Name: fixed target serial data collection at diamond light source
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af iNEXT-Discovery (Grant 871037), der blev finansieret af Horizon 2020-programmet fra Europa-Kommissionen.

1. Forberedelse og indlæsning af en chip
BEMÆRK: Processen foregår i et fugtstyret miljø (Figur 1), typisk mellem 80% og 90% eller højere relativ luftfugtighed, for at forhindre proteinkrystaller i at tørre ud. Når de er indlæst og forseglet, kan krystaller overleve i op til 24 timer. Dette kan dog variere meget mellem krystalsystemer. Inden for kammeret kræves en lavdrevet vakuumpumpe fastgjort til et læssetrin til at holde en siliciumchip (Figur 1), en siliciumchip, en chipholder med polyesterfolie (Figur 2), en p200 pipette, 200 μL pipettespidser, pincet, filterpapir og proteinkrystalslamme.
<ol><li>Forbered en chipholder.<ol>
<li>Skær to ark polyesterfolie i firkanter ca. 6 cm x 6 cm.</li>
		<li>Læg polyesterpladerne over de to bundplader (store og små).</li>
		<li>Fastgør polyesterpladerne på plads ved hjælp af metalforseglingsringene.</li>
		<li>Træk forsigtigt i den overskydende polyesterfolie for at fjerne eventuelle folder for at gøre visualiserings- og centreringsprøver lettere senere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg en siliciumchip med åbninger i passende størrelse (7-30 μm) i forhold til krystallernes størrelse.</li>
	<li>Glow udledes chippen i 25 sekunder ved 0,39 mBar og bruger en strøm på 15 mA for at muliggøre nem spredning af mikrokrystaller på chippen.</li>
	<li>Placer siliciumchippen på spånbelastningsfasen ved hjælp af pincet med de hævede stænger nedad.</li>
	<li>Påfør 200 μL af mikrokrystalslammet på den flade side af chippen ved hjælp af en pipette.</li>
	<li>Spred krystal gyllen til at dække alle "byblokke" af chippen.</li>
	<li>Hvis chippen er beskadiget, skal du dække eventuelle huller med et lille stykke polyesterfolie eller filterpipettespids for at sikre, at der kan påføres et jævnt vakuum.</li>
	<li>Påfør et blidt vakuum, indtil al overskydende væske er suget gennem chippen.</li>
	<li>Fjern chippen fra spånbelastningsfasen med pincet.</li>
	<li>Blotd forsigtigt undersiden af chippen med filterpapir for at fjerne overskydende væske.</li>
	<li>Placer den lastede chip på den større halvdel af chipholderen mellem styremærkerne fladt fra siden nedad.</li>
	<li>Forsegl chippen ved at placere den lille halvdel af spånholderen ovenpå.<ol>
<li>De to halvdele af chipholderen vil snap på plads. Hvis anden halvdel ikke sidder flush, dreje holderen 180 ° til korrekt justere magneter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skru spånholderen lukket med hex bolte for at fastgøre chippen sikkert på plads. BEMÆRK: Alternativt kan en "chipless" chip indlæses på samme måde, med en mindre mængde krystal gylle (~ 15 μL) klemt inde mellem de to lag polyesterfolie i chipholderen 37, eller et mindre volumen kan lastes ved hjælp af en 50 μm tyk dobbeltsidet klæbende afstandslænde, der påføres direkte på polyesterfolien som beskrevet tidligere 38 . Brugen af klæbende afstandslænder gør det også muligt at indlæse flere prøver (eller varianter af prøver som ligand-iblødsætning) på hver chipløs chip. En supplerende belastning tilgang udnytte akustisk drop udslyngning (ADE) til at indlæse silicium chips kan også bruges på Diamond39. ADE gør det muligt at indlæse spåner ved hjælp af mindre mængder krystalslam end pipettebelastning. Det er en særlig nyttig teknik, når prøverne er knappe, selv om gyllens kemiske sammensætning og viskositet skal tages i betragtning.</li>
</ol>2. GUI og opsætning på beamline
<ol><li>Udfør al chipjustering og opsætning til dataindsamling via en simpel EPICS Display Manager (edm) grafisk brugergrænseflade (GUI) (Figur 3a). Dette giver en peg-og-klik-grænseflade til beamline instrumentering og giver inputparametre for Python-baseret dataindsamling. Undervinduer giver yderligere kontrol til opsamling fra underområder af en prøveholder (Figur 3b) eller laser/LED-pumpesondeforsøg (Figur 3c).</li>
</ol>3. Justering af chippen
<ol><li>Placer den indlæste chip på XYZ-scenen ved beamline (vist i figur 4a) ved hjælp af de kinematiske beslag.<ol>
<li>Pas på at undgå at trække faserne langs deres kørselsretning. Magneterne i de kinematiske mounts er ret stærke, så dette kan gøres ganske let ved et uheld.</li>
		<li>Når du nærmer sig holderen, skal spånholderen holdes i en lille vinkel (±30°). Når magneterne kommer i kontakt, skal chipholderen rotere parallelt med gulvet (0°), og chipholderen klikker på plads (Figur 4b).</li>
