Name: fixed target serial data collection at diamond light source
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery (מענק 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.

איסוף נתוני סינכרוטרון סדרתי הוא טכניקה חדשה יחסית בקווי קרן MX, המגשרת על הפער בין אוספי הנתונים המהירים במיוחד המבוצעים כעת ב- XFELs לבין MX מבוסס סינכרוטרון מסורתי. כתב יד זה נועד לתת סקירה כללית של כיצד לאסוף בהצלחה נתונים סידוריים יעד קבוע ב beamline I24, מקור אור יהלום עבור מינון נמוך, סדרת מינון, וניסויים זמן נפתר. כמו בקריסטלוגרפיה סטנדרטית, הכנת מדגם היא צוואר בקבוק מרכזי בתמיסת המבנה. SSX אינו שונה, והכנת תיעוב גביש הומוגני בכמויות מספיקות עדיין לא נהנתה מכמה עשורים של מחקר ועידון כמו הצמיחה של גבישי חלבון גדולים יחידים. עם זאת, הכנת השמצה זו היא מחוץ לתחום של נייר זה סוכם במקום אחר36. השלב הקריטי בגישה המתוארת כאן כרוך בשימוש זהיר במדגם הזמין באמצעות ממשקי GUI קלים לשימוש (שלב 3) וצינורות עיבוד נתונים אוטומטיים (שלב 6) כדי ליידע את טעינת השבב (שלב 1) וכיצד ניסוי צריך להמשיך.
צינור המשוב המהיר הוא כלי רב עוצמה המאפשר למשתמשים להעריך את קצבי הלהיטים הראשוניים במהלך איסוף נתונים כדי ליידע את פרוטוקולי טעינת השבבים הבאים לאיסוף נתונים מוצלח. כאשר הם מתמודדים עם שיעור פגיעה נמוך (<5%), משתמשים מסתכנים באיסוף נתונים לא שלמים ו/או בבזבוז זמן קרן עם אוספים נוספים. במקרה זה, ניתן לאגד את הדגימה, מרוכזת על ידי צנטריפוגה עדינה, ו/או ניתן לטעון נפחים גדולים יותר בשלב 1.5. שיעור פגיעה גבוה יותר הוא בדרך כלל חיובי, עם זאת, יש נקודה של תשואה פוחתת שבה עומס יתר מוביל גבישים מרובים באותה באר. DIALS מסוגל להתמודד עם נתוני עקיפה מרוביסריגים 50, אבל דאגה גדולה יותר מאשר אינדקס ואינטגרציה היא ההשפעה המזיקה קיבוץ גביש יכול להיות על ההפעלה הזוגית של גבישים על ידי אור לייזר או ערבוב מהיר לניסויים מדויקים נפתר זמן. לכן יש לנקוט בזהירות מסוימת כדי למנוע עומס יתר על מטרות קבועות לניסויים שנפתרו בזמן.
שלב עיבוד האינדקס והאינטגרציה מייצר התוויה כאשר הצלב המרכזי מייצג את כיוון הקרן, כל נקודה המייצגת את כיוון השתקפות hkl 001 של סדקים בודדים, ואת הטבעת החיצונית של המעגל המייצג סיבוב של 90° הרחק מציר הקרן. פעולה זו תציג אם לגבישים שלך יש כיוון מועדף, שעשוי להשפיע על שלמות הנתונים ולציין את הצורך באיסוף נתונים נוספים או לשנות את פרוטוקול הטעינה. בחלונית השמאלית של איור 7cמוצגת ההשפעה של עומס יתר על שבב עם גבישי HEWL. כאשר הצמצמים מתמלאים בגבישים נוספים, הם נצמדים לקירות הזוויתיים של הצמצמים במקום להיתקע בבסיס באוריינטציה אקראית. שתי אליפסות אורתוגונל הן תוצאה של גבישים השוכבים על הקירות הפנימיים של השבב אשר נמצאים ~ 35 ° לכיוון הקורה. פעולה זו מפחיתה את נפח הגבישים הטעונים, מפחיתה את קצב הפגיעה ומפחיתה באופן דרמטי את שבר הגבישים השוכבים במישורים המועדפים הללו.
