Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por subvenções do NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 e RO1 EY029426) ao D.S. A.A. foi apoiado por uma bolsa F30EY025981 do National Eye Institute, NIH. O estudo foi realizado utilizando as córneas suínas obtidas da empresa Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Todo o tecido suíno usado neste estudo foi fornecido por uma organização privada terceirizada e nenhum dos manuseamentos de animais foi realizado pela Universidade de Illinois em Chicago.
1. Materiais
<ol><li>
Reagentes
	<ol>
<li>Use os seguintes reagentes para ensaio de placa: metilcelulose em pó, meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal (FBS), penicilina e estreptomicina (P/S) para ensaio de placa.</li>
		<li>Use comprimidos de cristal violeta e ...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Pesquisas anteriores mostraram que o BX795 tem um papel promissor como agente antiviral contra a infecção pelo HSV-1; inibindo a quinase de ligação tank 1 (TBK1)16. Tanto o TBK1 quanto a autofagia desempenharam um papel em ajudar a inibir a infecção pelo HSV-1, como demonstrado nas células epiteliais da córnea humana. O BX795 mostrou-se extremamente eficaz com a atividade antiviral em uma concentração de 10μM e usando tanto a análise de manchas ocidentais quanto a análise de placas vi...

Pessoas que sofrem de infecções oculares muitas vezes incorrem em perda de visão1. Com alta soroprevalência em todo o mundo, indivíduos infectados pelo HSV sofrem de infecções oculares recorrentes que levam a cicatrizes na córnea, ceratite estromica e neovascularização2,3,4,5. As infecções por HSV também têm se mostrado com menos frequência, uma série de condições graves entre pacientes imunocomprometidos e não tratados como encefalite e morbidade sistêmica6,7,8. Drogas como o Acyclovir (ACV) e seus análogos nucleosídeos têm mostrado sucesso consistente na contenção da infecção do HSV-1 e até mesmo na reativação decontrole,mas o uso prolongado dessas drogas está associado à insuficiência renal, anormalidades fetais e falha em restringir o surgimento da resistência a drogas às cepas virais em evolução9,10,11,12,13. Complexidades associadas às infecções oculares do HSV-1 foram previamente estudadas in vitro usando monocamadas e culturas 3D de células córneas humanas e in vivo usando infecções oculares de murina ou coelho. Embora esses modelos in vitro forneçam dados significativos sobre os componentes biológicos celulares das infecções pelo HSV-1, eles, no entanto, não conseguem imitar a complexidade intrincada do tecido córnea e pouco fazem para iluminar a propagação dendrítica do vírus14. Em contraste, embora os sistemas in vivo sejam mais perspicazes em mostrar infecção espalhada em córneas e respostas de ativação imunológica durante a infecção pelo HSV-1, eles vêm com a ressalva de que eles exigem pesquisadores treinados e grandes instalações para cuidados com animais para ignorar os experimentos.
Aqui usamos córneas suínas como modelo ex vivo para examinar o sistema de feridas induzidas pela infecção por HSV-1. Tanto a farmacologia potencial de certas drogas quanto a biologia celular e molecular do sistema de feridas causada pela infecção podem ser estudadas através de culturas de explanta tecidual. Este modelo também pode ser alterado para uso de outras infecções virais e bacterianas. Neste estudo, foram utilizadas córneas suínas para testar a eficácia antiviral de uma pequena molécula pré-clínica, BX795. O uso de córneas suínas foi preferido devido à facilidade de acesso e custo-benefício. Além disso, os modelos suínos de córneas são bons modelos de olhos humanos, sendo as córneas fáceis de isolar, adequadamente dimensionadas para infecção e visualização e robustas para manusear15. As córneas suínas também são comparáveis à complexidade dos modelos de córnea humanas tanto na permeabilidade da córnea trans quanto na absorção sistêmica15. Usando este modelo para o estudo, pudemos elucidar como o BX795 é digno de uma investigação mais aprofundada como um inibidor competente da infecção pelo vírus HSV-1 e adiciona à literatura de classificá-lo como um potencial composto antiviral de pequenas moléculas16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Vírus e bactérias podem causar uma variedade de defeitos da superfície ocular e degeneração, como feridas e úlceras através de infecção corneal. Com uma soroprevalência que varia de 60 a 90% em todo o mundo, o Vírus Herpes Simplex tipo-1 (HSV-1) geralmente causa lesões mucocutâneas da região orofacial que também se manifestam como lesões e cegueira associada à infecção. Embora as drogas antivirais atuais sejam eficazes, o surgimento de resistência e persistência de efeitos colaterais tóxicos requer o desenvolvimento de novos antivirais contra este patógeno onipresente. Embora a avaliação in vitro forneça alguns dados funcionais sobre um antiviral emergente, eles não demonstram a complexidade do tecido ocular in vivo. No entanto, os estudos in vivo são caros e exigem pessoal treinado, especialmente quando se trabalha com agentes virais. Portanto, os modelos ex vivo são passos eficientes, mas baratos para testes antivirais. Aqui discutimos um protocolo para estudar a infecção pelo HSV-1 usando córneas suínas ex vivo e um método para tratá-los topicamente usando drogas antivirais existentes e novas. Também demonstramos o método para realizar um ensaio de placa usando o HSV-1. Os métodos detalhados podem ser usados para realizar experimentos semelhantes para estudar infecções que se assemelham ao patógeno HSV-1.

Para entender a eficácia dos antivirais experimentais, eles precisam ser testados extensivamente antes de serem enviados para testes clínicos in vivo em humanos. Nesse sentido, devem ser identificados controles positivos, controle negativo e grupos de testes. Trifluorothymidina (TFT) tem sido usada há muito tempo como o tratamento preferido para tratar a ceratite de herpes topicamente16. Usados como controle positivo, os grupos córneas tratados com TFT mostram menor propagação de infecções...

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Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Descrevemos o uso de uma córnea suína para testar a eficácia antiviral de drogas experimentais.

Explante de tecido córnea porcina para estudar a eficácia do vírus Herpes Simplex-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Entender a eficácia das drogas em modelos animais é custo e trabalho intensivo. Nosso protocolo que utiliza um modelo ex vivo de ex-plantas de tecido é significativamente menor tanto em termos de custo quanto de pessoal científico necessário para conduzir o estudo. A principal vantagem dessa técnica é o uso de olhos suínos, que têm anatomia e fisiologia muito semelhantes aos olhos humanos em oposição a alguns outros pequenos modelos animais.Quando testamos drogas in vitro, elas podem mostrar eficácia que pode estar ausente em modelos animais ou humanos. Sistemas de tecidos ex vivo são a melhor maneira de entender se nossos sistemas in vitro podem ou não ser traduzidos em testes em animais e humanos. O sistema de córnea suína, embora menos intensivo em mão-de-obra, requer habilidades capacitáveis para isolar, manter, infectar e tratar com as drogas, especialmente o processo de isolamento da córnea de todo o olho suíno é complicado de expressar em palavras, mas requer demonstração visual.Ao receber olhos suínos de um fornecedor adequado, armazene os tecidos no gelo até o processamento e coloque os equipamentos de proteção pessoal adequados. Desinfete a área de trabalho com 70% de etanol e garanta uma cobertura de banco no espaço de trabalho. Quando a área de trabalho estiver pronta, coloque os olhos em um pedaço de gaze de 50 milímetros e use a gaze para agarrar a seção posterior com uma mão.Usando uma agulha de calibre 30, faça cuidadosamente uma única punção no centro da superfície epitelial do olho, tomando cuidado para não danificar o estroma, e use uma lâmina esterilizada afiada para fazer uma pequena incisão na esclera a um milímetro de distância da córnea. Usando uma ação rotativa rápida e suave da mão e tomando cuidado para que o humor vítreo não vaze, corte a borda da córnea e segurando a córnea na borda da córnea-esclera com uma pinça plana, use a lâmina para cortar as membranas de amarração restantes. À medida que cada córnea é isolada, coloque os tecidos voltados para poços individuais de uma placa de 12 poços contendo dois mililitros de meio de córnea por poço e adicione cinco microliters de cinco vezes 10 à quinta unidade formadora de placas de 17 soluçãos de vírus GFP para o local desbridado em cada superfície córnea.Quando todas as córneas tiverem sido coletadas, coloque a placa em 37 graus Celsius, incubadora de dióxido de carbono de 5% por 72 horas e pulverize quaisquer olhos adicionais não utilizados no experimento com alvejante 10% para seu descarte seguro em sacos de risco biológico. Todos os dias antes da adição de drogas, coloque a placa de córneas sob um microscópio estéreo e selecione o filtro GFP e um tempo de exposição de 500 microsegundos. Capture as imagens na menor ampliação antes de imaginar as córneas em uma série de ampliações crescentes até que toda a propagação viral e formação de dendrito possa ser visualizada claramente.Quando todas as córneas tiverem sido imagens, devolva a placa à incubadora de cultura tecidual. Um dia antes da infecção, lave uma cultura celular vero confluente duas vezes com 10 mililitros de PBS por lavagem, e trate as células com um mililitro de 0,05% de trippsina por poço por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, use nove mililitros de meio