		<li>Når du fjerner en chip, skal du følge en omvendt sti. Roter og vinkel chippen væk fra faserne, før du trækker chipholderen væk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Find chippens øverste venstre fiducial øverst til venstre ved hjælp af beamline's visningssystem på aksen og chipjusterings-GUI'en. Fiducials er tre kvadrater, to små og en stor, vinkelret på hinanden(Figur 5a). Chippen er tilbage belyst, så chippen vises mørk med åbninger som hvide firkanter.</li>
	<li>Centrer på fiducial nul i X, Y og Z (Figur 5b). Juster X og Y ved at flytte henholdsvis venstre/højre og op/ned. Juster Z ved at flytte chippen ind og ud af fokus.</li>
	<li>Klik på Angiv fiducialt nul.</li>
	<li>Gentag trin 3.2 for fiducial (øverst til højre, figur 5c) og fiducial to (nederst til venstre, Figur 5d)for at justere alle fiducials med røntgenstrålen.</li>
	<li>Generer en koordineret matrix ved at trykke på make co-ordinate system, dette beregner offset, pitch, roll, og krøje af chippen i forhold til de faser, der gør det muligt for alle efterfølgende bevægelser, der skal gøres i chip koordinere ramme.</li>
	<li>Klik på Bloker kontrol for at flytte XYZ-stadiet til den første brønd i hver byblok for visuel bekræftelse af, at chippen er godt justeret.</li>
	<li>Hvis røntgen sigtekornet flugter med åbningerne chippen er justeret. Hvis ikke, skal du gentage trin 3.2-3.3. NOTER: I tilfælde af problemer med at tilpasse (brudte fiducials) kan forskellige åbninger på chippen bruges til justering ved hjælp af pull-down menuen "justeringstype". Mange forskellige typer chip er tilgængelige for indsamling af fastnetdata. Forskellige chiptyper imødekommes ved brug af 'chip type' pull-down menu. De mest almindelige chiptyper, der bruges på I24, er 'Oxford' og 'custom' chips. Antallet og afstanden mellem åbninger og fiducials på chippen læses fra en chip ordbog defineret via pull-down menuen. Custom chip gør det muligt blænde afstand, der skal defineres on-the-fly, hvilket er særligt nyttigt for tynd-film ark-on-sheet eller andre 'chipless' type chips, hvor krystaller er tilfældigt placeret på tværs af indehaveren37. En ny Python GUI, der tilbyder move-on-click-funktionalitet og automatiseret chipjustering, er i øjeblikket under udvikling, men er endnu ikke klar til rutinemæssig brug på tidspunktet for skrivning af dette manuskript.</li>
</ol>4. Opsætning af dataindsamling
BEMÆRK: Dataindsamlingsopsætningen afhænger af det system, der studeres, og det eksperiment, der skal udføres. Dette kan variere fra den enkleste SSX eksperiment, indsamling af en lav dosis struktur, til en tid-løst eksperiment ved hjælp af lasere eller hurtig blanding til at indlede en reaktion, som vil kræve flere komplette datasæt på forskellige tidspunkter forsinkelser. Hvis du vil oprette en dataindsamling, skal følgende parametre defineres.
<ol><li>Eksperimentelle variabler: Udfyld mappen, filnavnet, eksponeringstiden, transmissionen, detektorafstanden og antallet af skud pr. blænde i efter behov.</li>
	<li>Chiptype: Som beskrevet ovenfor skal du matche chiptypen med den i brugschip.<ol>
<li>Hvis der bruges en tynd film eller 'chipless' chip, skal du indstille chiptypen til Ingen.</li>
		<li>Definer antallet af trin og trinstørrelsen i både x og y i GUI.a.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Angiv korttypen: Dette gør det muligt at udvælge underafsnit af en chip til dataindsamling (Figur 3b). »Ingen« betyder, at der indsamles data fra hver blænde på en chip. »Lite«: Data indsamles fra udvalgte byblokke på chippen (Figur 3b). Dette kan være nyttigt, hvis for eksempel et område af en chip er kendt for at være dårligt indlæst eller tomt. 'Full' gør det muligt at udvælge individuelle åbninger til dataindsamling. I dette tilfælde skal der angives en korrekt formateret tekstfil. Detaljer og en skabelon kan fås hos beamline personale.</li>
	<li>Pumpe-sonde: Vælg typen af pumpe sonde eksperiment og den ønskede tidsforsinkelse. Udløsningen af pumpen (normalt en LED eller laser) er ofte specifik for et bestemt eksperiment, så vil ikke blive beskrevet i detaljer her.<ol>
<li>'Korte' forsinkelser refererer til eksperimenter, når der er en dvæle ved hver blænde mellem pumpen og sonden (dvs. pumpe, sonde, 'flytte til den næste prøve.) Forsinkelser er typisk i størrelsesordenen 1 sekund eller snesevis af millisekunder.</li>
		<li>Long' forsinkelser refererer til en ophidselse og besøg igen (EAVA) strategi, hvor åbninger besøges to gange, med en defineret tidsforsinkelse mellem besøg (dvs. pumpe, flytte, pumpe, flytte, sonde, flytte, sonde, sonde, osv.). Tidsforsinkelsen beregnes og røntgeneksponeringstider (Figur 3c), og det er typisk ~ 1 sekund eller mere.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Fælles dataindsamlingsmetoder
BEMÆRK: Følgende er de nøgleparametre, der definerer den type eksperiment, der udføres. I dette afsnit antages det, at de andre indstillinger fra protokol 3 "Opsætning af dataindsamling" er defineret.
