Name: fixed target serial data collection at diamond light source
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل iNEXT-Discovery (منحة 871037) الممولة من برنامج أفق 2020 للمفوضية الأوروبية.

جمع بيانات السنكروترون التسلسلي هو تقنية جديدة نسبيا في خطوط الحزم MX، سد الفجوة بين مجموعات البيانات فائقة السرعة التي يجري تنفيذها حاليا في XFELs وMX التقليدية القائمة على السنكروترون. تهدف هذه المخطوطة إلى إعطاء نظرة عامة على كيفية جمع البيانات التسلسلية المستهدفة الثابتة بنجاح في الحزمة I24، ومصدر الضوء الماسي للجرعة المنخفضة، وسلسلة الجرعة، والتجارب التي تم حلها زمنيا. كما هو الحال مع علم البلورات القياسية، وإعداد العينة هو عنق زجاجة رئيسية في حل الهيكل. SSX لا يختلف، وإعداد الطين الكريستال متجانسة بكميات كافية لم يستفد بعد من عدة عقود من الدراسة والصقل مثل نمو بلورات البروتين الكبيرة واحدة لديها. ومع ذلك ، فإن إعداد هذه الملاط خارج نطاق هذه الورقة وتم تلخيصه في مكان آخر36. تتضمن الخطوة الحاسمة في النهج الموضح هنا الاستخدام الدقيق للعينة المتاحة باستخدام واجهات واجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام (الخطوة 3) وخطوط أنابيب معالجة البيانات الآلية (الخطوة 6) لإعلام تحميل الشريحة (الخطوة 1) وكيفية المضي قدما في التجربة.
خط أنابيب ردود الفعل السريع هو أداة قوية تسمح للمستخدمين بتقييم معدلات الإصابة الأولية أثناء جمع البيانات لإعلام بروتوكولات تحميل الشرائح اللاحقة لجمع البيانات بنجاح. عندما تواجه انخفاض معدل ضرب (<5٪)، المستخدمين خطر جمع البيانات غير مكتملة و / أو إضاعة وقت البث مع مجموعات إضافية. وفي هذه الحالة، يمكن تجميع العينة، وتركيزها بواسطة جهاز طرد مركزي لطيف، و/أو تحميل كميات أكبر في الخطوة 1-5. معدل ضرب أعلى مواتية عموما، ومع ذلك، هناك نقطة من تناقص العائد حيث الحمل الزائد يؤدي إلى بلورات متعددة في نفس البئر. DIALS قادرة على التعامل مع بيانات الحيود متعددة شعرية50، ولكن مصدر قلق أكبر من الفهرسة والتكامل هو تأثير ضار تجمع الكريستال يمكن أن يكون على تفعيل بلورات حتى بواسطة ضوء الليزر أو خلط سريع للتجارب حل الوقت الدقيق. ولذلك ينبغي توخي الحذر بشكل خاص لتجنب إثقال كاهل الأهداف الثابتة للتجارب التي يتم حلها في الوقت المناسب.
تنتج خطوة معالجة الفهرسة والتكامل مؤامرة مع الصليب المركزي الذي يمثل اتجاه الحزمة ، كل نقطة تمثل اتجاه انعكاس hkl 001 لل شعريات فردية ، والحلقة الخارجية للدائرة التي تمثل دوران 90 درجة بعيدا عن محور الحزمة. وهذا سوف تظهر إذا بلورات لديك التوجه المفضل، والتي قد تؤثر على اكتمال البيانات وتشير إلى الحاجة إلى جمع المزيد من البيانات أو تختلف بروتوكول التحميل. في اللوحة اليسرى من الشكل 7c، يظهر تأثير التحميل الزائد لشريحة مع بلورات HEWL. كما فتحات ملء مع المزيد من بلورات، فإنها تتمسك الجدران الزاوية من الفتحات بدلا من الالتصاق في القاعدة في اتجاه عشوائي. القطع الناقص المتعامد اثنين هي نتيجة بلورات ملقاة على الجدران الداخلية للرقاقة التي هي في ~ 35 ° إلى اتجاه شعاع. وهذا يقلل من حجم البلورات المحملة، ويقلل من معدل ضرب، ويقلل بشكل كبير من جزء من بلورات الكذب في هذه الطائرات المفضلة.
وتجدر الإشارة إلى أن هناك نهوجا تسلسلية أخرى متاحة في I24، مثل مقذوفات LCP ورقائق الفلوريد الدقيق. هذه استخدام GUIs مماثلة وخطوط أنابيب المعالجة نفسها الكثير مما سبق ستظل قابلة للتطبيق حتى لو تم استخدام تقنية مختلفة. يوجد عدد من النهج التسلسلية لكل من SSX و SFX خارج نهج الهدف الثابت الموصوف هنا ، لكل منهما مزايا معينة على الآخر اعتمادا على التجربة التي سيتم إجراؤها وخط الحزم المستخدم في التجربة. كما النهج التسلسلية تتطور بسرعة فمن المستحسن للتحقق من صفحات الويب الحزمة (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) للحصول على التحديثات الأخيرة والتحدث إلى موظفي الحزمة في أقرب مرحلة ممكنة عند التخطيط beamtime. الوصول إلى I24 للتجارب القياسية والمسلسل مجاني عند نقطة الاستخدام. بالنسبة لمستخدمي المملكة المتحدة والاتحاد الأوروبي، يتم تغطية تكاليف السفر والإقامة جزئيا من خلال iNEXT Discovery.

المسلسل البلورات السنكروترون (SSX) هو وسيلة ناشئة لجمع البيانات التي كانت مستوحاة من أشعة الليزر الإلكترونية الحرة (XFEL)1،2،3. في XFEL ، يتم تسجيل نمط حيود واحد من بلورة بروتين صغيرة جدا عادة ، قبل تدمير الكريستال بواسطة نبض الأشعة السينية الساطع للغاية. وهذا يعني، عادة، أنه يجب إدخال بلورة جديدة في شعاع الأشعة السينية للحصول على نمط آخر الحيود4. هذه الحاجة إلى تجديد بلورات باستمرار قد دفعت تطوير العديد من تقنيات تسليم العينات المسلسل5.
في السنكروترونات ، يتم تطبيق طرق كريستالوغرافيا الدوران الكلاسيكية (غير التسلسلية) على نطاق واسع ، مستغلة بلورة واحدة كبيرة يتم تدويرها في شعاع الأشعة السينية باستخدام مقياس اليونيمتر لجمع مجموعة بيانات كاملة لحل الهيكل6. من أجل زيادة عمر البلورات بحيث يمكن جمع مجموعة بيانات كاملة7،8، وأيضا لتسهيل الشحن ونقل العينة الآلي ، يتم تبريد البلورات إلى ~ 100 K لجمع البيانات. في خطوط الحزم microfocus مكثفة، وتستخدم استراتيجيات متعددة الكريستال في كثير من الأحيان كما يمكن أن يمنع الضرر الإشعاعي جمع مجموعة بيانات كاملة من الكريستال واحد9،10،11. وعلى الرغم من الحدود التي يفرضها الضرر الإشعاعي، فإن عدد البلورات المستخدمة لا يزال متواضعا نسبيا والنهج المستخدم مطابق أساسا لتجربة الكريستال الواحدة.
من ناحية أخرى ، يستخدم SSX تسليم العينة التسلسلية للحصول على أنماط حيود واحدة لا تزال من آلاف البلورات الموجهة عشوائيا لإنشاء مجموعة بيانات كاملة. ويلاحظ أن التقنيات التسلسلية التي تتضمن دوران الكريستال قيد التطوير12،13 على الرغم من أننا نركز على لا يزال ، صفر التناوب ، والنهج. هناك مجموعة واسعة من أنظمة تسليم العينة مع مزايا وعيوب مختلفة14، تتراوح بين تقديم تيار من البلورات في تدفق تركز / لزجةالنفاثة 15،16،17، microfluidic رقاقة18،19، أو بلورات على هدف ثابت مثل رقاقة السيليكون محفورة20،21 . عادة، يتم الاحتفاظ بلورات في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح لمزيد من التنوع التوافقي أن يلاحظ وتوفير بيئة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية22. SSX تمكن من جمع مجموعات بيانات جرعة منخفضة جدا23،كما الجرعة الإجمالية من مجموعة البيانات يعادل التعرض للأشعة السينية قصيرة واحدة من بلورة واحدة. ميزة رئيسية أخرى SSX يوفر هو دراسة ديناميات البروتين من خلال أساليب حل الوقت، مع ردود الفعل الناجمة عن التعرض للضوء الليزر24،25،26،27أو عن طريق خلط بلورات و ligand / الركيزة28،29. استخدام بلورات أصغر يعني ضوء الليزر يمكن أن تخترق كامل من الكريستال، والشروع بشكل موحد رد الفعل دون امتصاص متعددفوتون لتوفير وسيطة رد فعل محددة جيدا لبيانات الحيود التي اتخذت في نقاط زمنية مختلفة27. استخدام بلورات أكبر وطرق جمع البيانات القائمة على التناوب يعاني من عمق اختراق الليزر محدودة، وتنشيط nonuniform أو متعددةفوتون، والأضرار الإشعاعية، والوقت الزائد الميكانيكية داخل عمليات مسح البيانات، مما أدى إلى مزيج من وسيطة رد الفعل التي يمكن أن يكون من الصعب أو المستحيل لتفسير بسرعة رد فعل أسرع. بلورات أصغر توفر ميزة مماثلة في خلط التجارب، كما يمكن ليغاندس بسرعة وأكثر انتشارا موحدة في جميع أنحاء الكريستال، ومرة أخرى السماح وسيطة رد فعل محدد ليتم تسجيلها في تأخير وقت مختلف30،31،32.
في الماس microfocus الحزمة I24 يمكن إجراء كل من التناوب التقليدية والتجارب SSX. هنا يتم تقديم بروتوكول شامل لإعداد عينات SSX وجمع البيانات باستخدام أهداف ثابتة في I24 وبروتوكولات لتحليل البيانات من البيانات التسلسلية في الماس. في حين أن المخطوطة ومقاطع الفيديو المصاحبة لها يجب أن تسمح للمستخدمين بإجراء تجربة SSX ناجحة في I24 ، تجدر الإشارة إلى أن هذا مجال يتطور بسرعة والنهج تتطور باستمرار. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن الأساليب التسلسلية متوفرة في مصادر السنكروترون الأخرى، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر البتراء الثالثة (P14-TREXX)، ماكس الرابع (BioMAX)33،SLS (PXI و PXII)34،وNSLS (FMX)35. وفي حين أن تفاصيل جمع البيانات المتسلسلة ومعالجتها ستختلف بين المصادر، فإن المبادئ الأساسية ستظل كما هي. وينبغي النظر إلى البروتوكولات أدناه على أنها تمثل نقطة انطلاق ومسارا إلى معسكر القاعدة بدلا من مؤتمر قمة ما يمكن تحقيقه.
يفترض هذا البروتوكول أن المستخدمين لديهم نظام بلوري بروتين أو جزيء صغير ، يتم من خلاله إنتاج ملاط ميكروكريستال بترتيب 0.5-2.0 مل مع كثافة جيدة من البلورات الدقيقة لكل مل. وقد وصفت بروتوكولات للحصول على الطين الكريستال سابقا 36. تتوفر العديد من الأنواع المختلفة من الأهداف الثابتة ، وتستخدم الأكثر شيوعا في I24 رقاقة السيليكون المحددة بدقة. من أجل التفريق من تخطيطات رقاقة أخرى، أدناه وفي واجهة خط الحزمة وهذا ما يشار إليه باسم "رقاقة أكسفورد". كما سبق وصفها تخطيط رقاقة أكسفورد يتكون من 8×8 'كتل المدينة'، كل منها يحتوي على 20×20 فتحات لما مجموعه 25600 فتحات20،21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chip Holders</td>
			<td>Custom Built</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chipless Chip Spacers</td>
			<td>SWISCII</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geobrick LV-IMS-II</td>
			<td>Delta Tau</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A&#160;multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mounts</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td>Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNF Laboport Vacuum Pump</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z262285-1EA</td>
			<td>Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 6 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15360562</td>
			<td>300 ft roll of 6 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 3 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-675-4</td>
			<td>300 ft roll of 3 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>91000</td>
			<td>A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Chips</td>
			<td>University of Southampton</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1byOne Humidifier (701UK-0003 )</td>
			<td>1byOne</td>
			<td>B01DENO0EQ</td>
			<td>Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixed target serial data collection at diamond light source

جمع البيانات التسلسلية هو تقنية جديدة نسبيا لمستخدمي السنكروترون. دليل المستخدم لجمع البيانات المستهدفة الثابتة في I24 ، يتم تقديم مصدر ضوء الماس مع تعليمات مفصلة خطوة بخطوة ، والأرقام ، وأشرطة الفيديو لجمع البيانات على نحو سلس.

جرعة منخفضة جمع البيانات وسلسلة جرعة منخفضة (الخطوة 5.1: السيناريو 1) وسلسلة الجرعة (الخطوة 5.2: السيناريو 2) تم جمع البيانات على بلورات النتريت النحاسي الاختزالي الدقيق في I24 ونشرت سابقا 42. تم إعداد جميع العينات كما هو موضح في الخطوة 1، والبيانات التي تم جمعها وفقا للخطوات 3 و4 و5، ومعالجتها باستخدام أساليب في الخطوة 6. في هذا العمل تم جمع سلسلة جرعة سريعة مع 20 صورة حيود التقطت في كل فتحة (أي n= 20 في واجهة المستخدم الرسومية لجمع البيانات الموضحة أعلاه) قبل الانتقال إلى عينة جديدة. من هذه البيانات تم تحديد توزيع ثنائي الوسائط لخلايا الوحدة في المجموعة الفضائية P213 (أ = ب = ج = 97.25 Å، و = ب = ج = 96.38 Å). وقد أظهر تحديد وفصل هذه الأشكال المتعددة للخلايا الموحدة للمعالجة تحسنا ملحوظا في مؤشرات جودة البيانات وكشف عن هيكلين مختلفين في حلقة مرنة بين المخلفات 189-193 بدلا من الحالة المختلطة التي لوحظت عند معالجة جميع البيانات معا. ويمكن أن يحدث تحديد هذه الأشكال المتعددة كل الفرق في دراسة هيكلية دقيقة تم حلها زمنيا حيث لا يتوقع سوى تغييرات هيكلية صغيرة. وعلاوة على ذلك، كشفت سلسلة الجرعة التي تم جمعها عن تغيير خلية وحدة تعتمد على الجرعة في الكريستال، مع زيادة الجرعة تحويل السكان لصالح أكبر وحدة الخلية.
تم تنفيذ عمل مماثل من قبل إبراهيم وآخرون (2019)47، حيث تم جمع سلسلة جرعة (الخطوة 5.2: السيناريو 2) من نوع صبغة هيمي بيروكسيديز من Streptomyces lividans (DtpAa) لمقارنة هياكل الجرعة المنخفضة من SSX (الخطوة 5.1: السيناريو 1) مع تلك التي تقاس في نفس النظام المستهدف الثابت باستخدام SFX. تم جمع بيانات SFX في SACLA Beamline BL2 EH3 بطول نبض يبلغ 10 فيمتوثانية ومعدل تكرار 30 هرتز. تضمن مدة النبض 10 femtosecond أن الآثار التي تعتمد على الجرعة غير موجودة في بيانات SFX. تمت مقارنة بيانات SFX ببيانات SSX التي تم جمعها على خط الحزم I24، حيث تم قياس 10 التعرضات المتتالية 10 مللي ثانية في كل موضع عينة (أي n= 10). ولوحظت هجرة الجرعة المعتمدة على جزيء الماء المنسق من الحديد الهيم بعيدا عن الحديد، فضلا عن تغيير تشكيلي في واحدة من مجموعات بروبيونات الهيم في سلسلة جرعات SSX. على الرغم من عدم خلوها من الضرر مثل هيكل SFX ، إلا أن سلسلة الجرعة سمحت باستقراء طول سند Fe-O لمجموعة بيانات ذات جرعة صفرية (فيريس هيم) ، مع الاتفاق على ذلك ضمن خطأ تجريبي مع القيمة التي تم الحصول عليها من SFX.
