिलता की नकल करने में विफल रहते हैं और वायरस14के डेंड्रिटिक प्रसार को रोशन करने के लिए कुछ नहीं करते हैं। इसके विपरीत, हालांकि वीवो सिस्टम में एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान कॉर्निया और प्रतिरक्षा सक्रियण प्रतिक्रियाओं में फैले संक्रमण को दिखाने में अधिक व्यावहारिक होते हैं, वे चेतावनी के साथ आते हैं कि उन्हें प्रयोगों को नजरअंदाज करने के लिए प्रशिक्षित जांचकर्ताओं और पशु देखभाल के लिए बड़ी सुविधाओं की आवश्यकता होती है।
यहां हम एचएसवी-1 संक्रमण प्रेरित घाव प्रणाली की जांच करने के लिए एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करते हैं। संक्रमण के कारण घाव प्रणाली के सेल और आणविक जीव विज्ञान के संभावित औषध विज्ञान दोनों का अध्ययन ऊतक एक्सप्लांट संस्कृतियों के माध्यम से किया जा सकता है। इस मॉडल को अन्य वायरल और बैक्टीरियल संक्रमणों के लिए भी उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग एक प्रीक्लीनिकल छोटे अणु, BX795 की एंटीवायरल प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया गया था। पहुंच में आसानी और लागत प्रभावशीलता के कारण पोर्सिन कॉर्निया के उपयोग को प्राथमिकता दी गई थी। इसके अतिरिक्त, पोर्सिन कॉर्नियल मॉडल मानव आंखों के अच्छे मॉडल हैं, कॉर्निया को अलग करना आसान है, संक्रमण और दृश्य के लिए पर्याप्त आकार और15को संभालने के लिए मजबूत। पोर्सिन कॉर्निया ट्रांस कॉर्नियल पारमेबिलिटी और प्रणालीगत अवशोषणदोनोंमें मानव कॉर्नियल मॉडल की जटिलता के बराबर भी हैं। अध्ययन के लिए इस मॉडल का उपयोग करके, हम यह स्पष्ट करने में सक्षम थे कि BX795 एचएसवी-1 वायरस संक्रमण के एक सक्षम अवरोधक के रूप में आगे की जांच के योग्य कैसे है और इसे एक संभावित छोटे अणु एंटीवायरल यौगिक16के रूप में वर्गीकृत करने के साहित्य में जोड़ता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

वायरस और बैक्टीरिया कॉर्नियल संक्रमण के माध्यम से कई प्रकार के नेत्र सतह दोष और पतन जैसे घावों और अल्सर का कारण बन सकते हैं। दुनिया भर में 60-90% से लेकर एक सेरोप्रेवलेंस के साथ, हर्पीस सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) आमतौर पर ओरोफेशियल क्षेत्र के म्यूकोक्यूटेनियस घावों का कारण बनता है जो घावों और संक्रमण से जुड़े अंधापन के रूप में भी प्रकट होता है। जबकि वर्तमान एंटीवायरल दवाएं प्रभावी हैं, प्रतिरोध और विषाक्त दुष्प्रभावों के हठ के उद्भव से इस सर्वव्यापी रोगजनक के खिलाफ उपन्यास एंटीवायरल के विकास की आवश्यकता होती है। हालांकि इन विट्रो मूल्यांकन एक उभरते एंटीवायरल के बारे में कुछ कार्यात्मक डेटा प्रदान करता है, वे वीवो में नेत्र ऊतक की जटिलता का प्रदर्शन नहीं करते हैं। हालांकि, वीवो अध्ययन में महंगे होते हैं और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है, खासकर वायरल एजेंटों के साथ काम करते समय। इसलिए पूर्व वीवो मॉडल एंटीवायरल परीक्षण के लिए कुशल अभी तक सस्ती कदम हैं। यहां हम पोर्सिन कॉर्निया पूर्व वीवो का उपयोग करके एचएसवी-1 द्वारा संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं और मौजूदा और उपन्यास एंटीवायरल दवाओं का उपयोग करके उन्हें सामयिक रूप से इलाज करने की विधि है। हम एचएसवी-1 का उपयोग करके पट्टिका परख करने की विधि भी प्रदर्शित करते हैं। विस्तृत तरीकों का उपयोग एचएसवी-1 रोगजनक के समान संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए समान प्रयोगों का संचालन करने के लिए किया जा सकता है।

