Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por subvenciones de los NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 y RO1 EY029426) a D.S. A.A. fue apoyado por una subvención F30EY025981 del Instituto Nacional del Ojo, NIH. El estudio se realizó utilizando las córneas porcinas obtenidas de Park Packing company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Todo el tejido porcino utilizado en este estudio fue proporcionado por una organización privada de terceros y ninguno de los manejos de animales fue realizado por personal de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. Materiales
<ol><li>
Reactivos
	<ol>
<li>Use los siguientes reactivos para el ensayo de placa: metilcelulosa en polvo, medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS), penicilina y estreptomicina (P / S) para el ensayo de placa.</li>
		<...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Investigaciones anteriores han demostrado que BX795 tiene un papel prometedor como agente antiviral contra la infección por HSV-1; inhibiendo la quinasa de unión a TANK 1 (TBK1)16. Tanto TBK1 como la autofagia han desempeñado un papel en ayudar a inhibir la infección por HSV-1, como se ha demostrado en las células epiteliales corneales humanas. BX795 demostró ser máximamente efectivo con actividad antiviral a una concentración de 10μM y utilizando tanto el análisis de western blot como e...

Las personas que sufren de infecciones oculares a menudo incurren en pérdida de la visión1. Con una alta seroprevalencia en todo el mundo, los individuos infectados por el VHS sufren infecciones oculares recurrentes que conducen a cicatrices corneales, queratitis estromal y neovascularización2,3,4,5. Las infecciones por VHS también han demostrado causar con menos frecuencia, una variedad de afecciones graves entre pacientes inmunocomprometidos y no tratados, como encefalitis y morbilidad sistémica6,7,8. Medicamentos como el aciclovir (ACV) y sus análogos de nucleósidos han demostrado un éxito constante en la reducción de la infección por HSV-1 e incluso la reactivación de control, sin embargo, el uso prolongado de estos medicamentos se asocia con insuficiencia renal, anomalías fetales y la incapacidad de restringir la aparición de resistencia a los medicamentos a las cepas virales en evolución9,10,11,12,13. Las complejidades asociadas a las infecciones oculares por HSV-1, han sido previamente estudiadas in vitro utilizando monocapas y cultivos 3D de células corneales humanas e in vivo utilizando infecciones oculares murinas o de conejo. Si bien estos modelos in vitro proporcionan datos significativos sobre los componentes biológicos celulares de las infecciones por HSV-1, sin embargo, no logran imitar la intrincada complejidad del tejido corneal y hacen poco para iluminar la propagación dendrítica del virus14. En contraste, aunque los sistemas in vivo son más perspicaces al mostrar la propagación de la infección en las córneas y las respuestas de activación inmune durante la infección por HSV-1, vienen con la advertencia de que requieren investigadores capacitados y grandes instalaciones para el cuidado de animales para pasar por alto los experimentos.
Aquí utilizamos córneas porcinas como modelo ex vivo para examinar el sistema de heridas inducidas por infección por HSV-1. Tanto la farmacología potencial de ciertos fármacos como la biología celular y molecular del sistema de heridas causado por la infección se pueden estudiar a través de cultivos de explantes de tejidos. Este modelo también puede ser modificado para el uso de otras infecciones virales y bacterianas también. En este estudio, se utilizaron córneas porcinas para probar la eficacia antiviral de una molécula pequeña preclínica, BX795. Se prefirió el uso de córneas porcinas debido a la facilidad de acceso y la rentabilidad. Además, los modelos de córnea porcina son buenos modelos de ojos humanos con las córneas siendo fáciles de aislar, de tamaño adecuado para la infección y visualización y robustas para manejar15. Las córneas porcinas también son comparables a la complejidad de los modelos corneales humanos tanto en permeabilidad trans corneal como en absorción sistémica15. Al usar este modelo para el estudio, pudimos dilucidar cómo BX795 es digno de una mayor investigación como un inhibidor competente de la infección por el virus HSV-1 y se suma a la literatura de clasificarlo como un posible compuesto antiviral de molécula pequeña16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Los virus y las bacterias pueden causar una variedad de defectos de la superficie ocular y degeneración, como heridas y úlceras a través de la infección corneal. Con una seroprevalencia que oscila entre el 60-90% en todo el mundo, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) comúnmente causa lesiones mucocutáneas de la región orofacial que también se manifiestan como lesiones y ceguera asociada a la infección. Si bien los medicamentos antivirales actuales son efectivos, la aparición de resistencia y la persistencia de efectos secundarios tóxicos requiere el desarrollo de nuevos antivirales contra este patógeno ubicuo. Aunque la evaluación in vitro proporciona algunos datos funcionales con respecto a un antiviral emergente, no demuestran la complejidad del tejido ocular in vivo. Sin embargo, los estudios in vivo son costosos y requieren personal capacitado, especialmente cuando se trabaja con agentes virales. Por lo tanto, los modelos ex vivo son pasos eficientes pero económicos para las pruebas antivirales. Aquí discutimos un protocolo para estudiar la infección por HSV-1 utilizando córneas porcinas ex vivo y un método para tratarlas tópicamente utilizando medicamentos antivirales existentes y nuevos. También demostramos el método para realizar un ensayo de placa utilizando HSV-1. Los métodos detallados se pueden utilizar para realizar experimentos similares para estudiar infecciones que se asemejan al patógeno HSV-1.

