Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Denne studien ble støttet av NIH-tilskudd (R01 EY024710, RO1 AI139768 og RO1 EY029426) til D.S. A.A. ble støttet av et F30EY025981-stipend fra National Eye Institute, NIH. Studien ble utført ved hjelp av svine corneas hentet fra Park Packing company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Alt svinevevet som ble brukt i denne studien ble levert av en tredjeparts privat organisasjon, og ingen av dyrehåndteringene ble utført av University of Illinois hos Chicago-personell.
1. Materialer
<ol><li>
Reagenser
	<ol>
<li>Bruk følgende reagenser for plakkanalyse: pulvermetylcellulose, Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM), føtal bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin (P/S) for plakkanalyse.</li>
		<li>Bruk krystallfiolette tabletter og etanol (molekylær...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Tidligere forskning har vist at BX795 har en lovende rolle som antiviralt middel mot HSV-1-infeksjon; ved å hemme TANK-bindende kinase 1 (TBK1)16. Både TBK1 og autofagi har spilt en rolle i å hemme HSV-1 infeksjon som demonstrert på humane hornhinnen epitelceller. BX795 ble vist å være maksimalt effektiv med antiviral aktivitet i en konsentrasjon på 10μM og ved hjelp av både vestlig blotanalyse og viral plakkanalyse av viktige virusproteiner, BX795 ble vist å hemme HSV-1 infeksjon som ka...

Personer som lider av okulære infeksjoner pådrar seg ofte synstap1. Med høy seroprevalens over hele verden lider HSV-infiserte individer av tilbakevendende øyeinfeksjoner som fører til hornhinnen arrdannelse, stromal keratitt og neovascularization2,3,4,5. HSV-infeksjoner har også vist seg å forårsake sjeldnere, en rekke alvorlige tilstander blant immunkompromitterte, ubehandlede pasienter som encefalitt og systemisk sykelighet6,7,8. Legemidler som Acyclovir (ACV) og dens nukleosidanaloger har vist konsistent suksess med å dempe HSV-1-infeksjon og til og med kontrollere reaktivering, men langvarig bruk av disse stoffene er forbundet med nyresvikt, fosteravvik og manglende begrensning av fremveksten av legemiddelresistens mot utviklende virusstammer9,10,11,12,13. Kompleksiteter forbundet med HSV-1 okulære infeksjoner, har tidligere blitt studert in vitro ved hjelp av monolayers og 3D-kulturer av menneskelige hornhinneceller og in vivo ved hjelp av murine eller kanin okulære infeksjoner. Mens disse in vitro-modellene gir betydelige data om de cellulære biologiske komponentene i HSV-1-infeksjoner, klarer de imidlertid ikke å etterligne den intrikate kompleksiteten i hornhinnen vev og gjør lite for å belyse den dendrittiske spredningen av viruset14. Derimot, selv om in vivo-systemer er mer innsiktsfulle i å vise infeksjon spredt i hornhinner og immunaktiveringsresponser under HSV-1-infeksjon, kommer de med advarselen om at de krever trente etterforskere og store fasiliteter for dyrepleie for å overse forsøkene.
Her bruker vi porcin hornhinner som en ex vivo modell for å undersøke HSV-1 infeksjon indusert sår system. Både den potensielle farmakologien til visse legemidler samt sårets celle- og molekylærbiologi forårsaket av infeksjonen kan studeres gjennom vevsekstlantkulturer. Denne modellen kan også endres for bruk til andre virus- og bakterieinfeksjoner også. I denne studien ble porcin hornhinnen brukt til å teste den antivirale effekten av et preklinisk lite molekyl, BX795. Bruken av svine corneas ble foretrukket på grunn av enkel tilgang og kostnadseffektivitet. I tillegg er porcin hornhinnemodeller gode modeller av menneskelige øyne med hornhinnen lett å isolere, tilstrekkelig størrelse for infeksjon og visualisering og robust for å håndtere15. Porcin hornhinnen er også sammenlignbar med kompleksiteten av menneskelige hornhinnen modeller i både trans hornhinnen permeabilitet og systemiskabsorpsjon 15. Ved å bruke denne modellen til studien var vi i stand til å belyse hvordan BX795 er verdig videre undersøkelse som en kompetent hemmer av HSV-1 virusinfeksjon og legger til litteraturen for å klassifisere den som en potensiell antiviral forbindelse med små molekyler16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Virus og bakterier kan forårsake en rekke okulære overflatefeil og degenerasjon som sår og sår gjennom hornhinneinfeksjon. Med en seroprevalens som spenner fra 60-90% over hele verden, Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) ofte forårsaker mucocutaneous lesjoner i den orofaciale regionen som også manifesterer seg som lesjoner og infeksjon-assosiert blindhet. Mens nåværende antivirale legemidler er effektive, krever fremveksten av motstand og utholdenhet av giftige bivirkninger utvikling av nye antivirale midler mot dette allestedsnærværende patogenet. Selv om in vitro-vurdering gir noen funksjonelle data om et fremvoksende antiviralt, viser de ikke kompleksiteten til okulært vev in vivo. In vivo-studier er imidlertid dyre og krever opplært personell, spesielt når du arbeider med virale midler. Derfor er ex vivo-modeller effektive, men rimelige trinn for antiviral testing. Her diskuterer vi en protokoll for å studere infeksjon ved HSV-1 ved hjelp av porcine corneas ex vivo og en metode for å behandle dem topisk ved hjelp av eksisterende og nye antivirale legemidler. Vi demonstrerer også metoden for å utføre en plakkanalyse ved hjelp av HSV-1. Metodene som er beskrevet kan brukes til å utføre lignende eksperimenter for å studere infeksjoner som ligner HSV-1-patogenet.

For å forstå effekten av de eksperimentelle antiviralene, må de testes grundig før de sendes til in vivo humane kliniske studier. I denne forbindelse må positiv kontroll, negativ kontroll og testgrupper identifiseres. Trifluorothymidine (TFT) har lenge vært brukt som foretrukket behandling for å behandle herpes keratitt topisk16. Brukt som en positiv kontroll, viser TFT-behandlede hornhinnegrupper lavere infeksjonsspredning. Som en negativ kontroll brukte vi DMSO eller kjøretøykontroll op...

Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Vi beskriver bruken av en porcin hornhinne for å teste den antivirale effekten av eksperimentelle legemidler.

Porcine hornhinnen vev Explant å studere effekten av Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Å forstå effekten av legemidler i dyremodeller er kostnads- og arbeidsintensiv. Vår protokoll som bruker en ex vivo vev explant modell er betydelig lavere både når det gjelder kostnader og vitenskapelig personell som kreves for å gjennomføre studien. Den største fordelen med denne teknikken er bruk av svineøyne, som har anatomi og fysiologi som ligner på menneskelige øyne i motsetning til noen andre små dyremodeller.Når vi tester narkotika in vitro, kan de vise effekt som kan være fraværende i dyre- eller menneskelige modeller. Ex vivo vev systemer er den beste måten å forstå om våre in vitro systemer kan oversettes til dyr og menneskelige forsøk. Porcin hornhinnen systemet, selv om mindre arbeidsintensiv, krever trenbare ferdigheter for å isolere, vedlikeholde, infisere og behandle med stoffene, spesielt prosessen med isolasjon av hornhinnen fra hele porcin øye er vanskelig å uttrykke i ord, men krever visuell demonstrasjon.Når du mottar svineøyne fra en passende leverandør, må du lagre vevet på is til de bearbeides og settes på riktig personlig verneutstyr. Desinfiser arbeidsområdet med 70 % etanol og fest et benkdeksel på arbeidsområdet. Når arbeidsområdet er klart, plasser øynene på et 50 millimeter stykke gasbind og bruk gasbindet til å gripe den bakre delen med en hånd.Bruk en 30 gauge nål, gjør forsiktig en enkelt punktering i omtrent midten av øyets epiteloverflate, pass på at du ikke skader stromaen, og bruk et skarpt sterilisert blad for å lage et lite snitt på scleraen i en millimeter avstand fra hornhinnen. Ved hjelp av en rask og jevn roterende handling av hånden og pass på at glasslegemet humor ikke lekker, kutt kanten av hornhinnen og hold hornhinnen på hornhinnen-sclera kanten med en flat pinsett, bruk bladet til å kutte av de resterende tethering membraner. Som hver hornhinne er isolert, plasser vevet ansikt opp i individuelle brønner av en 12-brønns plate som inneholder to milliliter hornhinnen medium per brønn og legge fem mikroliter av en fem ganger 10 til den femte plakk-forming enhet av 17 GFP virus løsning til debrided stedet på hver hornhinnen overflate.Når alle hornhinnene er samlet inn, plasser platen i 37 grader Celsius, 5% karbondioksidinkubator i 72 timer og spray eventuelle ekstra øyne som ikke brukes i eksperimentet med 10% blekemiddel for sikker avhending i biofareposer. Hver dag før tilsetning av narkotika, plasser platen av hornhinner under et stereomikroskop og velg GFP-filteret og en 500 mikrosekundeksponeringstid. Ta bildene med lavest forstørrelse før du forestiller hornhinnene på en rekke økende forstørrelser til all viral spredning og dendritdannelse kan visualiseres tydelig.Når alle hornhinnene er avbildet, returner platen til vevskulturinkubatoren. Dagen før infeksjonen, vask en flytende verocellekultur to ganger med 10 milliliter PBS per vask, og behandle cellene med en milliliter 0,05% trypsin per brønn i fem til 10 minutter ved 37 grader Celsius. Når cellene har løsnet, bruk ni milliliter hele mediet for å sikre at cellene løsner helt fra kolbeoverflaten og overfører den resulterende cellefjæringen til et 15 milliliter sentrifugerør.Tilsett 300 mikroliter celler i hver brønn av en ny seks brønnplate, etterfulgt av tilsetning av to