Name: porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibeleri (R01 EY024710, RO1 AI139768 ve RO1 EY029426) tarafından D.S. A.A.'ya verilen F30EY025981 hibesi ile desteklendi. Çalışma, Park Ambalaj şirketi, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609'dan elde edilen porcine korneaları kullanılarak gerçekleştirildi.

Bu çalışmada kullanılan tüm porcine dokusu üçüncü taraf bir özel kuruluş tarafından sağlanmıştır ve hayvan elleçlemelerinin hiçbiri Chicago'daki Illinois Üniversitesi personeli tarafından yapılmamıştır.
1. Malzemeler
<ol><li>
Reaktif
	<ol>
<li>Plak tahlil için aşağıdaki reaktifleri kullanın: toz metilselüloz, Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM), fetal sığır serumu (FBS), penisilin ve plak tahlil için streptomisin (P/S).</li>
		<li>Pl...

<ol>
	<li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance.">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li><li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells.">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li><li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections.">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States,+1988-1994.">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States.">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li><li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections.">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li><li>Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis:+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation.">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li><li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+infection+in+the+cornea.">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li><li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing.">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li><li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy.">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li><li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir.">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li><li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir.">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li><li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+nephrotoxicity:+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention,+detection,+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy.">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li><li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells.">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559 (2017).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+Histological+and+permeability+evaluation.">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li><li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye.">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li></ol>

Önceki araştırmalar BX795'in HSV-1 enfeksiyonuna karşı antiviral ajan olarak umut verici bir role sahip olduğunu göstermiştir; TANK bağlayıcı kinaz 1 (TBK1)16'yıinhibe ederek. Hem TBK1 hem de otofaji, insan kornea epitel hücrelerinde gösterildiği gibi HSV-1 enfeksiyonunu inhibe etmeye yardımcı olmuştur. BX795'in 10μM konsantrasyonda antiviral aktivite ile maksimum derecede etkili olduğu ve hem batı leke analizi hem de anahtar viral proteinlerin viral plak analizi kullanılarak...