<ol><li>
Scenarie 1: Indsamling af data med lav dosis. Samling af et enkelt diffraktionsbillede fra hver valgt blænde på prøveholderen.<ol>
<li>Indstil antallet af skud pr blænde til 1.</li>
		<li>Indstil pumpe sonde til Ingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scenarie 2: En dosis serie, indsamling n billeder sekventielt fra hver valgt blænde på prøven indehaveren. Chippen er stationær ved hver blændeåbning, mens hvert sæt n-billeder indsamles.<ol>
<li>Angiv antallet af billeder pr. blænde til'n'. Bemærk, at behandlingen er forenklet, hvis n=5, 10, 20 eller et andet multiplum af 10. Det er vanskeligt at fastslå tendenser, hvis n < 5. Det er nyttigt at overveje den samlede tid, der kræves for at dække en chip, og antallet af billedfiler, der produceres, når n øges.</li>
		<li>Indstil pumpe sonde til Ingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scenarie 3: Metoder til pump-sonde<ol>
<li>Vælg en metode i pump probe-udtrækningsmenuen for at åbne Laser Excitation Control Centre. </li>
		<li>For en pumpe sonde eksperiment udfylde Laser Dwell på hver blænde mulighed.</li>
		<li>For EAVA udfylde Laser Dwell ved hver blænde og X-ray eksponering og klik på Beregn.</li>
		<li>Vælg den relevante gentagne indstilling i rullemenuen edm GUI pumpesonden for den ønskede forsinkelsestid.</li>
		<li>Hvis eksperimentet kræver en forbelysning trin udfylde Laser 2 Dwell sektion.</li>
		<li>Når alle eksperimentelle variabler er defineret, skal du trykke på Angiv parametre og oprette en kort liste. Dette indlæser eksperimentelle variabler på geobrick controlleren. Når dette er gjort, flyttes detektoren ind, baggrundslyset ud og starter dataindsamlingen. På alle punkter i opsætningen af dataindsamling er det nyttigt at have et terminalvindue åbent, hvor der udskrives feedback om status og resultatet af hvert af trinene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Databehandling
BEMÆRK: Groft sagt databehandling kan opdeles i tre grupper baseret på det haster, hvormed feedback er påkrævet. Hurtig feedback er nødvendig for at vise, om krystaller er til stede og diffract, og i bekræftende fald i hvilke tal. Dette bør holde trit med dataindsamlingen. Udførelse af dataindeksering og -integration, som kan være langsommere, men som stadig bør udføres på sammenlignelige tidsskalaer med dataindsamling. Sammenlægning og skalering af refleksion intensiteter i en mtz fil til strukturløsning og generering af elektrontæthed kort repræsenterer det sidste skridt og kan være langsommere endnu. Her starter rørledninger på I24 for de første to faser kun vil blive drøftet, da de er nødvendige for real-time feedback til at guide dit eksperiment, men bemærk, at målinger såsom hit-satser og skalering statistik er ikke en erstatning for inspektion elektron tæthed, som kan give den eneste bekræftelse af, at en ligand har bundet, eller en reaktion opstod, i crystallo.
<ol><li>Hurtig feedback<ol>
<li>Hvis du vil indlæse databehandlingsmodulerne, skal du skrive i24-ssx ind i terminalen på en beamline-arbejdsstation.</li>
		<li>Sådan køres analysetypen i24-ssx /path/to/visit/directory/ ind i terminalen: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ BEMÆRK: Dette åbner tre terminalvinduer, og når data er skrevet til disken, en grafisk repræsentation af spotsøgningsresultater fra Diffraction Integration for Advanced Light Sources (DIALS) 40,41(Figur 6a).<ol>
<li>Standardindstillinger scorer hvert 10. billede og opdateres hvert par sekunder for at minimere beregningsbelastningen.</li>
			<li>Rediger standarden ved at føje et argument til slutningen af kommandoen ovenfor. For eksempel ville 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx køre hit finde på hvert andet billede. Dette kan dog lægge unødigt pres på klyngen (en delt ressource!) og bremse behandlingstiderne. Grafen er farvekodet baseret på sandsynligheden for vellykket indeksering, rød viser mindst 15 Bragg pletter er blevet fundet (god chance for indeksering), blå viser lidt at ingen nyttig diffraktion.</li>
			<li>Se diffraktionsbilleder af interesse i DIALS-billedfremviseren ved at klikke på pletterne på spotfindergrænsefladen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Feedback om indeksering og integration BEMÆRK: Indeksering og integration af diffraktionsdata udføres med DIALS ved hjælp af dials.still_process funktion 40,41. Som sådan skal specifikke oplysninger om din krystal (forventet krystalrumsgruppe, enhedscelle og en eksperimentgeometri) placeres i en .phil-tekstfil.<ol>
<li>Indlæs DIALS-moduler ved at skrive modulindlæsningsopkald i en terminal.</li>
		<li>Sådan begynder du at behandle en datasættype dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. Status for alle stillbehandlingsdatasæt kan overvåges ved at køre stills_monitor scriptet ved at skrive monitor_stills_process.py (efter udførelse af modulbelastning i24-ssx og ændring af mappe til det aktuelle besøg) (Figur 6b).</li>