יש לציין כי גישות סדרתיות אחרות זמינות ב- I24, כגון מחבטי LCP ושבבים מיקרופלואידיים. אלה משתמשים ב- GUIs דומים ובאותם צינורות עיבוד כל כך הרבה מהנ"ל יישארו ישימים גם אם נעשה שימוש בטכניקה אחרת. קיימות מספר גישות טוריות הן עבור SSX והן עבור SFX מעבר לגישת היעד הקבועה המתוארת כאן, לכל אחת מהן יתרונות מסוימים על פני השני בהתאם לניסוי שיש לבצע וקו הקרן המשמש לניסוי. ככל שגישות סדרתיות מתפתחות במהירות, מומלץ לבדוק את דפי האינטרנט של קו הקורה (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) לקבלת עדכונים אחרונים ולדבר עם צוות Beamline בשלב מוקדם ככל האפשר בעת תכנון זמן קרן. הגישה ל- I24 לניסויים סטנדרטיים וסדרתיים היא ללא תשלום בנקודת השימוש. עבור משתמשי בריטניה והאיחוד האירופי עלויות הנסיעה והלינה מכוסות בחלקן באמצעות iNEXT דיסקברי.

קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתי (SSX) היא שיטה מתפתחת לאיסוף נתונים אשר בהשראת לייזרים אלקטרונים ללא קרנירנטגן(XFEL) 1,2,3. ב XFEL, דפוס עקיפה יחיד נרשם מגביש חלבון קטן מאוד בדרך כלל, לפני הגביש נהרס על ידי פעימת רנטגן בהירה מאוד. משמעות הדבר היא, בדרך כלל, כי גביש חדש חייב להיות הציג לתוך קרן הרנטגן כדי להשיג דפוס עקיפה אחר4. צורך זה לחדש את הגבישים ללא הרף הניע את הפיתוח של טכניקות משלוח מדגם סדרתיות רבות5.
בסינכרוטרונים, שיטות קריסטלוגרפיה סיבוב קלאסיות (לא סדרתיות) מיושמות באופן נרחב, תוך ניצול גביש גדול יחיד המסתובב בקרן רנטגן באמצעות גוניומטר כדי לאסוף ערכת נתונים מלאה לפתרון מבנה6. על מנת להגדיל את משך החיים של גבישים, כך ערכת נתונים מלאה ניתן לאסוף7,8, וגם כדי להקל על משלוח והעברת מדגם אוטומטי, גבישים הם cryocooled ~ 100 K לאיסוף נתונים. ב- beamlines מיקרופוקוס אינטנסיבי, אסטרטגיות מרובות קריסטלים משמשות לעתים קרובות כמו נזק קרינה יכול לאסור על איסוף של ערכת נתונים מלאה מקריסטל אחד9,10,11. למרות המגבלות שהוטלו על ידי נזקי קרינה, מספר הגבישים המשמשים נותר צנוע יחסית והגישה המשמשת זהה במהותה לניסוי הקריסטל היחיד.
SSX, לעומת זאת, משתמשת במשלוח מדגם סדרתי כדי להשיג דפוסי עקיפה בודדים מאלפי גבישים מכוונים באופן אקראי כדי ליצור ערכת נתונים מלאה. יצוין כי טכניקות סדרתיות המשלבות סיבוב גביש נמצאות בפיתוח12,13 למרות שאנו מתמקדים עדיין, אפס סיבוב, גישות. ישנם מגוון רחב של מערכות משלוח מדגם עם יתרונות וחסרונות שונים14, החל אספקת זרם של גבישים בזרימה ממוקדת / צמיג סילון15,16,17, שבב microfluidic18,19, או גבישים על מטרה קבועה כגון שבב סיליקון חרוט20,21 . בדרך כלל, גבישים מוחזקים בטמפרטורת החדר, המאפשר מגוון קונפורמציה גדול יותר להיות נצפה ומספק סביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית22. SSX מאפשר איסוף של ערכות נתונים במינון נמוך מאוד23, כמו המינון הכולל של ערכת הנתונים שווה לחשיפה אחת קצרה רנטגן של גביש אחד. יתרון מרכזי נוסף ש-SSX מספק הוא חקר דינמיקת החלבון באמצעות שיטות שנפתרו בזמן, עם תגובות המופעלות על ידי חשיפה לאור לייזר24,25,26,27או על ידי ערבוב של גבישים וליגנד /מצע 28,29. באמצעות גבישים קטנים יותר פירושו אור לייזר יכול לחדור את מכלול הגביש, באופן אחיד ייזום התגובה ללא ספיגת מולטיפוטונים כדי לספק מתווכים תגובה מוגדרים היטב עבור נתוני עקיפה נלקחו בנקודות זמן שונות27. השימוש בגבישים גדולים יותר ובשיטות איסוף נתונים מבוססות סיבוב סובל מעומק חדירת לייזר מוגבל, הפעלה לא-יונית או מולטיפוטנית, נזק לקרינה וזמן תקורה מכני בתוך סריקות נתונים, וכתוצאה מכך שילוב של מתווכים תגובה שיכולים להתברר כקשים או בלתי אפשריים לפענוח במהירויות תגובה מהירות יותר. גבישים קטנים יותר מספקים יתרון דומה בערבוב ניסויים, שכן ליגנדים יכולים לפזר במהירות ובאופן אחיד יותר בכל הגביש, ושוב מאפשרים לתעד מתווכים מוגדרים בעיכובים בזמן שונה30,31,32.