Para comprender la eficacia de los antivirales experimentales, deben probarse ampliamente antes de enviarlos a ensayos clínicos in vivo en humanos. En este sentido, se deben identificar los grupos de control positivo, control negativo y prueba. La trifluorotimidina (TFT) se ha utilizado durante mucho tiempo como el tratamiento preferido para tratar la queratitis por herpes por vía tópica16. Utilizados como un control positivo, los grupos corneales tratados con TFT muestran una menor propagació...

Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Describimos el uso de una córnea porcina para probar la eficacia antiviral de los fármacos experimentales.

Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Comprender la eficacia de los medicamentos en modelos animales es costoso y requiere mucha mano de obra. Nuestro protocolo que utiliza un modelo de explante de tejido ex vivo es significativamente menor tanto en términos de costo como de personal científico requerido para realizar el estudio. La principal ventaja de esta técnica es el uso de ojos porcinos, que tienen una anatomía y fisiología muy similares a los ojos humanos en comparación con algunos otros modelos de animales pequeños.Cuando probamos medicamentos in vitro, pueden mostrar una eficacia que podría estar ausente en modelos animales o humanos. Los sistemas de tejidos ex vivo son la mejor manera de entender si nuestros sistemas in vitro pueden o no traducirse en ensayos en animales y humanos. El sistema de córnea porcina, aunque menos laboriosa, requiere habilidades entrenables para aislar, mantener, infectar y tratar con los medicamentos, especialmente el proceso de aislamiento de la córnea de todo el ojo porcino es difícil de expresar con palabras, pero requiere demostración visual.Al recibir los ojos porcinos de un proveedor adecuado, almacene los pañuelos en hielo hasta su procesamiento y póngase el equipo de protección personal adecuado. Desinfecte el área de trabajo con etanol al 70% y asegure una cubierta de banco en el espacio de trabajo. Cuando el área de trabajo esté lista, coloque los ojos sobre una gasa de 50 milímetros y use la gasa para agarrar la sección posterior con una mano.Usando una aguja de calibre 30, haga cuidadosamente una sola punción en aproximadamente el centro de la superficie epitelial del ojo, teniendo cuidado de no dañar el estroma, y use una cuchilla esterilizada afilada para hacer una pequeña incisión en la esclerótica a una distancia de un milímetro de la córnea. Usando una acción giratoria rápida y suave de la mano y cuidando que el humor vítreo no se filtre, corte el borde de la córnea y sostenga la córnea en el borde de la córnea-esclerótica con una pinza plana, use la cuchilla para cortar las membranas de anclaje restantes. A medida que se aísle cada córnea, coloque los tejidos boca arriba en los pozos individuales de una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de medio de córnea por pozo y agregue cinco microlitros de una unidad de cinco veces 10 a la quinta unidad formadora de placa de 17 solución de virus GFP al sitio desbridado en cada superficie corneal.Cuando se hayan recolectado todas las córneas, coloque la placa a 37 grados Celsius, una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 72 horas y rocíe los ojos adicionales no utilizados en el experimento con lejía al 10% para su eliminación segura en bolsas de riesgo biológico. Todos los días antes de la adición de medicamentos, coloque la placa de córneas bajo un microscopio estereoscópico y seleccione el filtro GFP y un tiempo de exposición de 500 microsegundos. Capture las imágenes con el aumento más bajo antes de obtener imágenes de las córneas a una serie de aumentos crecientes hasta que toda la propagación viral y la formación de dendritas se puedan visualizar claramente.Cuando se hayan fotografiado todas las córneas, devuelva la placa a la incubadora de cultivo de tejidos. El día antes de la infección, lave un cultivo de células vero confluentes dos veces con 10 mililitros de PBS por lavado, y trate las células con un mililitro de tripsina al 0,05% por pozo durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan desprendido, use nueve mililitros de medio entero para asegurarse de que las células se desalojen completamente