		<li>Enhedscellefordelingen af indekserede diffraktionsdata (Figur 7a) kan overvåges ved hjælp af kommandoen ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/sti/til/ringer/output/*refined.expt combine_all_input=true Dette er især nyttigt at identificere og løse polymorfer i enhedscelle som beskrevet tidligere 42.</li>
		<li>'Visualzie', hvis og hvordan denne fordeling varierer på tværs af et fast mål ved at producere et 2D-plot (Figur 7b) ved hjælp af kommandopytonen pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>Fremstil stereographic-fremskrivninger af alle indekserede diffraktionsdata (Figur 7c) ved hjælp af kommandoen DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt. BEMÆRK: Det er en almindelig patologi ved behandling af stillbilleder data fra krystaller, hvor symmetrien i Bravais gitteret er højere end rumgruppens symmetri, at flettede data fremstår som en perfekt tvilling. Databehandling algoritmer har udviklet sig til at løse denne patologi 43,44,45,46, men brugerne bør være opmærksomme på dette, mens behandlingen af deres data.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Seriel synkrotron dataindsamling er en relativt ny teknik på MX beamlines, der bygger bro mellem de ultrahurtige dataindsamlinger, der i øjeblikket udføres på XFELs og traditionel synkrotronbaseret MX. Dette manuskript har til formål at give et overblik over, hvordan man med succes indsamler fast mål seriedata på beamline I24, Diamond Light Source for lav dosis, dosis serie, og tid-løst eksperimenter. Som med standard krystallografi er prøveforberedelse en stor flaskehals i strukturopløsning. SSX er ikke anderledes, og fremstilling af en homogen krystal gylle i tilstrækkelige mængder har endnu ikke nydt godt af flere årtiers undersøgelse og raffinement som væksten af enkelte store proteinkrystaller har. Forberedelsen af disse gylle ligger imidlertid uden for dette dokuments anvendelsesområde og er blevet sammenfattet andetsteds36. Det kritiske trin i den tilgang, der er beskrevet her, indebærer omhyggelig brug af den tilgængelige prøve ved hjælp af brugervenlige GUI-grænseflader (trin 3) og automatiserede databehandlingspipeliner (trin 6) for at informere chippensning (trin 1), og hvordan et eksperiment skal fortsætte.
Den hurtige feedback pipeline er et kraftfuldt værktøj, der giver brugerne mulighed for at vurdere de første hithastigheder under dataindsamlingen for at informere efterfølgende chipindlæsningsprotokoller til vellykket dataindsamling. Når brugerne står over for en lav hitrate (<5%), risikerer de at indsamle ufuldstændige data og/eller spilde stråletid med yderligere samlinger. I dette tilfælde kan prøven samles, koncentreres ved skånsom centrifugering, og/eller større mængder kan lastes i trin 1.5. En højere hitrate er generelt gunstig, men der er et punkt med faldende afkast, hvor overbelastning fører til flere krystaller i samme brønd. DIALS er i stand til at håndtere multi-gitter diffraktion data50, men en større bekymring end indeksering og integration er den skadelige virkning krystal gruppering kan have på den selv aktivering af krystaller ved laserlys eller hurtig blanding for præcis tid løst eksperimenter. Der bør derfor udvises særlig omhu for at undgå overbelastning af faste mål for tidsfor løste forsøg.
Indekserings- og integrationsbehandlingstrinnet producerer et plot med det centrale kryds, der repræsenterer stråleretningen, hvert punkt, der repræsenterer retningen af hkl 001-refleksionen af individuelle gitter og den ydre ring af cirklen, der repræsenterer en rotation på 90 ° væk fra stråleaksen. Dette viser, om dine krystaller har en foretrukken retning, hvilket kan påvirke data fuldstændigheden og indikere behovet for at indsamle flere data eller variere indlæsningsprotokollen. I venstre panel af figur 7cvises effekten af overbelastning af en chip med HEWL-krystaller. Som åbninger fylde med flere krystaller, de holder sig til vinklet vægge af åbninger i stedet for wedging i bunden i en tilfældig orientering. De to ortogonale ellipser er et resultat af krystaller liggende på de indre vægge af chippen, som er på ~ 35 ° til strålen retning. Dette reducerer mængden af indlæste krystaller, reducerer hithastigheden og reducerer den fraktion af krystaller, der ligger i disse foretrukne planer, dramatisk.
Det skal bemærkes, at andre serielle tilgange er tilgængelige på I24, såsom LCP ekstrudere og mikrofluidiske chips. Disse bruger lignende GUIs og de samme forarbejdningsrørledninger, så meget af ovenstående vil forblive gældende, selvom der anvendes en anden teknik. Der findes en række serielle tilgange for både SSX og SFX ud over den faste målmetode, der er beskrevet her, hver har visse fordele i forhold til den anden afhængigt af det eksperiment, der skal udføres, og den strålelinje, der bruges til eksperimentet. Som serielle tilgange udvikler sig hurtigt er det tilrådeligt at kontrollere beamline websider (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) for de seneste opdateringer og tale med beamline personale på så tidligt som muligt, når du planlægger beamtime. Adgang til I24 for standard- og serieeksperimenter er gratis på brugsstedet. For britiske og EU-brugere dækkes rejse- og opholdsomkostningerne delvist gennem iNEXT Discovery.