inteiro para garantir que as células se desalojam completamente da superfície do frasco e transfiram a suspensão celular resultante para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Adicione 300 microliters de células a cada poço de um novo poço de seis poços, seguido pela adição de dois mililitros de médio a cada poço, em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular durante a noite. Na manhã seguinte, para coletar o vírus de cada córnea para quantificação, mergulhe pontas de cotonete estéreis em 500 microliters de meio sem soro por cotonete em vários tubos de microcentrifuuge em um armário de biossegurança por pelo menos cinco minutos. No final da incubação, coloque cuidadosamente as culturas de córnea suína infectada no armário.Usando os cotonetes de algodão molhado, faça três revoluções no sentido horário e três revoluções no sentido anti-horário cinco milímetros do centro de cada córnea suína infectada sem aplicar pressão excessiva. No final da série de revoluções, gire cada cotonete em seu tubo de microcentrifuge médio sem soro no sentido horário e no sentido anti-horário cinco vezes antes de cortar os cotonetes para que as pontas se encaixem dentro de cada tubo com a tampa fechada. Quando todas as córneas foram limpas, vórtice os tubos em alta velocidade por um minuto.Para quantificar a quantidade de vírus coletada de cada córnea, prepare uma diluição de 10 vezes do vírus em meio livre de soro em tubos de microcentrifuuge até que uma diluição de uma vez 10 para os oito negativos seja alcançada. Depois de aspirar o meio de crescimento de cada poço de células, transfira um mililitro de cada diluição do vírus a partir de uma vez 10 para os três negativos para as monocamadas celulares banhadas e coloque as células infectadas na incubadora de cultura celular por duas horas. No final da incubação, lave suavemente cada poço duas vezes com PBS antes de adicionar dois mililitros de meio carregado de metilcelulose para cada poço para uma incubação de 72 horas ou até que a formação de placas possa ser observada.Após a observação da placa, adicione lentamente um mililitro de metanol ao canto de cada poço para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, aspira lentamente o conteúdo de cada poço sem perturbar a monocamada celular. Em seguida, rotule cada poço com um mililitro de solução de trabalho cristal violeta, tomando cuidado para que todas as células estejam cobertas para uma incubação de 30 minutos protegida da luz.Ao final da incubação, descarte a solução e seque os poços em uma folha de papel absorvente, em seguida, conte o número de placas no poço de diluição mais alto para quantificar o conteúdo total do vírus na solução inicial três vezes. Como observado nesta análise de imagem de fluorescência estereoscópica, a eficácia antiviral do BX795 é semelhante à do TFT no controle da propagação viral, enquanto as córneas tratadas com veículo só demonstram a propagação do vírus da zona central de infecção para a periferia por seis dias após a inoculação viral inicial. Da mesma forma, os cotonetes oculares retirados nos dias dois e quatro pós-infecção apresentam uma inibição completa do vírus no controle positivo e amostras tratadas com BX795, enquanto um aumento acentuado no taças vírus infeccioso é observado nas amostras de controle negativo.O isolamento da córnea suína de todo o olho suíno é o passo mais importante. As etapas 2.3 a 2.6 são as mais cruciais nesse processo. Nosso modelo pode ser usado para entender a propagação dendrítica do vírus em córneas suínas.Este método também pode ser estendido para infecções bacterianas e fúngicas. Este método tem ajudado na visualização da propagação dendrítica do vírus em córneas fora de um modelo humano. Este modelo é útil para testar a eficácia das drogas antes de se mover para testes em animais e humanos.

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To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Um método para testar a eficácia do lavagem das mãos para a remoção de patógenos infecciosos emergentes

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...