milliliter medium til hver brønn, og plasser deretter platen i cellekulturinkubatoren over natten. Neste morgen, for å samle viruset fra hver hornhinne for kvantifisering, suge sterile bomullspinnespisser i 500 mikroliter serumfritt medium per vattpinne i flere mikrocentrifugerør i et biosikkerhetsskap i minst fem minutter. På slutten av inkubasjonen, plasser forsiktig de infiserte porcine hornhinnekulturene i skapet.Ved hjelp av de våte bomullspinnene, gjør tre omdreininger med klokken og tre omdreininger mot klokken fem millimeter fra midten av hver infiserte porcin hornhinne uten å bruke for høyt trykk. På slutten av serien av omdreininger roterer du hver vattpinne i det serumfrie mediumfylte mikrocentrifugerøret med klokken og mot klokken fem ganger før du kutter vattpinnene slik at spissene passer i hvert rør med lokket lukket. Når alle hornhinnene har blitt swabbed, vortex rørene i høy hastighet i ett minutt.For å kvantifisere mengden virus samlet inn fra hver hornhinne, lag en log10 enfolds fortynning av viruset i serumfritt medium i mikrosentrifugerør til en fortynning på en gang 10 til de negative åtte er nådd. Etter å ha aspirert vekstmediet fra hver brønn av celler, overfør en milliliter av hver virusfortynning som starter på en gang 10 til de negative tre til de belagte cellemonolayerne og plasser de infiserte cellene i cellekulturinkubatoren i to timer. På slutten av inkubasjonen vasker du forsiktig hver brønn to ganger med PBS før du legger til to milliliter metylcelluloseladet medium til hver brønn for en 72-timers inkubasjon eller til dannelsen av plakk kan observeres.Ved plakkobservasjon legger du sakte en milliliter metanol til hjørnet av hver brønn for en 15-minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen aspirerer du sakte innholdet fra hver brønn uten å forstyrre cellemonolayeren. Deretter merker du hver brønn med en milliliter krystallfiolett arbeidsløsning, og pass på at alle cellene er dekket for en 30-minutters inkubasjon beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen, kast løsningen og tørk brønnene på et ark med absorberende papir, og tell deretter antall plakk ved den høyeste fortynningsbrønnen for å kvantifisere det totale virusinnholdet i startløsningen tre ganger. Som observert i denne stereoskopiske fluorescensavbildningsanalysen, er den antivirale effekten av BX795 lik den for TFT i å kontrollere virusspredning, mens hornhinner behandlet med kjøretøy bare demonstrerer spredning av viruset fra den sentrale infeksjonssonen til periferien med seks dager etter innledende viral inokulering. På samme måte viser okulære vattpinner tatt på dag to og fire postinfeksjon en fullstendig hemming av virus i den positive kontrollen og BX795-behandlede prøver, mens en kraftig økning i smittsomvirustitre observeres i de negative kontrollprøvene.Isolering av svinekornea fra hele porcinøyet er det viktigste trinnet. Trinn 2.3 til 2.6 er de mest avgjørende i denne prosessen. Vår modell kan brukes til å forstå dendrittiske spredningen av viruset i svine corneas.Denne metoden kan også utvides mot bakterielle og soppinfeksjoner. Denne metoden har bidratt til å visualisere dendritisk spredning av viruset i hornhinnen utenfor en menneskelig modell. Denne modellen er nyttig for å teste effekten av legemidler før du beveger deg mot dyre- og menneskelige forsøk.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Ved hjelp av revers genetikk å manipulere NSS Gene av Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain å forbedre Vaccine sikkerhet og effekt

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser for identifisering av nye antivirale midler mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserte Neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensavirus til neuraminidase Inhibitor Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

En metode for å teste effekten av håndvask for fjerning av nye smittsomme patogener

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...