de la superficie del matraz y transfiera la suspensión celular resultante a un tubo centrífugo de 15 mililitros.Agregue 300 microlitros de células a cada pozo de una nueva placa de seis pozos, seguido de la adición de dos mililitros de medio a cada pozo, luego coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante la noche. A la mañana siguiente, para recoger el virus de cada córnea para su cuantificación, remoje las puntas de hisopo de algodón estéril en 500 microlitros de medio sin suero por hisopo en múltiples tubos de microcentrífuga en un gabinete de bioseguridad durante al menos cinco minutos. Al final de la incubación, coloque cuidadosamente los cultivos de córnea porcina infectada en el gabinete.Usando los hisopos húmedos de algodón, haga tres revoluciones en el sentido de las agujas del reloj y tres revoluciones en sentido contrario a las agujas del reloj a cinco milímetros del centro de cada córnea porcina infectada sin aplicar una presión excesiva. Al final de la serie de revoluciones, gire cada hisopo en su tubo de microcentrífuga lleno de medio sin suero en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj cinco veces antes de cortar los hisopos para que las puntas quepan dentro de cada tubo con la tapa cerrada. Cuando todas las córneas han sido hisopadas, vórtice los tubos a alta velocidad durante un minuto.Para cuantificar la cantidad de virus recogido de cada córnea, prepare una dilución log10 de una sola vez del virus en medio libre de suero en tubos de microcentrífuga hasta que se alcance una dilución de una vez 10 a los ocho negativos. Después de aspirar el medio de crecimiento de cada pozo de células, transfiera un mililitro de cada dilución del virus a partir de una vez 10 a las tres negativas a las monocapas de células chapadas y coloque las células infectadas en la incubadora de cultivo celular durante dos horas. Al final de la incubación, lave suavemente cada pozo dos veces con PBS antes de agregar dos mililitros de medio cargado de metilcelulosa a cada pozo durante una incubación de 72 horas o hasta que se pueda observar la formación de placas.Tras la observación de la placa, agregue lentamente un mililitro de metanol a la esquina de cada pozo durante una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, aspire lentamente el contenido de cada pozo sin perturbar la monocapa celular. A continuación, etiquete cada pozo con un mililitro de solución de trabajo violeta de cristal, teniendo cuidado de que todas las células estén cubiertas para una incubación de 30 minutos protegida de la luz.Al final de la incubación, deseche la solución y seque los pomos en una hoja de papel absorbente, luego cuente el número de placas en el pozo de dilución más alto para cuantificar el contenido total de virus en la solución inicial tres veces. Como se observa en este análisis de imágenes de fluorescencia estereoscópica, la eficacia antiviral de BX795 es similar a la de TFT en el control de la propagación viral, mientras que las córneas tratadas con vehículo solo demuestran la propagación del virus desde la zona de infección central a la periferia a los seis días posteriores a la inoculación viral inicial. Del mismo modo, los hisopos oculares tomados en los días dos y cuatro posteriores a la infección exhiben una inhibición completa del virus en las muestras de control positivas y tratadas con BX795, mientras que se observa un fuerte aumento en el título del virus infeccioso en las muestras de control negativas.El aislamiento de la córnea porcina de todo el ojo porcino es el paso más importante. Los pasos 2.3 a 2.6 son los más cruciales en este proceso. Nuestro modelo se puede utilizar para comprender la propagación dendrítica del virus en córneas porcinas.Este método también se puede extender hacia las infecciones bacterianas y fúngicas. Este método ha ayudado a visualizar la propagación dendrítica del virus en córneas fuera de un modelo humano. Este modelo es útil para probar la eficacia de los medicamentos antes de avanzar hacia los ensayos en animales y humanos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Un método para probar la eficacia del lavado de manos para la eliminación de patógenos infecciosos emergentes

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal