Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
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이 연구는 NIH 보조금 (R01 EY024710, RO1 AI139768 및 RO1 EY029426)에 의해 지원되었다. 연구 는 파크 패킹 회사에서 얻은 돼지 각막을 사용하여 실시되었다, 4107 애슐랜드 애비뉴, 뉴 시티, 시카고, IL-60609

이 연구에 사용된 모든 돼지 조직은 제 3 자 민간 조직에 의해 제공되었으며 시카고 직원의 일리노이 대학에 의해 동물 취급이 수행되지 않았습니다.
1. 재료
<ol><li>
시약
	<ol>
<li>플라크 분석시 다음 시약을 사용하십시오: 분말 메틸셀룰로오스, 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 페니실린 및 연쇄 절제술(P/S)을 플라크 분석용으로 사용하십시오....

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

이전 연구는 BX795 HSV-1 감염에 대 한 항 바이러스 에이전트로 유망한 역할을 보여 주었다; TANK 결합 키나아제 1 (TBK1)16을억제함으로써. TBK1과 자가식 모두 인간 각막 상피 세포에서 입증된 바와 같이 HSV-1 감염을 억제하는 데 중요한 역할을 했습니다. BX795는 10μM의 농도에서 항바이러스 활성을 최대한 효과적으로 효과적이높은 것으로 나타났으며, 주요 바이러스 성 단백질의 서양 블...

안구 감염으로 고통받는 사람들은 종종 시력 상실1을발생시다. 전 세계적으로 높은 혈청병으로, HSV 감염된 개별은 각막 흉터, 기질 각질염 및 신생 혈관 화2,3,4,5로이끌어 내는 되풀이눈 감염 때문에 손해를 입습니다. HSV 감염은 또한 덜 빈번하게 일으키는 원인이 되는 것을 보여주었습니다, 면역 손상중 심각한 조건의 범위, 뇌염 및 전신 이환 과 같은 치료되지 않는 환자6,7,8. Acyclovir 같은 약물 (ACV) 그리고 그것의 뉴클레오시드 유사체는 HSV-1 감염을 억제하고 심지어 재활성화를 통제에 일관된 성공을 보여주었지만, 이러한 약물의 장기간 사용은 신장 실패, 태아 이상 및 진화 하는 바이러스 균주에 약물 저항의 출현을 제한 하는실패9,10,11,12,13. HSV-1 안구 감염과 관련되었던 복잡성은, 이전에 인간 각막 세포의 단층 및 3D 배양을 사용하여 시험관내에서 연구되고 murine 또는 토끼 안구 감염을 사용하여 생체내에서 공부되었습니다. 이러한 체외 모델은 HSV-1 감염의 세포 생물학적 구성 요소에 대한 중요한 데이터를 제공하지만, 그러나 각막 조직의 복잡한 복잡성을 모방하지 못하고 바이러스14의수지상 확산을 조명하는 데 거의 영향을 미치지 않는다. 대조적으로, 생체 내 시스템은 HSV-1 감염 도중 각막 및 면역 활성화 반응에 있는 감염 퍼짐을 보여주는에 있는 더 통찰력이 있더라도, 그(것)들은 실험을 간과하기 위하여 동물 배려를 위한 훈련된 조사자 및 큰 시설이 필요하다는 주의와 함께 옵니다.
여기서 우리는 HSV-1 감염 유도 상처 시스템을 검사하기 위해 전 생체 모델으로 돼지 각막을 사용합니다. 감염에 기인한 상처 시스템의 세포 및 분자 생물학뿐만 아니라 특정 약물의 잠재적 인 약리학은 조직 각성 배양을 통해 연구 될 수있다. 이 모형은 또한 그밖 바이러스성 및 세균성 감염을 위한 사용을 위해 개정될 수 있습니다. 이 연구에서는, 돼지 각막은 전임상 소분자, BX795의 항바이러스 효능을 시험하기 위해 사용되었다. 돼지 각막의 사용은 접근의 용이성과 비용 효과때문에 선호되었다. 또한, 돼지 각막 모델은 각막이 분리되기 쉽고 감염 및 시각화를 위한 적절한 크기이며15를처리할 수 있는 견고한 것으로 인간의 눈의 좋은 모델입니다. 돼지 각막은 또한 트랜스 각막 투과성 및 전신 흡수15모두에서 인간 각막 모델의 복잡성과 유사하다. 연구를 위해 이 모델을 사용하여, 우리는 BX795가 HSV-1 바이러스 감염의 유능한 억제제로 추가 조사의 가치가 있는 방법을 설명할 수 있었고 잠재적인 소분자 항바이러스화합물(16)으로분류하는 문헌에 추가하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

