Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 и RO1 EY029426) для D.S. A.A. было поддержано грантом F30EY025981 от Национального института глаз, NIH. Исследование проводилось с использованием роговицы свиней, полученной от компании Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Вся свиная ткань, используемая в этом исследовании, была предоставлена сторонней частной организацией, и ни одна из обработк животных не была выполнена персоналом Университета Иллинойса в Чикаго.
1. Материалы
<ol><li>
Реагентов
	<ol>
<li>Используйте следующие реагент?...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Предыдущие исследования показали, что BX795 играет многообещающую роль в качестве противовирусного средства против инфекции ВПГ-1; путем ингибирования TANK-связывающей киназы 1 (TBK1)16. Как TBK1, так и аутофагия сыграли определенную роль в ингибировании инфекции ВПГ-1, как показано ?...

Люди, страдающие глазными инфекциями, часто страдают от потеризрения 1. С высокой серораспространенностью во всем мире инфицированные ВПГ лица страдают от повторяющихся глазных инфекций, которые приводят к рубцеванию роговицы, стромальному кератиту и неоваскуляризации2,3,4,5. Инфекции ВПГ также показали, что вызывают реже ряд серьезных состояний среди пациентов с ослабленным иммунитетом, нелеченных пациентов, таких как энцефалит и системная заболеваемость6,7,8. Такие препараты, как Ацикловир (ЯЦВ) и его аналоги нуклеозидов, показали последовательный успех в сдерживании инфекции ВПГ-1 и даже контроле реактивации, однако длительное использование этих препаратов связано с почечной недостаточностью, аномалиями плода и неспособностью ограничить появление лекарственной устойчивости к развивающимся вирусным штаммам9,10,11,12,13. Сложности, связанные с глазными инфекциями ВПГ-1, ранее изучались in vitro с использованием монослоев и 3D-культур клеток роговицы человека и in vivo с использованием мышиных или кроличьих глазных инфекций. Хотя эти модели in vitro предоставляют значительные данные о клеточных биологических компонентах инфекций ВПГ-1, они, однако, не могут имитировать сложную сложность ткани роговицы и мало что делают для освещения дендритного распространения вируса14. Напротив, хотя системы in vivo более проницательны в демонстрации распространения инфекции в роговице и реакций иммунной активации во время инфекции ВПГ-1, они приходят с оговоркой, что им требуются обученные исследователи и большие учреждения по уходу за животными, чтобы игнорировать эксперименты.
Здесь мы используем роговицу свиней в качестве модели ex vivo для изучения раневой системы, вызванной инфекцией ВПГ-1. Как потенциальная фармакология некоторых лекарств, так и клеточная и молекулярная биология раневой системы, вызванной инфекцией, могут быть изучены с помощью тканевых эксплантных культур. Эта модель также может быть изменена для использования при других вирусных и бактериальных инфекциях. В этом исследовании роговицы свиней использовались для проверки противовирусной эффективности доклинической малой молекулы BX795. Использование роговиц свиней было предпочтительным из-за простоты доступа и экономической эффективности. Кроме того, модели роговицы свиней являются хорошими моделями человеческих глаз, причем роговицы легко изолируются, имеют адекватный размер для инфекции и визуализации и надежны для обработки15. Роговицы свиней также сопоставимы со сложностью моделей роговицы человека как по транспроницаемости роговицы, так и по системной абсорбции15. Используя эту модель для исследования, мы смогли выяснить, как BX795 заслуживает дальнейшего изучения в качестве компетентного ингибитора вирусной инфекции ВПГ-1 и добавить к литературе классификацию его как потенциального маломолекулярного противовирусного соединения16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Вирусы и бактерии могут вызывать различные дефекты поверхности глаз и дегенерацию, такие как раны и язвы, через инфекцию роговицы. С серораспространенностью, которая колеблется от 60-90% во всем мире, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) обычно вызывает слизисто-кожные поражения орофациальной области, которые также проявляются как поражения и связанная с инфекцией слепота. Хотя современные противовирусные препараты эффективны, появление резистентности и сохранение токсичных побочных эффектов требует разработки новых противовирусных препаратов против этого вездесущего патогена. Хотя оценка in vitro предоставляет некоторые функциональные данные относительно появляющегося противовирусного препарата, они не демонстрируют сложность глазной ткани in vivo. Однако исследования in vivo стоят дорого и требуют обученного персонала, особенно при работе с вирусными агентами. Следовательно, модели ex vivo являются эффективными, но недорогими шагами для противовирусного тестирования. Здесь мы обсуждаем протокол изучения инфекции ВПГ-1 с использованием роговиц свиней ex vivo и метод их местного лечения с использованием существующих и новых противовирусных препаратов. Мы также демонстрируем метод проведения анализа бляшек с использованием ВПГ-1. Подробные методы могут быть использованы для проведения аналогичных экспериментов по изучению инфекций, которые напоминают возбудителя ВПГ-1.