Seriel synkrotronkrystallografi (SSX) er en ny metode til dataindsamling, som er inspireret af røntgenfri elektronlasere (XFEL)1,2,3. Ved en XFEL registreres et enkelt diffraktionsmønster fra en normalt meget lille proteinkrystal, før krystallen ødelægges af den ekstremt lyse røntgenimpuls. Det betyder typisk, at en ny krystal skal indføres i røntgenstrålen for at opnå et andet diffraktionsmønster4. Dette behov for løbende at genopbygge krystaller har drevet udviklingen af mange serielle prøve leveringsteknikker5.
Ved synkrotroner anvendes klassiske (ikke-serielle) rotationskrystallografimetoder i vid udstrækning og udnytter en enkelt stor krystal, der roteres i en røntgenstråle ved hjælp af et goniometer til at indsamle et komplet datasæt til strukturopløsning6. For at øge levetiden af krystaller, så et komplet datasæt kan indsamles7,8, og også for at lette forsendelse og automatiseret prøveoverførsel, er krystaller cryocooled til ~ 100 K til dataindsamling. Ved intense mikrofokusstråler anvendes multikrystalstrategier ofte, da strålingsskader kan forbyde indsamling af et komplet datasæt fra en enkelt krystal9,10,11. På trods af de grænser, der er pålagt af strålingsskader, er antallet af anvendte krystaller relativt beskedent, og den anvendte fremgangsmåde er stort set identisk med enkeltkrystaleksperimentet.
SSX, på den anden side, bruger seriel prøve levering for at opnå enkelt stadig diffraktion mønstre fra tusindvis af tilfældigt orienterede krystaller til at generere en komplet datasæt. Det bemærkes, at serielle teknikker, der inkorporerer krystalrotation, er under udvikling12,13 selvom vi fokuserer på stadig nul rotation, tilgange. Der er en bred vifte af prøveleveringssystemer med forskellige fordele og ulemper14, lige fra at levere en strøm af krystaller i en strøm fokuseret / tyktflydende jet15,16,17, mikrofluidisk chip18,19eller krystaller på et fast mål som en ætset siliciumchip20,21 . Typisk holdes krystaller ved stuetemperatur, hvilket gør det muligt at observere større kropslig mangfoldighed og give et mere fysiologisk relevant miljø22. SSX gør det muligt at samle datasæt med meget lav dosis23, da den samlede dosis af datasættet svarer til en enkelt kort røntgeneksponering af en krystal. En anden stor fordel SSX giver, er studiet af protein dynamik gennem tid-løst metoder, med reaktioner udløst af udsættelse for laserlys24,25,26,27eller ved blanding af krystaller og ligand / substrat28,29. Ved hjælp af mindre krystaller betyder laserlys kan trænge ind i hele krystallen, ensartet indlede reaktionen uden multiphoton absorption til at give veldefinerede reaktion mellemprodukter for diffraktion data taget på forskellige tidspunkter27. Brug af større krystaller og rotationsbaserede dataindsamlingsmetoder lider af en begrænset laserindtrængningsdybde, nonuniform eller multiphoton aktivering, strålingsskader og mekanisk overhead tid inden for data sweeps, hvilket resulterer i en blanding af reaktion mellemprodukter, der kan vise sig vanskeligt eller umuligt at fortolke ved hurtigere reaktionshastigheder. Mindre krystaller giver en lignende fordel ved blanding af eksperimenter, da ligands hurtigt og mere ensartet kan diffusere i hele krystallen, hvilket igen gør det muligt at registrere definerede reaktions mellemprodukter på forskellige tidspunkter forsinkelser30,31,32.
På Diamond's microfocus beamline I24 både konventionelle rotation og SSX eksperimenter kan udføres. Her præsenteres en omfattende protokol for SSX-prøveforberedelse og dataindsamling ved hjælp af faste mål på I24 og protokoller til dataanalyse af seriedata hos Diamond. Mens manuskriptet og de ledsagende videoer skal give brugerne mulighed for at udføre et vellykket SSX-eksperiment på I24, skal det bemærkes, at dette er et hurtigt udviklende felt, og tilgange udvikler sig hele tiden. Det skal også bemærkes, at serielle metoder er tilgængelige på andre synkrotronkilder, herunder, men ikke begrænset til, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI og PXII)34og NSLS (FMX)35. Mens detaljerne i seriel dataindsamling og -behandling vil variere fra kilde til kilde, vil de centrale principper forblive de samme. Protokollerne nedenfor skal ses som et udgangspunkt og en vej til base camp snarere end toppen af, hvad der kan opnås.
Denne protokol forudsætter, at brugerne har et protein- eller lille molekylekrystalsystem, hvorfra der er produceret en mikrokrystal gylle i størrelsesordenen 0,5-2,0 mL med en god tæthed af mikrokrystaller pr. ML. Protokoller for indhentning af krystallam er tidligere blevet beskrevet 36. Mange forskellige typer af faste mål er tilgængelige, den mest almindeligt anvendte på I24 udnytte en præcist defineret silicium chip. For at skelne fra andre chip layouts, under og i beamline interface dette kaldes en 'Oxford chip'. Som tidligere beskrevet Oxford chip layout består af 8×8 'byblokke', der hver indeholder 20×20 åbninger for i alt 25.600 åbninger20,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chip Holders</td>
			<td>Custom Built</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chipless Chip Spacers</td>
			<td>SWISCII</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geobrick LV-IMS-II</td>
			<td>Delta Tau</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A&#160;multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mounts</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td>Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNF Laboport Vacuum Pump</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z262285-1EA</td>
			<td>Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 6 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15360562</td>
			<td>300 ft roll of 6 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 3 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-675-4</td>
			<td>300 ft roll of 3 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>91000</td>
			<td>A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Chips</td>
			<td>University of Southampton</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1byOne Humidifier (701UK-0003 )</td>
			<td>1byOne</td>
			<td>B01DENO0EQ</td>
			<td>Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixed target serial data collection at diamond light source

Seriel dataindsamling er en relativt ny teknik til synkrotronbrugere. Diamond Light Source er en brugervejledning til indsamling af fast måldata på I24 og præsenteres for detaljerede trinvise instruktioner, tal og videoer, der gør det nemmere at få dataindsamling.