Oküler enfeksiyonlardan muzdarip insanlar genellikle görme kaybına maruz1. Dünya çapında yüksek seroprevalans ile, HSV enfekte bireyler kornea skarlaşmasına, stromal keratit ve neovaskülarizasyona yol açan tekrarlayan göz enfeksiyonlarından muzdariptir2,3,4,5. HSV enfeksiyonlarının da daha az sıklıkta, ensefalit ve sistemik morbidite6,7,8gibi immün sistemik olarak tedavi edilmemiş hastalar arasında bir dizi ciddi duruma neden olduğu gösterilmiştir. Acyclovir (ACV) ve nükleozid analogları gibi ilaçlar HSV-1 enfeksiyonunu frenlemede ve hatta yeniden etkinleştirmeyi kontrol etmede tutarlı bir başarı göstermiştir, ancak bu ilaçların uzun süreli kullanımı böbrek yetmezliği, fetal anormallikler ve gelişen viral suşlara karşı ilaç direncinin ortaya çıkmasını kısıtlamama ile ilişkilidir9,10,11,12,13. HSV-1 oküler enfeksiyonlarla ilişkili karmaşıklıklar, daha önce monolayerler ve insan kornea hücrelerinin 3D kültürleri kullanılarak in vitro ve murine veya tavşan oküler enfeksiyonları kullanılarak in vivo olarak çalışılmıştır. Bu in vitro modeller HSV-1 enfeksiyonlarının hücresel biyolojik bileşenleri hakkında önemli veriler sağlarken, kornea dokusunun karmaşık karmaşıklığını taklit edemezler ve virüsün dendritik yayılımını aydınlatmak için çok az şeyyaparlar 14. Buna karşılık, in vivo sistemler HSV-1 enfeksiyonu sırasında kornealarda enfeksiyon yayılımını ve immün aktivasyon yanıtlarını göstermede daha anlayışlı olsalar da, deneyleri göz ardı etmek için eğitimli araştırmacılara ve hayvan bakımı için büyük tesislere ihtiyaç duydukları uyarısıyla birlikte gelirler.
Burada HSV-1 enfeksiyon kaynaklı yara sistemini incelemek için ek vivo model olarak porcine korneaları kullanıyoruz. Hem bazı ilaçların potansiyel farmakolojisi hem de enfeksiyonun neden olduğu yara sisteminin hücre ve moleküler biyolojisi doku eksplant kültürleri üzerinden incelenebilir. Bu model diğer viral ve bakteriyel enfeksiyonlar için de kullanılabilir. Bu çalışmada, preklinik küçük bir molekül olan BX795'in antiviral etkinliğini test etmek için porsin korneaları kullanılmıştır. Erişim kolaylığı ve maliyet etkinliği nedeniyle porcine kornea kullanımı tercih edildi. Ek olarak, porcine kornea modelleri, korneaların izole edilmesi kolay, enfeksiyon ve görselleştirme için yeterli boyutta ve15'iidare etmek için sağlam olan iyi insan gözleri modelleridir. Porcine korneaları ayrıca hem trans kornea geçirgenliği hem de sistemik emilim15'te insan kornea modellerinin karmaşıklığı ile karşılaştırılabilir. Çalışma için bu modeli kullanarak, BX795'in HSV-1 virüs enfeksiyonunun yetkin bir inhibitörü olarak nasıl daha fazla araştırmaya layık olduğunu ve potansiyel bir küçük moleküllü antiviral bileşik olarak sınıflandırma literatürüne eklediğini ortaya çıkarabildik16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G hypodermic needles.</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL glass bottle.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>844027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic and Antibiotic (AA)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vortexer.</td>
			<td>BioDot</td>
			<td>BDVM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Herasafe 2030i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calgiswab 6&#34; Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>22029501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper - 25 cm</td>
			<td>Biologix BE</td>
			<td>70-1180 70-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6158</td>
			<td>Store the powder in a dark place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium - DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41966029</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum -FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat edged tweezers &#8211; 2.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezers --80 &#176;C. -</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>13 100 790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresh box of blades.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>TE05091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guaze</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td>108 square inch folder 12 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 17GFP</td>
			<td>grown in house</td>
			<td>-</td>
			<td>Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>H3710-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic Scissors.</td>
			<td>Harward Instruments</td>
			<td>72-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 1 to 1000 &#181;L.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159M37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium - MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11095080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin.</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td>Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline -PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010072</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Corneas</td>
			<td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td>
			<td>0</td>
			<td>Special order by request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure bench covers - as needed.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>S42400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetting equipment.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Ezpette Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery V20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring magnet.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F37120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks, T175 cm2.</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 &#176;C temperature.</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Forma 50145523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated plates (6-well).</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-300-062</td>
			<td>Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porcine corneal tissue explant to study the efficacy of herpes simplex virus-1 antivirals

Virüsler ve bakteriler kornea enfeksiyonu yoluyla çeşitli oküler yüzey kusurlarına ve yaralar ve ülserler gibi dejenerasyona neden olabilir. Dünya çapında% 60-90 arasında değişen bir seroprevalans ile, Herpes Simpleks Virüs tip-1 (HSV-1) genellikle lezyonlar ve enfeksiyon ilişkili körlük olarak da kendini gösteren orofasiyal bölgenin mukokütanöz lezyonlarına neden olur. Mevcut antiviral ilaçlar etkili olmakla birlikte, toksik yan etkilerin direncinin ortaya çıkması ve kalıcılığı, bu her yerde bulunan patojene karşı yeni antivirallerin geliştirilmesini gerektirir. In vitro değerlendirme, ortaya çıkan bir antiviral ile ilgili bazı fonksiyonel veriler sağlasa da, in vivo oküler dokunun karmaşıklığını göstermez. Bununla birlikte, in vivo çalışmalar pahalıdır ve özellikle viral ajanlarla çalışırken eğitimli personel gerektirir. Bu nedenle ex vivo modelleri antiviral test için verimli ancak ucuz adımlardır. Burada, HSV-1'in porcine kornea ex vivo kullanarak enfeksiyonu incelemek için bir protokol ve mevcut ve yeni antiviral ilaçları kullanarak topikal olarak tedavi etmek için bir yöntem tartışıyoruz. Ayrıca HSV-1 kullanarak bir plak tahlilini gerçekleştirme yöntemini de gösteriyoruz. Ayrıntılı yöntemler, HSV-1 patojenine benzeyen enfeksiyonları incelemek için benzer deneyler yapmak için kullanılabilir.

Deneysel antivirallerin etkinliğini anlamak için, in vivo insan klinik deneyleri için gönderilmeden önce kapsamlı bir şekilde test edilmesi gerekir. Bu bakımdan pozitif kontrol, negatif kontrol ve test gruplarının belirlenmesi gerekiyor. Trifluorothymidine (TFT) uzun zamandır herpes keratitini topikal olarak tedavi etmek için tercih edilen tedavi olarak16. Pozitif kontrol olarak kullanılan TFT tedavi edilen kornea grupları daha düşük enfeksiyon yayılımı gösterir. Negatif kontr...

Watch this Scientific Journal Video about Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals at JoVE.com

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için bir porcine korneasının kullanımını açıklıyoruz.

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

İlaçların hayvan modellerindeki etkinliğini anlamak maliyet ve emek yoğundur. Eks vivo doku eksplant modeli kullanan protokolümüz hem maliyet hem de çalışmayı yürütmek için gerekli bilimsel personel açısından önemli ölçüde daha düşüktür. Bu tekniğin ana avantajı, diğer bazı küçük hayvan modellerinin aksine insan gözlerine çok benzeyen anatomi ve fizyolojiye sahip porcine gözlerinin kullanılmasıdır.İlaçları in vitro olarak test ettiğimizde, hayvan veya insan modellerinde bulunmayan etkinliği gösterebilirler. Ex vivo doku sistemleri, in vitro sistemlerimizin hayvan ve insan denemelerine çevrilip çevrilmediğini anlamanın en iyi yoludur. Porcine kornea sistemi, daha az emek yoğun olmasına rağmen, ilaçları izole etmek, sürdürmek, enfekte etmek ve tedavi etmek için eğitilebilir beceriler gerektirir, özellikle korneanın tüm porcine gözünden izolasyon süreci kelimelerle ifade etmek zordur, ancak görsel gösteri gerektirir.Uygun bir satıcıdan porcine gözleri aldıktan sonra, dokuları işleme kadar buzda saklayın ve uygun kişisel koruma ekipmanını takın. Çalışma alanını %70 etanol ile dezenfekte edin ve çalışma alanına bir tezgah kapağı sabitleyin. Çalışma alanı hazır olduğunda, gözleri 50 milimetrelik bir gazlı bez parçasına yerleştirin ve arka bölümü tek elle kavramak için gazlı bezi kullanın.30 kalibrelik bir iğne kullanarak, gözün epitel yüzeyinin yaklaşık merkezinde dikkatlice tek bir delinme yapın, stromaya zarar vermemeye dikkat edin ve korneadan bir milimetre mesafede sklera üzerinde küçük bir kesi yapmak için keskin bir sterilize bıçak kullanın. Elin hızlı ve pürüzsüz bir şekilde dönen bir eylemini kullanarak ve vitreus mizahının sızmadığına dikkat ederek, korneanın kenarını kesin ve kornea-sklera kenarında düz bir cımbızla tutun, kalan bağlama zarlarını kesmek için bıçağı kullanın. Her kornea izole edildikçe, dokuları kuyu başına iki mililitre kornea ortamı içeren 12 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına yerleştirin ve her kornea yüzeyindeki enkaz alanına 17 GFP virüs çözeltisinin beşinci plak oluşturan ünitesine beş kez 10'un beş mikrolitresini ekleyin.Tüm kornealar toplandığında, plakayı 37 santigrat dereceye, 72 saat boyunca% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve deneyde kullanılmayan ek gözleri biyolojik tehlike torbalarında güvenli bir şekilde bertaraf etmeleri için% 10 çamaşır suyu ile püskürtün. İlaçların eklenmesinden önce her gün kornea plakasını stereo mikroskop altına yerleştirin ve GFP filtresini ve 500 mikrosaniyelik maruz kalma süresini seçin. Tüm viral yayılma ve dendrit oluşumu net bir şekilde görselleştirilebilene kadar korneaları bir dizi artan büyütmede görüntülemeden önce görüntüleri en düşük büyütmede yakalayın.Tüm kornealar görüntülendiğinde, plakayı doku kültürü inkübatörüne geri verin. Enfeksiyondan bir gün önce, bir izdiah vero hücre kültürünü yıkama başına 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca kuyu başına% 0.05 trypsin mililitresi