Чтобы понять эффективность экспериментальных противовирусных препаратов, их необходимо тщательно протестировать, прежде чем они будут отправлены на клинические испытания in vivo на людях. В связи с этим необходимо выявить группы положительного контроля, отрицательного контроля и тесто...

Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Описано применение свиной роговицы для проверки противовирусной эффективности экспериментальных препаратов.

Эксплант ткани роговицы свиней для изучения эффективности противовирусных препаратов вируса простого герпеса-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Понимание эффективности лекарств на животных моделях является дорогостоящим и трудоемким. Наш протокол, который использует модель ex vivo tissue explant, значительно ниже как с точки зрения стоимости, так и научного персонала, необходимого для проведения исследования. Основным преимуществом этой методики является использование свиных глаз, которые имеют анатомию и физиологию, очень похожие на человеческие глаза в отличие от некоторых других моделей мелких животных.Когда мы тестируем лекарства in vitro, они могут показать эффективность, которая может отсутствовать на животных или человеческих моделях. Тканевые системы ex vivo — лучший способ понять, могут ли наши системы in vitro быть переведены в испытания на животных и людях. Система роговицы свиней, хотя и менее трудоемкая, требует обучаемых навыков для выделения, поддержания, заражения и лечения препаратами, особенно процесс выделения роговицы из всего свиного глаза сложно выразить словами, но требует визуальной демонстрации.Получив глаза свиней от подходящего продавца, храните ткани на льду до обработки и надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты. Продезинфицируйте рабочую зону 70% этанолом и закрепите крышку скамейки на рабочем месте. Когда рабочая зона будет готова, поместите глаза на 50-миллиметровый кусок марли и используйте марлю, чтобы захватить задний отдел одной рукой.Используя иглу 30 калибра, осторожно сделайте один прокол примерно в центре эпителиальной поверхности глаза, следя за тем, чтобы не повредить строму, и используйте острое стерилизованное лезвие, чтобы сделать небольшой разрез на склере на расстоянии одного миллиметра от роговицы. Используя быстрое и плавное вращающееся действие руки и заботясь о том, чтобы стекловидное тело не протекала, срежьте край роговицы и удерживая роговицу у края роговицы-склеры плоским пинцетем, используйте лезвие, чтобы отрезать оставшиеся привязные мембраны. По мере выделения каждой роговицы поместите ткани лицевой стороной вверх в отдельные лунки из 12-луночной пластины, содержащей два миллилитра среды роговицы на лунку, и добавьте пять микролитров пять раз 10 к пятой бляшеобразующей единице из 17 раствора вируса GFP к санированной площадке на поверхности каждой роговицы.Когда все роговицы будут собраны, поместите пластину в инкубатор с диоксидом 5% в течение 72 часов и распылите любые дополнительные глаза, не используемые в эксперименте, 10% отбеливателем для их безопасной утилизации в мешках биологической безопасности. Каждый день перед добавлением препаратов помещают пластинку роговицы под стереомикроскоп и выбирают фильтр GFP и время воздействия 500 микросекунд. Захватите изображения с наименьшим увеличением, прежде чем визуализировать роговицу с серией увеличивающихся увеличений, пока все вирусное распространение и образование дендритов не будут четко визуализированы.Когда все роговицы будут сфотвоированы, верните пластину в инкубатор культуры тканей. За день до заражения промыть культуру клеток веро два раза по 10 миллилитрам PBS за промывку и обработать клетки одним миллилитром 0,05% трипсина на лунку в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия. Когда клетки отделяются, используйте девять миллилитров целой среды, чтобы гарантировать, что клетки полностью вытесняются с поверхности колбы и переносят полученную суспензию ячейки в 15-миллилитровую центрифужную трубку.Добавьте 300 микролитров клеток в каждую лунку новой шестиямямяя пластины с последующим добавлением двух миллилитров среды к каждой лунке, затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на ночь. На следующее утро, чтобы собрать вирус из каждой роговицы для количественной оценки, замочите стерильные ватные тампоны в 500 микролитрах безымяточной среды на тампон в нескольких микроцентрифужных трубках в шкафу биобезопасности не менее пяти минут. В конце инкубации аккуратно поместите зараженные культуры роговицы свиней в шкаф.