Indsamling og serie med lav dosis Lavdosis (trin 5.1: Scenario 1) og dosisserier (trin 5.2: Scenario 2) data blev indsamlet på kobbernitrit reduktase mikrokrystaller ved I24 og er tidligere blevet offentliggjort 42. Alle prøver blev forberedt som beskrevet i trin 1, data indsamlet som pr trin 3, 4 og 5, og behandlet ved hjælp af metoder i trin 6. I dette arbejde blev der indsamlet en hurtig dosisserie med 20 diffraktionsbilleder taget ved hver blænde (dvs. n=20 i den ovenfor viste billedgrænseflade for dataindsamling), før du gik over til en ny prøve. Ud fra disse data blev der identificeret en bimodal fordeling af enhedsceller i rumgruppe P213 (a = b = c = 97,25 Å og a = b = c = 96,38 Å). Identifikation og adskillelse af disse enhedscellepomorfer til behandling viste en markant forbedring af datakvalitetsindikatorerne og afslørede to forskellige strukturer i en fleksibel løkke mellem restkoncentrationer 189-193 i stedet for den blandede tilstand, der blev observeret ved behandling af alle data sammen. Identifikation af sådanne polymorfer kan gøre hele forskellen i en delikat tid løst strukturel undersøgelse, hvor kun små strukturelle ændringer forventes. Desuden, dosis serien indsamlet afslørede en dosis afhængig enhed celle ændring i krystallen, med øget dosis flytte befolkningen til fordel for den større enhed-celle.
Lignende arbejde blev udført af Ebrahim et al. (2019)47, hvor en dosisserie (Trin 5.2: Scenario 2) blev indsamlet fra en farvetype hemeperoxidase fra Streptomyces lividans (DAatp) for at sammenligne lavdosisstrukturer fra SSX (trin 5.1: Scenario 1) med dem, der måles i samme faste målsystem ved hjælp af SFX. SFX-data blev indsamlet på SACLA Beamline BL2 EH3 med en pulslængde på 10 femtosekunder og en gentagelseshastighed på 30 Hz. Den 10 femtosecond puls varighed sikrer, at dosis afhængige virkninger ikke er til stede i SFX data. SFX-data blev sammenlignet med SSX-data indsamlet på strålelinje I24, hvor der blev målt 10 sekventielle 10 millisekunder ved hver prøveposition (dvs. n=10). Den dosisafhængige migration af et hemejernkoordineret vandmolekyle væk fra jernet blev observeret, samt en kropsbygningsændring i en af heme propionatgrupperne i SSX-dosisserien. Selv om det ikke var skadesfrit som SFX-strukturen, gjorde dosisserien det muligt at ekstrapolere Fe-O-bindingslængden af et nuldosisdatasæt (ferric heme), og dette blev ved med eksperimentel fejl med den værdi, der var opnået fra SFX.
De serielle metoder til indsamling af krystallografi, der er beskrevet her, kan også let tilpasses til at give nye prøvemiljøer til for eksempel at studere anaerobe proteinstrukturer ved stuetemperatur. Som beskrevet i Rabe et al 2020 48muliggør indlæsning af en "ark-på-ark"-prøve eller "chipless chip" med forskellige forseglingsfilm i et anerobe kammer mulighed for rumtemperaturindsamling af strukturelle data fra dioxygenfølsomme prøver.
Pumpe sonde Selv om følgende repræsentative resultater ikke blev indsamlet på Diamond Beamline I24, er disse metoder blevet udviklet i tæt samarbejde mellem faciliteter i iNEXT-programmet for at arbejde hen imod standardmetoder i seriel krystallografi metodeudvikling. Beamline I24 tilbyder, eller vil snart tilbyde, tilsvarende indsamlingsmetoder til dem, der er beskrevet nedenfor til at udføre sådanne eksperimenter ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i protokollerne ovenfor.
Pumpe probe: Hurtig blanding Rapid mixing SSX er blevet udført ved beamline T-REXX på PETRA III af Mehrabi et al. (2019) 28 ved hjælp af en piezodrevet dråbeinjektor til at indlede reaktioner på faste mål. Dette arbejde præsenterer et principbevis for chipblandingseksperiment, der binder GlcNac3til lysozymmikrristaller, og bindingen forekommer inden for 50 ms af en 75 pL-dråbe, der påføres prøven. Denne undersøgelse blev fulgt op med en 7-struktur tid-løst serie af xylose isomerase aktivitet, der viser glukose bindende inden for 15 ms og dannelsen af en åben ring kropsbygning i glukose molekylet efter en 60 sekunders forsinkelse. En tilsvarende opsætning til dråbe injektion er i øjeblikket under udvikling til brug på I24.