ile tedavi edin. Hücreler ayrıldığında, hücrelerin şişe yüzeyinden tamamen yerinden çıkmasını sağlamak ve elde edilen hücre süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için dokuz mililitrelik tüm ortamı kullanın.Yeni altı kuyu plakasının her kuyusuna 300 mikrolitre hücre ekleyin, ardından her kuyuya iki mililitre orta ekleyin, ardından plakayı bir gecede hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, virüsü nicelleştirme için her korneadan toplamak için, steril pamuklu çubuk uçlarını, bir biyogüvenlik kabininde birden fazla mikrosantrifüj tüpünde svap başına 500 mikrolitre serumsuz ortamda en az beş dakika bekletin. Kuluçkanın sonunda, enfekte porcine kornea kültürlerini dikkatlice kabine yerleştirin.Islak pamuklu çubukları kullanarak, aşırı basınç uygulamadan her enfekte porcine korneanın merkezinden saat yönünde üç devir ve saat yönünün tersine üç devir yapın. Devir serisinin sonunda, serumsuz orta dolgulu mikrosantrifüj tüpündeki her bir çubuğu saat yönünde ve saat yönünün tersine beş kez döndürün, böylece uçlar kapak kapalı olan her tüpün içine sığar. Tüm kornealar temizlendiğinde, tüpleri bir dakika boyunca yüksek hızda girdapla.Her korneadan toplanan virüs miktarını ölçmek için, mikrosantrifüj tüplerinde serumsuz ortamda virüsün bir kat seyreltilmesini, negatif sekize bir kez 10'luk bir seyreltmeye ulaşılana kadar hazırlayın. Büyüme ortamını her hücre kuyusundan epire ettikten sonra, bir kere 10'dan başlayan her virüs seyreltmesinin bir mililitresini plakalı hücre monolayerlerine negatif üçe aktarın ve enfekte hücreleri iki saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, 72 saatlik bir inkübasyon için veya plak oluşumu gözleninceye kadar her kuyuya iki mililitre metilselüloz yüklü ortam eklemeden önce pbs ile her kuyuyu iki kez hafifçe yıkayın.Plak gözlemi üzerine, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için her kuyunun köşesine yavaşça bir mililitre metanol ekleyin. Kuluçkanın sonunda, hücre monolayerini rahatsız etmeden her kuyudaki içeriği yavaşça aspire edin. Daha sonra, her bir kuyuyu bir mililitre kristal mor çalışma çözeltisi ile etiketlenin, tüm hücrelerin ışıktan korunan 30 dakikalık bir inkübasyon için kaplandığına dikkat edin.Kuluçkanın sonunda, çözeltiyi atın ve kuyuları emici bir kağıt tabakası üzerinde kurutun, ardından başlangıç çözeltislerindeki toplam virüs içeriğini üç kez ölçmek için plak sayısını en yüksek seyreltme kuyusunda sayın. Bu stereoskopik floresan görüntüleme analizinde gözlemlendiği gibi, BX795'in antiviral etkinliği viral yayılmayı kontrol etmede TFT'ninkine benzerken, araçla tedavi edilen kornealar virüsün merkezi enfeksiyon bölgesinden çevreye yayılmasını sadece ilk viral aşılamadan altı gün sonra göstermektedir. Benzer şekilde, enfeksiyon sonrası ikinci ve dördüncü günlerde alınan oküler sürüntüler pozitif kontrol ve BX795 ile tedavi edilen örneklerde tam bir virüs inhibisyonu sergilerken, negatif kontrol örneklerinde enfeksiyöz virüs titresinde keskin bir artış gözlenmektedir.Porcine korneasının tüm porcine gözünden izolesi en önemli adımdır. 2.3 ile 2.6 arasında adımlar bu süreçte en önemli olanıdır. Modelimiz, virüsün porcine kornealarındaki dendritik yayılımını anlamak için kullanılabilir.Bu yöntem bakteriyel ve mantar enfeksiyonlarına da doğru genişletilebilir. Bu yöntem, virüsün kornealarda bir insan modeli dışında dendritik yayılmasını görselleştirmeye yardımcı olmuştur. Bu model, hayvan ve insan denemelerine geçmeden önce ilaçların etkinliğini test etmede yardımcıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Yükselen Bulaşıcı Patojenlerin Giderilmesi İçin El Yıkama Etkinliğini Test Etmenin Bir Metodu

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...