Используя влажные ватные тампоны, сделайте три оборота по часовой стрелке и три оборота против часовой стрелки в пяти миллиметрах от центра каждой зараженной роговицы свиньи, не применяя чрезмерного давления. В конце серии оборотов поверните каждый тампон в своей безсыворочной среде, заполненной микроцентрифугой трубкой по часовой стрелке и против часовой стрелки пять раз, прежде чем разрезать тампоны так, чтобы наконечники помещались в каждую трубку с закрытой крышкой. Когда все роговицы будут промаснуты, вихрьте трубки на высокой скорости в течение одной минуты.Чтобы количественно оценить количество вируса, собранного из каждой роговицы, подготовьте 10-кратное разведение вируса в безсыворочной среде в микроцентрифужных пробирках до тех пор, пока не будет достигнуто разведение от одного раза 10 до отрицательных восьми. После аспирации питательной среды из каждого колодца клеток переводят один миллилитр каждого разведения вируса, начиная с одного раза 10 до отрицательных трех, на покрытые клеточные монослои и помещают инфицированные клетки в инкубатор клеточной культуры на два часа. В конце инкубации осторожно промыть каждую лунку два раза PBS, прежде чем добавлять два миллилитра метилцеллюлозной среды в каждую лунку для 72-часовой инкубации или до тех пор, пока не будет наблюдаться образование бляшек.При наблюдении за бляшками медленно добавляйте по одному миллилитру метанола в угол каждой лунки для 15-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации медленно аспирировать содержимое из каждой скважины, не нарушая клеточный монослой. Затем пометьте каждую лунку одним миллилитром кристаллического фиолетового рабочего раствора, заботясь о том, чтобы все клетки были покрыты для 30-минутной инкубации, защищенной от света.В конце инкубации выбросьте раствор и высушите колодцы на листе абсорбирующей бумаги, затем подсчитайте количество бляшек в самой высокой разбавленной скважине, чтобы количественно оценить общее содержание вируса в исходном растворе три раза. Как отмечено в этом стереоскопическом флуоресцентном анализе, противовирусная эффективность BX795 аналогична эффективности TFT в контроле распространения вируса, в то время как роговицы, обработанные транспортным средством, демонстрируют распространение вируса из центральной инфекционной зоны на периферию только через шесть дней после первоначальной вирусной инокуляции. Аналогичным образом, глазные мазки, взятые на второй и четвертый дни после заражения, демонстрируют полное ингибирование вируса в положительных контрольных и обработанных BX795 образцах, в то время как резкое увеличение титра инфекционного вируса наблюдается в отрицательных контрольных образцах.Выделение роговицы свиньи из всего свиного глаза является наиболее важным шагом. Шаги 2.3-2.6 являются наиболее важными в этом процессе. Наша модель может быть использована для понимания дендритного распространения вируса в роговицах свиней.Этот метод может быть распространен на бактериальные и грибковые инфекции. Этот метод помог визуализировать дендритное распространение вируса в роговице за пределами человеческой модели. Эта модель полезна для тестирования эффективности лекарств перед переходом к испытаниям на животных и людях.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Использование обратной генетики манипулировать АПЛ Ген Лихорадка Рифт-Валли Вирус MP-12 Штамм для повышения безопасности и эффективности вакцин

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Первичная система культуры нейронов по изучению простого герпеса латентности вирусов и реактивации

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Экс Vivo Заражение мышиных эпидермиса с вирусом простого герпеса типа 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Флуоресцентный на основе нейраминидазы Анализ ингибирования для оценки восприимчивости вирусов гриппа к нейраминидазы Ингибитор классу противовирусных препаратов

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Метод проверки эффективности мытья рук для удаления возникающих инфекционных патогенов

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...