كما يمكن تكييف طرق جمع بيانات البلورات المتسلسلة الموصوفة هنا بسهولة لتوفير بيئات عينة جديدة، على سبيل المثال، لدراسة هياكل البروتين اللاهوائي في درجة حرارة الغرفة. كما هو موضح في Rabe et al 2020 48، يتيح تحميل عينة "ورقة على ورقة" ، أو "رقاقة بدون رقاقة" ، مع أفلام ختم مختلفة في غرفة أنروبية جمع درجة حرارة الغرفة من البيانات الهيكلية من العينات الحساسة للديوكسيجين.
مضخة التحقيق على الرغم من أن النتائج التمثيلية التالية لم يتم جمعها في Diamond Beamline I24 ، فقد تم تطوير هذه الأساليب بالتعاون الوثيق بين المرافق في برنامج iNEXT للعمل على الأساليب القياسية في تطوير طريقة البلورات التسلسلية. تقدم Beamline I24، أو ستقدم قريبا، أساليب تجميع مكافئة لتلك الموضحة أدناه لإجراء مثل هذه التجارب باستخدام الأساليب الموضحة في البروتوكولات أعلاه.
مضخة التحقيق : خلط السريع تم إجراء خلط سريع SSX في beamline T-REXX في PETRA III من قبل Mehrabi وآخرون (2019) 28 باستخدام حاقن قطرة مدفوعة بيزو لبدء ردود الفعل على أهداف ثابتة. يقدم هذا العمل دليلا على المبدأ على تجربة خلط الرقائق الملزمة GlcNac3إلى البلورات الدقيقة lysozyme ، مع الربط الذي يحدث في غضون 50 مللي ثانية من قطرة 75 pL التي يتم تطبيقها على العينة. تمت متابعة هذه الدراسة مع سلسلة من 7 هيكل الوقت حل النشاط ايزوميراز xylose، مما يدل على ربط الجلوكوز في غضون 15 مللي ثانية وتشكيل تشكيل حلقة مفتوحة في جزيء الجلوكوز بعد تأخير 60 مرة ثانية. إعداد مكافئ لحقن القطيرات قيد التطوير حاليا للاستخدام على I24.
مضخة التحقيق: التنشيط الخفيفة يتم تقديم تجربة تسلسلية مضخة مسبار تنشيط الضوء في شولتز وآخرون (2018) 49. تم نقع فلورواسيتات ديهيدروجيناز مع فلورواسيتات الكواسيد وضخها مع ضوء الليزر 320-360 نانومتر لإنتاج هياكل في 4 نقاط زمنية (ر = 0، 30، 752، و 2052 مللي ثانية). يظهر هيكل حالة الراحة (0 مللي ثانية) موقعا نشطا فارغا ، باستثناء عدد قليل من جزيئات الماء ، وكثافة مكافئة بين نطاقات الغطاء لكل من الوحدات الفرعية للبروتين. 30 مللي ثانية و 752 مللي ثانية بعد تنشيط الضوء يمكن ملاحظة انخفاض كبير في كثافة الإلكترون في مجال الحد الأقصى للوحدات الفرعية B بالنسبة إلى الوحدة الفرعية A. يتزامن انخفاض كثافة الإلكترون في نطاق الغطاء من الوحدة الفرعية B مع ظهور الفلورواسيتات في الموقع النشط للوحدات الفرعية A عند 752 مللي ثانية. تظهر مجموعة البيانات النهائية التي تبلغ 2052 مللي ثانية المزيد من إعادة الترتيب الهيكلي لليغند ، المشتبه في تسهيل الهندسة الصحيحة لهجوم SN2 ، والتكوين المحتمل لحالة وسيطة في رد الفعل. على I24، يمكن استخدام نظام ليزر فاروس المحمولة التي هي غير قادر من 210-2500 نانومتر توفير نبضات femtosecond لتنشيط الضوء. وأظهرت التجارب الأولية التنشيط الناجح للفوتوكاج باستخدام 308 نانومتر الإثارة مع ربط ليغاند صدر إلى البروتين المستهدف لوحظ. وفي وقت كتابة هذا التقرير، كان الاندماج في نظام سلامة موظفي خط الحزم جاريا، ومن المتوقع إجراء تجارب روتينية على المستخدمين في أوائل عام 2021. بالنسبة للتجارب عندما تكون نبضات الضوء أقل كثافة، تم إجراء تنشيط الضوء باستخدام مصابيح LED التي يتم التحكم فيها بواسطة TTL بنجاح.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> الشكل 1:معدات تحميل العينات في مكانها في مصدر ضوء الماس. يتكون الإعداد من مضخة فراغ (أ) ، صندوق قفاز (ب) ، ومرطب (ج). داخل القفازات مربع فراغ الضغط يستخدم للعمل على رقاقة محملة الطين الكريستال عقد في كتلة عينة (د) تعلق على قارورة بوشنر(ه، السهم الأخضر) ، عن طريق منظم الضغط(و، السهم الأصفر) تعلق على stopcock (ز، السهم الأزرق). يتم ضخ الهواء الرطب في الخيمة عن طريق أنابيب بلاستيكية متصلة بالرطوبة (ح) ، ويتم قياسها باستخدام مقياس الرطوبة(i). وتعقد المكونات في مكان باستخدام المشبك تقف (ي). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> الشكل 2:أصحاب العينة. أنها تستخدم المعدنية O-حلقة (أ) لمشبك البوليستر الفيلم على أعلى (ب) وأسفل (ج) نصف, مع النصف السفلي الرياضية يتصاعد المغناطيسي (د) التي تستخدم لإرفاق حامل العينة إلى مراحل العينة. فيلم البوليستر (6 ميكرومتر (ه) أو 3 ميكرومتر (و)) وكذلك المطاط O-حلقات (السهام البيضاء) منع رقاقة محملة بالكريستال من التجفيف بسرعة في حامل العينة التي يتم إغلاق ضيق مع مسامير سداسي عشري (ز). يتم تنظيف رقائق باستخدام حمامات متتابعة لمدة 15 دقيقة في DH2O، 1 M HCl، وDH2O (ح). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> الشكل 3: جمع البيانات GUI لجمع البيانات المستهدفة الثابتة في I24. (أ) يظهر الواجهة الرئيسية المستخدمة لمحاذاة رقائق وتحديد معلمات جمع البيانات،(ب)هو واجهة رسم الخرائط لايت المستخدمة لتحديد المناطق الفرعية من رقاقة لجمع البيانات و (ج) هو واجهة لتحديد المعلمات للإضاءة الليزر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> الشكل 4:عملية تركيب حامل رقاقة على مراحل كما هو موضح في الخطوة 3، النقطة 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> الشكل 5: محاذاة رقاقة. يتم محاذاة رقاقة عن طريق النقر على ثلاث علامات fiducial على رقاقة هو مبين في (أ). تظهر في (ب) و (ج) و (د) طرق عرض fiducials 0 و 1 و 2 من خلال نظام عرض الحزمة على المحور . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> الشكل 6:يعرض نتائج المعالجة التلقائية التي تم إطلاقها كما هو موضح في الخطوة 6.1. يتم عرض مخطط معدل ضرب تحديث (a, inset). إذا تم النقر فوق "ضرب" على صورة الحيود المقابلة يتم عرضها في عارض الصور بطلب. يتم عرض معدل الوصول لتجميع البيانات الحالي (29.6٪ في هذا المثال). لوحة (ب) يظهر مثالا على نافذة تبين معدلات الفهرسة والتكامل الحالية للبيانات التي تم جمعها حتى الآن خلال الزيارة التي التحديثات في الوقت الحقيقي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> الشكل 7: تحليل أكثر تعمقا للبيانات. يمكن أن يكشف التصور لمعلمات خلية الوحدة عن تعدد الأشكال(أ). يتم حساب متوسط معلمات خلايا الوحدة؛ ومع ذلك، هذا لا يمتد حتى الآن إلى المتوسطات الفردية لتعدد الأشكال. غالبا ما يكون تصور مجموعة فرعية صغيرة من البيانات (البيانات المعروضة مجموعة فرعية من 793 بلورة اختزال نتريت نحاسية من البيانات الموصوفة في إبراهيم وآخرون 2019) كافيا للكشف عن الاتجاهات. ويمكن أيضا إنتاج قطع من المعلمات المفيدة ثنائية الأبعاد للكشف عن الاختلافات التي تنشأ بسبب تأثيرات التحميل أو الجفاف التي يمكن معالجتها لمجموعات البيانات القادمة(ب). يمكن أن تكشف الإسقاطات المجسمة عن وجود أو غياب التوجهات المفضلة التي تغذي بروتوكول التحميل (ج). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

نقدم دليلا شاملا لإعداد عينة الهدف الثابت، وجمع البيانات، ومعالجة البيانات للبلورات السنكروترون المسلسل في الماس الحزمة I24.

مجموعة بيانات تسلسلية هدف ثابت في مصدر ضوء الماس

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

المسلسل البلورات السنكروترون ، أو SSX ، هو مجال جديد نسبيا وسريعة التطور من MX.It مناسبة تماما لجرعة منخفضة وتجارب درجة حرارة الغرفة ، ولكن ربما الأهم من ذلك ، انها حقا مناسبة تماما لديناميات التالية. وهذا يسمح للأفلام وقف الحركة من البروتينات في العمل التي يتعين القيام بها. في I24، تتوفر أوضاع متعددة من SSX.يركز هذا البروتوكول على SSX ذات الهدف الثابت، والتي تسمح بمجموعة واسعة من التجارب التسلسلية باستخدام كميات محدودة من العينة. يمكن أن تتلف رقائق السيليكون عند تحميلها وتنظيفها ، إذا كنت غير مألوف بها. أيضا ، بروتوكول محاذاة رقاقة جديدة تماما لكثير من crystallographers ، ومعالجة البيانات يختلف قليلا عن البيانات الخاصة بك دوران القياسية.لإعداد حامل رقاقة، وقطع ورقتين من رقائق البوليستر إلى ما يقرب من 6 في 6 سم مربع، ووضع الأوراق على لوحات قاعدة اثنين. باستخدام حلقات ختم معدنية، وإصلاح الأوراق في مكان، ثم سحب بعناية على احباط الزائدة لإزالة أي التجاعيد. بعد ذلك ، حدد رقاقة السيليكون ذات الفتحات المناسبة الحجم بالنسبة لحجم البلورات التي سيتم تحليلها.توهج تفريغ رقاقة لمدة 25 ثانية في 0.39 ملليبار، مع تيار 15 مللي أمبير. استخدام ملاقط لوضع رقاقة السيليكون على مرحلة تحميل رقاقة، مع القضبان التي أثيرت تواجه أسفل. ثم، وذلك باستخدام ماصة، وتطبيق 200 ميكرولتر من الطين microcrystal إلى الجانب المسطح من رقاقة، ونشر الطين لتغطية جميع كتل المدينة من رقاقة.إذا تضررت رقاقة، وتغطية أي ثقوب مع قطعة صغيرة من رقائق البوليستر، لضمان أن فراغ حتى يمكن تطبيقها. ثم تطبيق فراغ لطيف لتنشق كل من السائل الزائد من خلال رقاقة. قم بإزالة الشريحة من مرحلة تحميل الشريحة، ولطخ بعناية الجانب السفلي من الشريحة بورق تصفية لإزالة السائل الزائد.