Pumpe-probe: Lys aktivering Et lysaktiveret pumpesonde serieeksperiment præsenteres i Schulz et al. (2018) 49. Fluoroacetat dehydrogenase blev gennemblødt med fotokagede fluoracetat og pumpet med 320-360 nm laserlys til at producere strukturer på 4 tidspunkter (t = 0, 30, 752 og 2.052 ms). Hviletilstandsstrukturen (0 ms) viser et tomt aktivt sted, med undtagelse af nogle få vandmolekyler, og tilsvarende tæthed mellem hættedomænerne for begge proteinunderenheder. 30 ms og 752 ms efter lys aktivering en betydelig reduktion i elektrontæthed kan observeres i cap domæne underenhed B i forhold til underenhed A. Reduktionen i elektrontætheden i underenheden B's hættedomæne falder sammen med forekomsten af fluoroacetat på det aktive underenhed A-område ved 752 ms. Det endelige datasæt på 2.052 ms viser yderligere strukturel omlægning af ligand, mistænkt for at lette den korrekte geometri for SN2 angreb, og potentiel dannelse af en mellemtilstand i reaktionen. På I24 kan et bærbart Pharos lasersystem, der kan tunables fra 210-2500 nm, der giver femtosecondimpulser, bruges til lysaktivering. Indledende forsøg viste en vellykket aktivering af en fotocage ved hjælp af 308 nm excitation med binding af den frigivne ligand til målet protein observeret. I skrivende stund er integrationen i beamline personale sikkerhedssystem i gang, og rutinemæssige brugerforsøg forventes i begyndelsen af 2021. Til eksperimenter, hvor der kræves mindre intense lysimpulser, er lysaktivering med TTL-kontrollerede LYSDIODER blevet udført med succes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Figur 1: Prøveindlæsningsudstyr på plads ved Diamond Light Source. Opsætningen består af en vakuumpumpe (a), handskekasse (b) og luftfugter (c). Inden for handske-box vakuumtryk bruges til at handle på en chip fyldt med krystal gylle holdt i en prøve blok (d) fastgjort til en Büchner kolbe (e, grøn pil), via en trykregulator (f, gul pil) fastgjort til en stophane (g, blå pil). Fugtig luft pumpes ind i teltet via plastikrør fastgjort til luftfugteren (h), og måles ved hjælp af et hygrometer (i). Komponenter holdes på plads ved hjælp af klemmestativer (j). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Figur 2: Prøveholdere. De anvender en metal O-ring (a) til at klemme polyesterfilm på en top (b) og bund(c)halvdel, med den nederste halvdel af magnetiske mounts(d), der bruges til at fastgøre prøveholderen til prøvefaserne. Polyesterfilmen (6 μm (e) eller 3 μm (f)) samt gummi O-ringe (hvide pile) forhindrer en krystalindlæst chip i at tørre hurtigt i en prøveholder, der er lukket tæt med hexbolte (g). Chips rengøres ved hjælp af sekventielle 15-minutters bade i dH2O, 1 M HCl og dH2O (h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Figur 3: Brugergrænseflade til dataindsamling for indsamling af fastnetdata på I24. (a) Viser den hovedgrænseflade, der bruges til at justere chips og definere dataindsamlingsparametre,( b) er den kortlægning lite-grænseflade, der bruges til at definere underområder af en chip til dataindsamling, og (c) er en grænseflade til definition af parametre for laserbelysning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Figur 4: Processen med at montere en chipholder på de stadier, der er beskrevet i trin 3, punkt 1. Klik her for at se en større version af dette <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Figur 5: Chipjustering. En chip justeres ved at klikke på tre fiducial markører på chippen vist i (a). Visninger af fiducials 0, 1 og 2 gennem beamline on-axis visningssystem er vist i (b),(c) og( d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Figur 6: Viser automatisk behandling af resultater, der er lanceret som beskrevet i trin 6.1. Der vises et opdaterings-hit-rate-plot (etindsat . Hvis der klikkes på et 'hit' på det tilsvarende diffraktionsbillede, vises der i opkaldsbilledfremviser. Hit-raten for den aktuelle dataindsamling vises (29,6 % i dette eksempel). Panel (b) viser et eksempel på et vindue, der viser aktuelle indekserings- og integrationsrater for data, der er indsamlet indtil videre under besøget, og som opdateres i realtid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Figur 7: Mere tilbundsgående dataanalyse. Visualisering af enhedscelleparametre kan afsløre polymorf (a). Der beregnes gennemsnitlige enhedscelleparametre. Dette omfatter dog endnu ikke individuelle gennemsnit for polymorfetter. Visualisering af en lille delmængde af data (viste data er en delmængde af 793 kobbernitrit reduktase krystaller fra de data, der er beskrevet i Ebrahim et al 2019) er ofte tilstrækkelig til at afsløre tendenser. 2D-plots af nyttige parametre kan også produceres for at afsløre variationer, der opstår på grund af belastnings- eller dehydreringseffekter, der kan løses til kommende dataindsamlinger (b). Stereographic fremskrivninger kan afsløre tilstedeværelsen, eller fravær, foretrukne orienteringer fodring tilbage i lastning protokol (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Vi præsenterer en omfattende guide til fast mål prøve forberedelse, dataindsamling og databehandling til seriel synkrotron krystallografi på Diamond beamline I24.

Fast target seriel dataindsamling på Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Seriel synkrotronkrystallografi, eller SSX, er et relativt nyt og hurtigt udviklende område af MX.Det er meget velegnet til lavdosis og stuetemperatur eksperimenter, men måske vigtigst af alt, det er virkelig velegnet til at følge dynamikken. Dette gør det muligt at lave stop-motion-film af proteiner i aktion. På I24 er flere tilstande af SSX tilgængelige.Denne protokol fokuserer på SSX med fast mål, som muliggør en lang række serielle eksperimenter ved hjælp af begrænsede mængder prøve. Siliciumchips kan blive beskadiget ved lastning og rengøring af dem, hvis du ikke er bekendt med dem. Chipjusteringsprotokollen er også helt ny for mange krystallographers, og databehandlingen er lidt anderledes end dine standardrotationsdata.For at forberede en chipholder skal du skære to ark polyesterfolie i ca. 6 gange 6 centimeter firkanter og placere arkene over de to bundplader. Brug metalforseglingsringe, fastgør arkene på plads, og træk derefter forsigtigt på den overskydende folie for at fjerne eventuelle folder. Vælg derefter en siliciumchip med åbninger i passende størrelse i forhold til størrelsen af de krystaller, der skal analyseres.Glow udledning chippen i 25 sekunder på 0,39 millibar, med en 15 milliampere strøm. Brug pincet til at placere silicium chip på chippen lastning fase, med de hævede stænger nedad. Derefter, ved hjælp af en pipette, anvende 200 mikroliter af mikrokrystal gylle til den flade side af chippen, sprede gylle til at dække alle byens blokke af chippen.Hvis chippen er beskadiget, skal du dække eventuelle huller med et lille stykke polyesterfolie for at sikre, at der kan påføres et jævnt vakuum. Derefter påføres et blidt vakuum for at aspirere al den overskydende væske gennem chippen. Fjern chippen fra spånbelastningsfasen, og blotd forsigtigt undersiden af chippen med filterpapir for at fjerne overskydende væske.Placer den lastede chip på den større halvdel af chipholderen mellem styremærkerne, flad side ned. Placer den lille halvdel af chipholderen på chippen for at forsegle den. De to halvdele af chipholderen skal klikke på plads.Derefter, ved hjælp af hex bolte, fastgør chippen sikkert på plads. Hvis du vil justere chippen, skal du holde chipholderen i en 30-graders vinkel, mens du nærmer dig holderen. Brug derefter kinematiske mounts til at placere den indlæste chip på XYZ scenen på strålelinjen.Når magneterne kommer i kontakt, skal du lade chipholderen rotere parallelt med flowet og klikke på plads. Når chippen er placeret, skal du bruge beamline on-axis visningssystem og chip-justering grafisk brugergrænseflade til at finde den øverste venstre fiducial af chippen. Hvis du vil centrere sig om fiducial 0 i X, Y og Z, skal du flytte ind og ud af fokus for at justere Z, op og ned for at justere Y og venstre og højre for at justere X.Klik derefter på Angiv fiducial 0"Efter justering af fiducial 1 og 2 med røntgenstrålen på samme måde skal du klikke på Opret koordinatsystem"for at generere en koordineret matrix.Klik derefter på Bloker kontrol"for at flytte XYZ-stadiet til den første brønd i hver byblok. Hvis røntgen sigtekornet flugter med åbningerne, justeres chippen. I denne grafiske repræsentation af spot finding resultater fra DIALS en opdatering hit-rate plot kan observeres.Hvis der klikkes på et hit, vises det tilsvarende diffraktionsbillede i DIALS-billedfremviseren. I denne tabel kan aktuelle indekserings- og integrationsrater, der opdateres i realtid, når dataene indsamles under besøget, visualiseres. Visualisering af enhedscelleparametrene kan afsløre polymorfetter.Todimensionelle plots af nyttige parametre kan også produceres for at afsløre variationer, der opstår på grund af belastnings- eller dehydreringseffekter. Stereographic fremskrivninger kan afsløre tilstedeværelsen eller fraværet af foretrukne orienteringer, der kan føres tilbage i lasteprotokollen. For eksempel kan virkningerne af overbelastning af en chip med lysozymkrystaller observeres i denne projektion.Når du indlæser chippen, pipette langsomt og bruge fingeren til at hvile pipetten over chippen. Dette forhindrer dig i at røre ved chippen og ved et uheld stikke huller i silicium. Når du behandler data, skal du gøre brug af de automatiserede rørledninger, der er tilgængelige.Dette vil give dig en god idé om, hvordan dit eksperiment skrider frem, og hvis du har brug for at variere noget. Denne metode kan anvendes på ethvert proteinsystem, der kan krystalliseres i betydelige mængder. Og reaktionen kan udløses af lette røntgenstråler eller hurtig blanding.Dynamiske undersøgelser af en række strukturer kan give indsigt i, hvordan proteiner fungerer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Fuldt autonome karakterisering og indsamling af Data fra krystaller af biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse af SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution og Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimering af væksten af endothiapepsinkrystaller til serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturel bestemmelse af et enzym:Substratkompleks ved seriel krystallografi i en alsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Prøveforberedelse og overførselsprotokol til in-vakuum langbølgelængdekrystallografi på Beamline I23 ved diamantlyskilde

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...