Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 e RO1 EY029426) a D.S. A.A. è stato supportato da una sovvenzione F30EY025981 del National Eye Institute, NIH. Lo studio è stato condotto utilizzando le cornee suine ottenute dalla società Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Tutto il tessuto suino utilizzato in questo studio è stato fornito da un'organizzazione privata di terze parti e nessuna delle manipolazioni degli animali è stata eseguita dal personale dell'Università dell'Illinois a Chicago.
1. Materiali
<ol><li>
Reagenti
	<ol>
<li>Utilizzare i seguenti reagenti per il test della placca: metilcellulosa in polvere, dmEM (Dulbecco's modified eagle' medium), siero bovino fetale (FBS), penicillina e streptomicina (P/S) per il test della pla...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Ricerche precedenti hanno dimostrato che BX795 ha un ruolo promettente come agente antivirale contro l'infezione da HSV-1; inibendo la chinasi 1 (TBK1)16che lega il serbatoio. Sia il TBK1 che l'autofagia hanno svolto un ruolo nell'aiutare a inibire l'infezione da HSV-1 come dimostrato sulle cellule epiteliali corneali umane. BX795 ha dimostrato di essere massimamente efficace con l'attività antivirale ad una concentrazione di 10μM e utilizzando sia l'analisi western blot che l'analisi della plac...

Le persone che soffrono di infezioni oculari spesso incorrono in perdita dellavista 1. Con un'elevata sieroprevalenza in tutto il mondo, gli individui infetti da HSV soffrono di infezioni oculari ricorrenti che portano a cicatrici corneali, cheratite stromale e neovascolarizzazione2,3,4,5. Le infezioni da HSV hanno anche dimostrato di causare meno frequentemente, una serie di condizioni gravi tra i pazienti immunocompromessi e non trattati come l'encefalite e la morbilità sistemica6,7,8. Farmaci come aciclovir (ACV) e i suoi analoghi nucleosidici hanno mostrato un successo costante nel frenare l'infezione da HSV-1 e persino controllare la riattivazione, ma l'uso prolungato di questi farmaci è associato a insufficienza renale, anomalie fetali e incapacità di limitare l'emergere di resistenza ai farmaci ai ceppi virali in evoluzione9,10,11,12,13. Le complessità associate alle infezioni oculari da HSV-1, sono state precedentemente studiate in vitro utilizzando monostrati e colture 3D di cellule corneali umane e in vivo utilizzando infezioni oculari murine o di coniglio. Mentre questi modelli in vitro forniscono dati significativi sulle componenti biologiche cellulari delle infezioni da HSV-1, tuttavia, non riescono a imitare l'intricata complessità del tessuto corneale e fanno poco per illuminare la diffusione dendritica del virus14. Al contrario, sebbene i sistemi in vivo siano più perspicaci nel mostrare la diffusione dell'infezione nelle cornee e le risposte di attivazione immunitaria durante l'infezione da HSV-1, vengono con l'avvertenza che richiedono investigatori addestrati e grandi strutture per la cura degli animali per trascurare gli esperimenti.
Qui usiamo le cornee suini come modello ex vivo per esaminare il sistema di ferite indotte dall'infezione da HSV-1. Sia la potenziale farmacologia di alcuni farmaci che la biologia cellulare e molecolare del sistema della ferita causata dall'infezione possono essere studiate attraverso colture di espianto tissutale. Questo modello può anche essere modificato per l'uso per altre infezioni virali e batteriche pure. In questo studio, le cornee suini sono state utilizzate per testare l'efficacia antivirale di una piccola molecola preclinica, BX795. L'uso di cornee suini è stato preferito a causa della facilità di accesso e dell'economicità. Inoltre, i modelli corneali suini sono buoni modelli di occhi umani con le cornee facili da isolare, adeguatamente dimensionate per l'infezione e la visualizzazione e robuste da gestire15. Le cornee suini sono anche paragonabili alla complessità dei modelli corneali umani sia nella permeabilità trans corneale che nell'assorbimento sistemico15. Utilizzando questo modello per lo studio, siamo stati in grado di chiarire come BX795 sia degno di ulteriori indagini come inibitore competente dell'infezione da virus HSV-1 e si aggiunge alla letteratura di classificarlo come potenziale composto antivirale a piccola molecola16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Virus e batteri possono causare una varietà di difetti della superficie oculare e degenerazione come ferite e ulcere attraverso l'infezione corneale. Con una sieroprevalenza che varia dal 60-90% in tutto il mondo, l'Herpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV-1) provoca comunemente lesioni mucocutanee della regione orofacciale che si manifestano anche come lesioni e cecità associata all'infezione. Mentre gli attuali farmaci antivirali sono efficaci, l'emergere di resistenza e persistenza di effetti collaterali tossici richiede lo sviluppo di nuovi antivirali contro questo agente patogeno onnipresente. Sebbene la valutazione in vitro fornisca alcuni dati funzionali riguardanti un antivirale emergente, non dimostrano la complessità del tessuto oculare in vivo. Tuttavia, gli studi in vivo sono costosi e richiedono personale qualificato, specialmente quando si lavora con agenti virali. Quindi i modelli ex vivo sono passaggi efficienti ma poco costosi per i test antivirali. Qui discutiamo un protocollo per studiare l'infezione da HSV-1 utilizzando cornee suini ex vivo e un metodo per trattarle localmente usando farmaci antivirali esistenti e nuovi. Dimostriamo anche il metodo per eseguire un test della placca utilizzando HSV-1. I metodi dettagliati possono essere utilizzati per condurre esperimenti simili per studiare infezioni che assomigliano al patogeno HSV-1.