בקו הקרן של המיקרופוקוס I24 של דיאמונד ניתן לבצע הן סיבוב קונבנציונלי והן ניסויי SSX. כאן מוצג פרוטוקול מקיף להכנת מדגם SSX ואיסוף נתונים באמצעות יעדים קבועים ב- I24 ופרוטוקולים לניתוח נתונים של נתונים סידוריים ב- Diamond. בעוד שכתב היד והסרטונים הנלווים אמורים לאפשר למשתמשים לבצע ניסוי SSX מוצלח ב- I24, יש לציין כי זהו תחום המתפתח במהירות וגישות מתפתחות ללא הרף. כמו כן, יש לציין כי שיטות טוריות זמינות במקורות סינכרוטרון אחרים, כולל אך לא מוגבל לפטרה השלישי (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI ו- PXII)34ו- NSLS (FMX)35. בעוד שהפרטים של איסוף ועיבוד נתונים טוריים יהיו שונים בין מקורות, עקרונות הליבה יישארו זהים. הפרוטוקולים שלהלן צריכים להיראות כמייצגים נקודת התחלה ומסלול למחנה הבסיס ולא את פסגת מה שניתן להשיג.
פרוטוקול זה מניח שלמשתמשים יש חלבון או מערכת גביש מולקולה קטנה, שממנה נוצרה רפש מיקרוקריסטלי בסדר גודל של 0.5-2.0 מ"ל עם צפיפות טובה של מיקרוקריסטלים לכל מ"ל. פרוטוקולים להשגת השמצה קריסטל תוארו בעבר 36. סוגים רבים ושונים של יעד קבוע זמינים, הנפוץ ביותר ב- I24 משתמש בשבב סיליקון מוגדר במדויק. על מנת להבדיל מפריסות שבב אחרות, מתחת ובממשק קו הקרן זה נקרא 'שבב אוקספורד'. כפי שתואר בעבר פריסת שבב אוקספורד כוללת 8×8 'בלוקים עירוניים', כל אחד מכיל 20×20 פתחים עבור סך של 25,600פתחים 20,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chip Holders</td>
			<td>Custom Built</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chipless Chip Spacers</td>
			<td>SWISCII</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geobrick LV-IMS-II</td>
			<td>Delta Tau</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A&#160;multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mounts</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td>Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNF Laboport Vacuum Pump</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z262285-1EA</td>
			<td>Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 6 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15360562</td>
			<td>300 ft roll of 6 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 3 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-675-4</td>
			<td>300 ft roll of 3 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>91000</td>
			<td>A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Chips</td>
			<td>University of Southampton</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1byOne Humidifier (701UK-0003 )</td>
			<td>1byOne</td>
			<td>B01DENO0EQ</td>
			<td>Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixed target serial data collection at diamond light source

איסוף נתונים טוריים הוא טכניקה חדשה יחסית עבור משתמשי סינכרוטרון. מדריך למשתמש לאיסוף נתוני יעד קבוע ב- I24, מקור אור יהלום מוצג עם הוראות מפורטות שלב אחר שלב, איורים וסרטוני וידאו לאיסוף נתונים חלק.