प्रायोगिक एंटीवायरल की प्रभावकारिता को समझने के लिए, वीवो मानव नैदानिक परीक्षणों में भेजे जाने से पहले उन्हें बड़े पैमाने पर परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। इस संबंध में सकारात्मक नियंत्रण, नकारात...

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Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

हम प्रायोगिक दवाओं की एंटीवायरल प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक पोर्सिन कॉर्निया के उपयोग का वर्णन करते हैं।

दाद सिंप्लेक्स वायरस-1 एंटीवायरल की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए पोर्सिन कॉर्नियल ऊतक एक्सप्लांट

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

पशु मॉडल में दवाओं की प्रभावकारिता को समझना लागत और श्रम गहन है। हमारा प्रोटोकॉल जो एक पूर्व वीवो ऊतक एक्सप्लांट मॉडल का उपयोग करता है, अध्ययन करने के लिए आवश्यक लागत और वैज्ञानिक कर्मियों दोनों के मामले में काफी कम है। इस तकनीक का मुख्य लाभ पोर्सिन आंखों का उपयोग है, जिसमें शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान कुछ अन्य छोटे जानवरों के मॉडल के विपरीत मानव आंखों के समान है।जब हम विट्रो में दवाओं का परीक्षण करते हैं, तो वे प्रभावकारिता दिखा सकते हैं जो पशु या मानव मॉडल में अनुपस्थित हो सकते हैं। पूर्व वीवो ऊतक सिस्टम यह समझने का सबसे अच्छा तरीका है कि हमारे इन विट्रो सिस्टम का पशु और मानव परीक्षणों में अनुवाद किया जा सकता है या नहीं। पोर्सिन कॉर्निया प्रणाली, हालांकि कम श्रम गहन, दवाओं के साथ अलग, बनाए रखने, संक्रमित और इलाज करने के लिए प्रशिक्षित कौशल की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से पूरे पोर्सिन आंख से कॉर्निया के अलगाव की प्रक्रिया शब्दों में व्यक्त करना मुश्किल है, लेकिन दृश्य प्रदर्शन की आवश्यकता होती है।एक उपयुक्त विक्रेता से पोर्सिन आंखें प्राप्त करने पर, प्रसंस्करण तक बर्फ पर ऊतकों को स्टोर करें और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पर रखें। 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र को कीटाणुरहित करें और कार्यक्षेत्र पर एक बेंच कवर सुरक्षित करें। जब कार्य क्षेत्र तैयार हो जाता है, तो आंखों को 50 मिलीमीटर के टुकड़े पर रखें और एक हाथ से पीछे के खंड को समझने के लिए धुंध का उपयोग करें।30 गेज सुई का उपयोग करके, ध्यान से आंख की एपिथेलियल सतह के केंद्र में एक पंचर बनाएं, स्ट्रोमा को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें, और कॉर्निया से एक मिलीमीटर दूरी पर स्क्लेरा पर एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए एक तेज निष्फल ब्लेड का उपयोग करें। हाथ की एक तेज और चिकनी घूर्णन कार्रवाई का उपयोग करना और ध्यान रखना कि विट्रेस हास्य लीक नहीं करता है, कॉर्निया के किनारे को काटें और कॉर्निया-स्क्लेरा किनारे पर एक फ्लैट चिमटी के साथ पकड़े, शेष टेथरिंग झिल्ली को काटने के लिए ब्लेड का उपयोग करें। के रूप में प्रत्येक कॉर्निया अलग है, ऊतकों को एक 12 अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से कॉर्निया माध्यम के दो मिलीलीटर युक्त थाली के व्यक्तिगत कुओं में सामना करना पड़ता है और प्रत्येक कॉर्नियल सतह पर debrided साइट के लिए 17 GFP वायरस समाधान की पांच बार 10 के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें ।जब कॉर्निया के सभी एकत्र किया गया है, ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली में जगह, ५% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर ७२ घंटे के लिए और किसी भी अतिरिक्त बायोहैजार्ड बैग में अपने सुरक्षित निपटान के लिए 10% ब्लीच के साथ प्रयोग में इस्तेमाल नहीं आंखों स्प्रे । दवाओं के अलावा से पहले हर दिन, कॉर्निया की प्लेट को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और जीएफपी फिल्टर और 500 माइक्रोसेकंड एक्सपोजर समय का चयन करें। बढ़ते आवर्धन की एक श्रृंखला में कॉर्निया इमेजिंग से पहले सबसे कम आवर्धन पर छवियों को कैप्चर करें जब तक कि वायरल प्रसार और डेंड्राइट गठन के सभी स्पष्ट रूप से कल्पना नहीं की जा सकती है।जब कॉर्निया के सभी छवि गया है, ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए थाली वापस । संक्रमण से पहले दिन, प्रति वॉश पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार एक कॉन्फ्ल्यूटी वेरो सेल संस्कृति को धोएं, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच से 10 मिनट के लिए प्रति अच्छी तरह से 0.05% ट्राइपसिन के एक मिलीलीटर के साथ इलाज करें। जब कोशिकाओं को अलग कर दिया है, पूरे माध्यम के नौ मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से फ्लास्क सतह से उखाड़ फेंकना और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन हस्तांतरण ।एक नई छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के ३०० माइक्रोलीटर जोड़ें, प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम के दो मिलीलीटर के अलावा के बाद, तो सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली रात भर जगह है । अगली सुबह, मात्राकरण के लिए प्रत्येक कॉर्निया से वायरस इकट्ठा करने के लिए, कम से कम पांच मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में कई माइक्रोसेंफ्टी ट्यूबों में सीरम-मुक्त माध्यम प्रति झाड़ू के 500 माइक्रोलीटर में बाँझ कपास झाड़ू युक्तियां भिगोएं। इनक्यूबेशन के अंत में, संक्रमित पोर्सिन कॉर्निया संस्कृतियों को कैबिनेट में सावधानी से रखें।गीले सूती झाड़ू का उपयोग करके, अत्यधिक दबाव लागू किए बिना प्रत्येक संक्रमित पोर्सिन कॉर्निया के केंद्र से तीन क्रांतियों को दक्षिणावर्त और तीन क्रांतियां दक्षिणावर्त पांच मिलीमीटर बनाएं। क्रांतियों की श्रृंखला के अंत में, झाड़ू काटने से पहले अपने सीरम-मुक्त मध्यम से भरे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब क्लॉकवाइज और एंटीक्लॉकवाइज में प्रत्येक झाड़ू को पांच बार घुमाएं ताकि युक्तियां ढक्कन के साथ प्रत्येक ट्यूब के भीतर फिट हो जाएं। जब कॉर्निया के सभी swabbed किया गया है, एक मिनट के लिए उच्च गति से ट्यूब भंवर ।प्रत्येक कॉर्निया से एकत्र वायरस की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में सीरम-मुक्त माध्यम में वायरस का एक log10 एक गुना कमजोर पड़ने तैयार करें जब तक कि नकारात्मक आठ में एक गुना 10 का कमजोर पड़ने तक पहुंच न जाए । कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं से विकास माध्यम को प्राप्त करने के बाद, प्रत्येक वायरस कमजोर पड़ने के एक मिलीलीटर को एक बार 10 से शुरू होकर नकारात्मक तीन को प्लेटेड सेल मोनोलेयर में स्थानांतरित करें और संक्रमित कोशिकाओं को दो घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, धीरे से एक ७२ घंटे के इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से मिथाइलसेलुलोस से लदी माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ने से पहले PBS के साथ दो बार अच्छी तरह से धोने या सजीले टुकड़े के गठन तक मनाया जा सकता है ।पट्टिका अवलोकन पर, धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक कुएं के कोने में मेथनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में, धीरे-धीरे सेल मोनोलेयर को परेशान किए बिना प्रत्येक कुएं से सामग्री को एस्पिरेट करें। इसके बाद, प्रत्येक को क्रिस्टल वायलेट वर्किंग सॉल्यूशन के एक मिलीलीटर के साथ लेबल करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि सभी कोशिकाओं को प्रकाश से संरक्षित 30 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए कवर किया जाता है।इनक्यूबेशन के अंत में, समाधान को त्यागें और शोषक कागज की शीट पर कुओं को सुखाएं, फिर शुरुआती समाधान में कुल वायरस सामग्री को तीन बार निर्धारित करने के लिए उच्चतम कमजोर पड़ने पर सजीले टुकड़े की संख्या गिनें। जैसा कि इस स्टीरियोस्कोपिक फ्लोरेसेंस इमेजिंग विश्लेषण में देखा गया है, BX795 की एंटीवायरल प्रभावकारिता वायरल प्रसार को नियंत्रित करने में टीएफटी के समान है, जबकि वाहन के साथ इलाज किए जाने वाले कॉर्निया केवल प्रारंभिक वायरल टीका के बाद छह दिनों तक केंद्रीय संक्रमण क्षेत्र से परिधि में वायरस के प्रसार को प्रदर्शित करते हैं। इसी तरह, दो और चार के बाद संक्रमण के दिनों में लिया नेत्र झाड़ू सकारात्मक नियंत्रण और BX795-इलाज नमूनों में वायरस का एक पूरा निषेध प्रदर्शन, जबकि संक्रामक वायरस टाइटर में तेजी से वृद्धि नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में देखा जाता है ।पूरी पोर्सिन आंख से पोर्सिन कॉर्निया का अलगाव सबसे महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रक्रिया में चरण 2.3 से 2.6 सबसे महत्वपूर्ण हैं। हमारे मॉडल का उपयोग पोर्सिन कॉर्निया में वायरस के डेंड्रिटिक फैलाव को समझने के लिए किया जा सकता है।इस विधि को बैक्टीरियल और फंगल संक्रमणों की ओर भी बढ़ाया जा सकता है। इस विधि ने मानव मॉडल के बाहर कॉर्निया में वायरस के डेंड्रिटिक फैलाव की कल्पना करने में मदद की है। यह मॉडल पशु और मानव परीक्षणों की ओर बढ़ने से पहले दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने में सहायक है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग करने के लिए दरार घाटी बुखार वायरस सांसद 12 वैक्सीन सुरक्षा और प्रभावकारिता में सुधार तनाव के एनएसएस जीन हेरफेर

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

हरपीज के अध्ययन के लिए एक प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति सिस्टम वायरस लेटेंसी और पुनर्सक्रियण सिंप्लेक्स

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

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कृत्रिम थूक मध्यम का प्रयोग खिलाफ टेस्ट एंटीबायोटिक प्रभावकारिता<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़े अधिक प्रासंगिक शर्तों में

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals की पहचान के लिए assays

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

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दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 के साथ Murine एपिडर्मिस के पूर्व vivo संक्रमण

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

प्रतिदीप्ति आधारित neuraminidase निषेध परख विषाणु-विरोधी की neuraminidase अवरोध करनेवाला वर्ग के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

उभरते संक्रमित रोगजनकों को हटाने के लिए हाथ धोने की प्रभावकारीता का परीक्षण करने के लिए एक विधि

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

ओवेरेक्स्पेशन एंड हेरिंग ऑफ ह्यूमन<em&gt; सीआईएस</em&gt; -प्रेनिलट्रांसफ़्रेज़ इन<em&gt; एस्चेरिचिया कोली</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...