Per comprendere l'efficacia degli antivirali sperimentali, devono essere ampiamente testati prima di essere inviati per studi clinici umani in vivo. A questo proposito, devono essere identificati i gruppi di controllo positivo, controllo negativo e test. La trifluorothymidina (TFT) è stata a lungo utilizzata come trattamento preferito per trattare l'herpes cheratite topicamente16. Usato come controllo positivo, i gruppi corneali trattati con TFT mostrano una minore diffusione dell'infezione. Come...

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Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Descriviamo l'uso di una cornea suina per testare l'efficacia antivirale dei farmaci sperimentali.

Espianto di tessuto corneale suino per studiare l'efficacia degli antivirali Herpes Simplex Virus-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Comprendere l'efficacia dei farmaci nei modelli animali è costoso e laborioso. Il nostro protocollo che utilizza un modello di espianto tissutale ex vivo è significativamente inferiore sia in termini di costi che di personale scientifico richiesto per condurre lo studio. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di occhi suini, che hanno anatomia e fisiologia molto simili agli occhi umani rispetto ad altri piccoli modelli animali.Quando testiamo i farmaci in vitro, potrebbero mostrare un'efficacia che potrebbe essere assente nei modelli animali o umani. I sistemi tissutali ex vivo sono il modo migliore per capire se i nostri sistemi in vitro possono essere tradotti o meno in sperimentazioni animali e umane. Il sistema corneale suino, sebbene meno laborioso, richiede competenze addestrabili per isolare, mantenere, infettare e trattare con i farmaci, in particolare il processo di isolamento della cornea dall'intero occhio suino è difficile da esprimere a parole, ma richiede una dimostrazione visiva.Dopo aver ricevuto gli occhi suini da un fornitore adatto, conservare i tessuti sul ghiaccio fino alla lavorazione e indossare l'apposito dispositivo di protezione individuale. Disinfettare l'area di lavoro con etanolo al 70% e fissare una copertura del banco sullo spazio di lavoro. Quando l'area di lavoro è pronta, posizionare gli occhi su un pezzo di garza da 50 millimetri e utilizzare la garza per afferrare la sezione posteriore con una mano.Usando un ago calibro 30, fai con attenzione una singola puntura approssimativamente al centro della superficie epiteliale dell'occhio, facendo attenzione a non danneggiare lo stroma, e usa una lama sterilizzata affilata per fare una piccola incisione sulla sclera a una distanza di un millimetro dalla cornea. Usando un'azione rotante rapida e liscia della mano e facendo attenzione che l'umore vitreo non perda, tagliare il bordo della cornea e tenere la cornea sul bordo cornea-sclera con una pinzetta piatta, utilizzare la lama per tagliare le restanti membrane di tethering. Quando ogni cornea è isolata, posizionare i tessuti rivolti verso l'alto in singoli pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenente due millilitri di terreno corneale per pozzetti e aggiungere cinque microlitri di cinque volte 10 alla quinta unità di formazione della placca di 17 soluzioni di virus GFP al sito di detriti su ciascuna superficie corneale.Quando tutte le cornee sono state raccolte, posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius al 5% per 72 ore e spruzzare eventuali occhi aggiuntivi non utilizzati nell'esperimento con candeggina al 10% per il loro smaltimento sicuro in sacchetti a rischio biologico. Ogni giorno prima dell'aggiunta di farmaci, posizionare la piastra di cornee sotto uno stereomicroscopio e selezionare il filtro GFP e un tempo di esposizione di 500 microsecondi. Cattura le immagini al minimo ingrandimento prima di visualizzare le cornee con una serie di ingrandimenti crescenti fino a quando tutta la diffusione virale e la formazione di dendrite possono essere visualizzate chiaramente.Quando tutte le cornee sono state immaginate, restituire la piastra all'incubatore di colture tissutali. Il giorno prima dell'infezione, lavare una coltura cellulare vera confluente due volte con 10 millilitri di PBS per lavaggio e trattare le cellule con un millilitro di 0,05% tripsina per pozzetto per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, utilizzare nove millilitri di