바이러스 및 박테리아는 각막 감염을 통해 상처 및 궤양과 같은 다양한 안구 표면 결함 및 변성을 일으킬 수 있습니다. 전 세계적으로 60-90%의 혈청률을 가지면 포진 심플렉스 바이러스 유형-1(HSV-1)은 일반적으로 병변 및 감염 관련 실명으로 나타나는 오로페이셜 영역의 점막 병변을 유발합니다. 현재 항 바이러스 약물은 효과적인 동안, 저항의 출현 및 독성 부작용의 지속이 유비쿼터스 병원체에 대 한 새로운 항 바이러스의 개발을 필요로. 체외 평가는 신흥 항 바이러스에 관한 몇 가지 기능적 데이터를 제공하지만 생체 내에서 안구 조직의 복잡성을 입증하지는 않습니다. 그러나 생체 내 연구는 비싸고 특히 바이러스 성 에이전트와 함께 작업 할 때 숙련 된 인력이 필요합니다. 따라서 ex vivo 모델은 항 바이러스 검사를위한 효율적이면서도 저렴한 단계입니다. 여기서 우리는 돼지 각막 전 생체를 사용하여 HSV-1에 의감염을 연구하는 프로토콜과 기존 및 새로운 항 바이러스 약물을 사용하여 국소적으로 치료하는 방법에 대해 논의합니다. 우리는 또한 HSV-1을 사용하여 플라크 분석법을 수행하는 방법을 시연한다. 상세한 방법은 HSV-1 병원체를 닮은 감염을 공부하기 위하여 유사한 실험을 수행하기 위하여 이용될 수 있습니다.

실험적인 항 바이러스의 효능을 이해하려면 생체 내 인체 임상 시험을 위해 전송되기 전에 광범위하게 테스트해야합니다. 이와 관련하여, 긍정적 인 제어, 부정적인 제어 및 테스트 그룹을 식별해야합니다. 트리플루오로티미딘(TFT)은 오랫동안 헤르페스 각막염을국소적으로치료하는 바람직한 치료법으로 사용되어 왔다. 양성 대조군으로 사용, TFT 처리 각막 그룹은 낮은 감염 확?...

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Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

우리는 실험 약물의 항 바이러스 효능을 테스트하기 위해 돼지 각막의 사용을 설명합니다.

포신 각막 조직 은 포진 심플렉스 바이러스-1 항 바이러스의 효능을 연구하기 위해 퇴치

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

동물 모델에서 약물의 효능을 이해하는 것은 비용과 노동 집약적입니다. 전 생체 조직 각성 모델을 사용하는 우리의 프로토콜은 연구를 수행하는 데 필요한 비용과 과학 인력 모두에서 크게 낮습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 작은 동물 모델과 는 달리 해부학 및 생리학이 인간의 눈과 매우 유사한 돼지 눈의 사용입니다.우리가 체외에서 약물을 테스트 할 때, 그들은 동물 이나 인간의 모델에 없을 수 있습니다 효능을 표시할 수 있습니다. Ex vivo 조직 시스템은 우리의 체외 시스템이 동물 및 인체 실험으로 변환 될 수 있는지 여부를 이해하는 가장 좋은 방법입니다. 돼지 각막 시스템은 노동 집약적이지만 약물로 분리, 유지, 감염 및 치료할 수 있는 훈련 가능한 기술이 필요하며, 특히 전체 돼지 눈에서 각막을 분리하는 과정은 말로 표현하기 는 까다롭지만 시각적 인 데모가 필요합니다.적합한 공급 업체로부터 돼지 눈을 받으면 처리 될 때까지 조직을 얼음에 보관하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 작업 영역을 70%에탄올로 소독하고 작업 공간에 벤치 커버를 고정합니다. 작업 영역이 준비되면 50밀리미터 의 거즈 조각에 눈을 놓고 거즈를 사용하여 한 손으로 후방 섹션을 잡습니다.30 게이지 바늘을 사용하여, 조심스럽게 눈의 상피 표면의 중심에 하나의 펑크를 만들고, 스트로마를 손상시키지 않도록주의하고, 각막에서 1 밀리미터 거리에서 clera에 작은 절개를 만들기 위해 날카로운 살균 블레이드를 사용합니다. 손의 신속하고 부드러운 회전 작용을 사용하여 유리악 유머가 누출되지 않도록주의하고, 각막의 가장자리를 잘라 평평한 트위저로 각막 가장자리를 잡고, 나머지 테더링 멤브레인을 잘라 블레이드를 사용합니다. 각막이 고립됨에 따라, 조직을 12웰 플레이트의 개별 우물로 배치하여 각막 매질의 2밀리리터를 함유하고 각막 표면의 디스브라이드 부위에 17GFP 바이러스 용액의 5배 10번의 마이크로리터를 5배 10번 의 마이크로리터를 추가한다.모든 각막을 채취하면 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%를 72시간 동안 넣고 실험에 사용하지 않는 추가 눈을 10%의 표백제로 분사하여 생물학적 위험에 드는 가방에 안전하게 처리합니다. 약물을 첨가하기 전에 매일 각막 판을 스테레오 현미경으로 놓고 GFP 필터와 500 마이크로초 노출 시간을 선택합니다. 모든 바이러스 확산 및 수상자 형성이 명확하게 시각화 될 때까지 증가 배율의 시리즈에서 각막을 이미징하기 전에 가장 낮은 배율에서 이미지를 캡처합니다.각막의 모든 이미지가 이미지되었을 때, 조직 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 감염 전날, 세척당 PBS 10 밀리리터로 컨물린 베로 세포 배양을 두 번 세척하고, 섭씨 37도에서 5~10분 동안 잘 1밀리리터당 0.05%의 트립신으로 세포를 치료한다. 세포가 분리되면 전체 배지의 9 밀리리터를 사용하여 세포가 플라스크 표면에서 완전히 빠져나와 결과 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심분리기로 전달합니다.300 마이크로리터의 셀을 새로운 6개의 웰 플레이트에 넣고, 그 다음에 각각 의 양산에 2밀리리터를 첨가한 다음 하룻밤 동안 세포 배양 배양에 플레이트를 놓습니다. 다음 날 아침, 각 각막에서 바이러스를 수집하여 정량화를 위해, 멸균 면봉 팁을 생물 안전 캐비닛에 여러 마이크로센티심심분리기 튜브에 봉제당 500 마이크로리터에 500마이크로리터를 흡수하여 최소 5분간 생체 안전 캐비닛에 넣습니다. 인큐베이션의 끝에, 조심스럽게 캐비닛에 감염된 돼지 각막 문화를 배치.젖은 면봉을 사용하여 시계 방향으로 3개의 회전을 만들고, 과도한 압력을 가하지 않고 감염된 각막의 중심에서 시계 방향으로 5밀리미터 의 세 가지 회전을 만듭니다. 일련의 회전이 끝나면 각 면봉을 세럼이 없는 중간 크기의 마이크로센트리슈에이체 튜브를 시계 방향으로 5번 회전한 후 면봉을 절단하여 뚜껑이 닫혀 있는 각 튜브 에 팁이 들어갈 수 있도록 합니다. 각막이 모두 스왑되었을 때 튜브를 1 분 동안 고속으로 소용돌이시킵니다.각 각막에서 수집된 바이러스의 양을 정량화하기 위해, 10배에서 음수 8로 1회 희석될 때까지 마이크로센트심분리기 튜브내혈청 이질이 없는 배지에서 바이러스의 1배 희석을 준비한다. 세포의 각 우물에서 성장 배지를 흡수 한 후, 각 바이러스 희석의 1 밀리리터를 10번에서 음수 3개로 도금 된 세포 단층으로 옮기고 감염된 세포를 세포 배양 배양에 2 시간 동안 배치한다. 인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 72 시간 배양 또는 플라크의 형성이 관찰 될 때까지 각 우물에 메틸 셀룰로오스 라덴 매체의 두 밀리리터를 추가하기 전에 PBS와 함께 각각 두 번 잘 세척한다.플라크 관찰 시, 실온에서 15분 간 배양하기 위해 각 우물 구석에 메탄올 1밀리리터를 천천히 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 천천히 세포 단층을 방해하지 않고 각 우물에서 내용을 흡인. 다음으로, 모든 세포가 빛으로부터 보호되는 30분 간 잠복이 보장되는 것을 주의하여 크리스탈 바이올렛 작동 용액 1밀리리터로 각각 라벨을 붙입니다.인큐베이션의 끝에서, 용액을 버리고 흡수성 용지 시트에 우물을 건조한 다음, 시작 용액의 총 바이러스 함량을 세 번 정량화하기 위해 가장 높은 희석에서 플라크 수를 세어한다. 이러한 입체 형광 영상 분석에서 관찰된 바와 같이, BX795의 항바이러스 효능은 바이러스 확산을 제어하는 TFT와 유사하며, 차량으로 치료된 각막은 6일 후 바이러스 접종까지 중앙 감염 영역에서 주변으로 바이러스의 확산을 입증한다. 유사하게, 감염 후 2일과 4일에 취한 안구 면봉은 양성 대조군 및 BX795 처리된 견본에 있는 바이러스의 완전한 억제를 나타내며, 감염성 바이러스 티터의 급격한 증가는 음성 대조료에서 관찰된다.전체 돼지 눈에서 돼지 각막의 분리가 가장 중요한 단계입니다. 2.3에서 2.6 단계는이 과정에서 가장 중요합니다. 우리의 모형은 돼지 각막에 있는 바이러스의 수지상 퍼짐을 이해하기 위하여 이용될 수 있습니다.이 방법은 세균성 및 곰팡이 감염으로확장될 수 있습니다. 이 방법은 인간 모형 외부 각막에 있는 바이러스의 수지상 퍼짐을 시각화하는 것을 도왔습니다. 이 모델은 동물 및 인체 실험으로 이동 하기 전에 약물의 효능을 테스트에 도움이 됩니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

연구

면역학 및 감염병학

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

신생 전염병 병원체 제거를위한 손씻기의 효능을 시험하는 방법

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...