ضع الشريحة المحملة على النصف الأكبر من حامل الشريحة بين علامات الدليل ، الجانب المسطح لأسفل. ضع النصف الصغير من حامل الشريحة على الشريحة لختمها. يجب أن ينفجر نصفي حامل الشريحة في مكانه.ثم، وذلك باستخدام مسامير هيكس، إصلاح رقاقة بأمان في مكان. لمحاذاة الشريحة، أمسك حامل الشريحة بزاوية 30 درجة أثناء الاقتراب من الحامل. ثم استخدم يتصاعد الحركية لوضع رقاقة محملة على المرحلة XYZ في خط شعاع.عندما المغناطيس إجراء اتصال، والسماح لحامل رقاقة لتدوير موازية لتدفق، وانقر في مكانه. بمجرد وضع الشريحة ، استخدم نظام عرض الحزمة على المحور وواجهة المستخدم الرسومية لمحاذاة الشريحة لتحديد موقع أعلى fiducial الأيسر للشريحة. للتوسيط على fiducial 0 في X و Y و Z ، انتقل إلى داخل وخارج التركيز لمحاذاة Z ، صعودا وهبوطا لمحاذاة Y ، واليسار واليمين لمحاذاة X.Then انقر فوق Set Fiducial 0 "بعد محاذاة fiducial 1 و 2 مع شعاع الأشعة السينية بنفس الطريقة ، انقر فوق إنشاء نظام تنسيق" لتوليد مصفوفة تنسيق.ثم انقر فوق "فحص كتلة" لنقل المرحلة XYZ إلى البئر الأول من كل كتلة المدينة. إذا كانت خطوط مرمى الأشعة السينية مع الفتحات، يتم محاذاة الشريحة. في هذا التمثيل الرسومي لنتائج البحث الفوري من DIALS يمكن ملاحظة مؤامرة معدل ضرب تحديث.إذا تم النقر فوق ضربة، سيتم عرض صورة الحيود المقابلة في عارض الصور DIALS. في هذا الجدول، يمكن تصور معدلات الفهرسة والتكامل الحالية التي يتم تحديثها في الوقت الفعلي أثناء جمع البيانات أثناء الزيارة. يمكن أن يكشف التصور لمعلمات خلية الوحدة عن تعدد الأشكال.ويمكن أيضا إنتاج مؤامرات ثنائية الأبعاد من المعلمات المفيدة للكشف عن الاختلافات التي تنشأ بسبب تحميل أو آثار الجفاف. يمكن أن تكشف الإسقاطات المجسمة عن وجود أو عدم وجود التوجهات المفضلة التي يمكن تغذيتها مرة أخرى في بروتوكول التحميل. على سبيل المثال، في هذا الإسقاط، يمكن ملاحظة آثار إثقال رقاقة مع بلورات lysozyme.عند تحميل رقاقة، ماصة ببطء واستخدام إصبعك للراحة ماصة فوق رقاقة. هذا يمنعك من لمس رقاقة وطعن بطريق الخطأ ثقوب في السيليكون. عند معالجة البيانات، استخدم خطوط الأنابيب المؤتمتة المتاحة.هذا وسوف تعطيك فكرة جيدة عن كيفية تقدم تجربتك، وإذا كنت بحاجة إلى تغيير شيء. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام البروتين التي يمكن بلورتها بكميات كبيرة. ويمكن أن يحدث رد الفعل عن طريق الأشعة السينية الخفيفة أو الاختلاط السريع.يمكن للدراسات الديناميكية على سلسلة من الهياكل أن توفر نظرة ثاقبة حول كيفية عمل البروتينات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

تحليل بيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة -SAXS عن طريق إزالة الفولفورة والإيفاد في EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

بروتوكول تحضير العينات ونقلها لعلم البلورات طويل الطول الموجي داخل الفراغ على خط الشعاع I23 في مصدر ضوء الماس

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...