mezzo intero per assicurarsi che le cellule si spostino completamente dalla superficie del pallone e trasferiscano la sospensione cellulare risultante in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Aggiungere 300 microlitri di cellule a ciascun pozzetti di una nuova piastra a sei pozzi, seguita dall'aggiunta di due millilitri di terreno a ciascun pozzettino, quindi posizionare la piastra nell'incubatore di colture cellulari durante la notte. La mattina dopo, per raccogliere il virus da ciascuna cornea per la quantificazione, immergere le punte sterili del batuffolo di cotone in 500 microlitri di mezzo privo di siero per tampone in più tubi di microcentrifuga in un armadietto di biosicurezza per almeno cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, posizionare con cura le colture di cornea suina infette nell'armadio.Utilizzando i tamponi di cotone bagnati, fare tre giri in senso orario e tre giri in senso antiorario a cinque millimetri dal centro di ogni cornea suina infetta senza applicare una pressione eccessiva. Alla fine della serie di giri, ruotare ogni tampone nel suo tubo microcentrifugale riempito di siero medio cinque volte in senso orario e antiorario prima di tagliare i tamponi in modo che le punte si adattino a ciascun tubo con il coperchio chiuso. Quando tutte le cornee sono state tamponate, vortice i tubi ad alta velocità per un minuto.Per quantificare la quantità di virus raccolto da ciascuna cornea, preparare una diluizione log10 di una volta del virus in mezzo privo di siero in tubi di microcentrifuga fino a raggiungere una diluizione di una volta 10 a otto negativi. Dopo aver aspirato il mezzo di crescita da ciascun pozzo di cellule, trasferire un millilitro di ciascuna diluizione virale a partire da una volta 10 ai tre negativi ai monostrati cellulari placcati e posizionare le cellule infette nell'incubatore di colture cellulari per due ore. Alla fine dell'incubazione, lavare delicatamente ogni pozzetti due volte con PBS prima di aggiungere due millilitri di mezzo carico di metilcellulosa a ciascun pozzetti per un'incubazione di 72 ore o fino a quando non si può osservare la formazione di placche.Dopo l'osservazione della placca, aggiungere lentamente un millilitro di metanolo all'angolo di ciascun pozzetto per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, aspirare lentamente il contenuto da ciascun pozzetti senza disturbare il monostrato cellulare. Quindi, etichettare ogni pozzetto con un millilitro di soluzione di lavoro viola cristallino, facendo attenzione che tutte le cellule siano coperte per un'incubazione di 30 minuti protetta dalla luce.Alla fine dell'incubazione, scartare la soluzione e asciugare i pozzezze a secco su un foglio di carta assorbente, quindi contare il numero di placche al pozzo di diluizione più alto per quantificare il contenuto totale del virus nella soluzione iniziale tre volte. Come osservato in questa analisi di imaging a fluorescenza stereoscopica, l'efficacia antivirale di BX795 è simile a quella del TFT nel controllo della diffusione virale, mentre le cornee trattate con veicolo dimostrano solo la diffusione del virus dalla zona centrale di infezione alla periferia entro sei giorni dall'inoculazione virale iniziale. Allo stesso modo, i tamponi oculari prelevati nei giorni due e quattro post-infezione mostrano una completa inibizione del virus nei campioni di controllo positivi e trattati con BX795, mentre un forte aumento del titolo del virus infettivo si osserva nei campioni di controllo negativi.L'isolamento della cornea suina da tutto l'occhio suino è il passo più importante. I passaggi da 2.3 a 2.6 sono i più cruciali in questo processo. Il nostro modello può essere utilizzato per comprendere la diffusione dendritica del virus nelle cornee suini.Questo metodo può essere esteso anche alle infezioni batteriche e fungine. Questo metodo ha aiutato a visualizzare la diffusione dendritica del virus nelle cornee al di fuori di un modello umano. Questo modello è utile per testare l'efficacia dei farmaci prima di passare a studi su animali e umani.

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Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Un metodo per testare l&#39;efficacia della lavata a mano per la rimozione di nuovi patogeni infettivi

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...