איסוף נתונים וסדרות במינון נמוך במינון נמוך (שלב 5.1: תרחיש 1) וסדרות מינון (שלב 5.2: תרחיש 2) נתונים נאספו על גבישי מיקרו ניטריט נחושת ב- I24 ופורסמו בעבר 42. כל הדגימות הוכנו כמתואר בשלב 1, נתונים שנאספו לפי שלבים 3, 4 ו- 5, ועובדו בשיטות בשלב 6. בעבודה זו נאספה סדרת מינון מהירה עם 20 תמונות עקיפה שצולמו בכל צמצם (כלומר, n=20 באוסף הנתונים המוצג לעיל) לפני המעבר לדגימה טרייה. מנתונים אלה זוהתה התפלגות דו-מודולית של תאי יחידה בקבוצת החלל P213 (a = b = c = 97.25 Å, ו- a = b = c = 96.38 Å). זיהוי והפרדה של פולימורפים אלה של תאי יחידה לעיבוד הראו שיפור ניכר באינדיקטורים לאיכות הנתונים וחשפו שני מבנים שונים בלולאה גמישה בין שאריות 189-193 במקום המצב המעורב שנצפו בעת עיבוד כל הנתונים יחד. זיהוי של פולימורפים כאלה יכול לעשות את כל ההבדל במחקר מבני עדין שנפתר בזמן שבו רק שינויים מבניים קטנים צפויים. יתר על כן, סדרת המינון שנאספו חשפה שינוי תא יחידה תלוי מינון בגביש, עם מינון מוגבר הסטת האוכלוסייה לטובת תא יחידה גדול יותר.
עבודה דומה בוצעה על ידי אברהים ואח ' (2019)47, שבו סדרת מינון (שלב 5.2: תרחיש 2) נאספה מתוך heme peroxidase מסוג צבע מ- Streptomyces lividans (DtpAa) כדי להשוות מבנים במינון נמוך מ- SSX (שלב 5.1: תרחיש 1) עם אלה שנמדדו באותה מערכת יעד קבועה באמצעות SFX. נתוני SFX נאספו ב- SACLA Beamline BL2 EH3 עם אורך דופק של 10 פמטו-שניות וקצב חזרה של 30 הרץ. משך הדופק של 10 femtosecond מבטיח כי אפקטים תלויי מינון אינם קיימים בנתוני SFX. נתוני SFX הושוו לנתוני SSX שנאספו בקו הקרן I24, שם נמדדו 10 חשיפות רציפות של 10 אלפיות השנייה בכל מיקום מדגם (כלומר, n=10). נצפתה נדידה תלוית מינון של מולקולת מים מתואמת מברזל, כמו גם שינוי קונפורמציה באחת מקבוצות ההמיונט בסדרת המינון של SSX. למרות שלא נגרם נזק כמו מבנה SFX, סדרת המינון אפשרה את אורך הקשר Fe-O של ערכת נתונים במינון אפס (חמה ferric) להיות אקסטרפולוס, עם זה מסכים בתוך שגיאה ניסיונית עם הערך שהתקבל מ- SFX.
שיטות איסוף נתוני הקריסטלוגרפיה הסדרתיות המתוארות כאן יכולות גם להיות מותאמות בקלות כדי לספק סביבות מדגם חדשות, למשל, לחקור מבני חלבון אנאירובי בטמפרטורת החדר. כפי שמתואר ב- Rabe et al 2020 48, טעינת מדגם 'גיליון על גיליון', או 'שבב ללא שבב', עם סרטי איטום שונים בתא אירובי מאפשר איסוף טמפרטורת החדר של נתונים מבניים מדגימות רגישות לדיאוקסיגן.
משאבת בדיקה למרות שהתוצאות הייצוגיות הבאות לא נאספו ב- Diamond Beamline I24, שיטות אלה פותחו בשיתוף פעולה הדוק בין מתקנים בתוכנית iNEXT כדי לפעול לשיטות סטנדרטיות בפיתוח שיטת קריסטלוגרפיה סדרתית. Beamline I24 מציע, או יציע בקרוב, שיטות איסוף שוות ערך לאלה המתוארות להלן כדי לבצע ניסויים כאלה באמצעות השיטות המתוארות בפרוטוקולים לעיל.
משאבה בדיקה: ערבוב מהיר ערבוב מהיר SSX בוצע ב- T-REXX בקרן ב- PETRA III על ידי Mehrabi et al (2019) 28 באמצעות מזרק טיפה מונחה פיזו כדי ליזום תגובות על מטרות קבועות. עבודה זו מציגה הוכחה של עיקרון על ניסוי ערבוב שבב מחייב GlcNac3כדי lysozyme microcrystals, עם כריכה המתרחשת בתוך 50 אלפיות שני של טיפה 75 pL מוחל על המדגם. מחקר זה היה במעקב עם סדרה 7-מבנה נפתר זמן של פעילות איזומראז קסילוז, הדגמת כריכת גלוקוז בתוך 15 ms ואת היווצרות של קונפורמציה טבעת פתוחה במולקולת הגלוקוז לאחר עיכוב של 60 שניות. התקנה שווה ערך עבור הזרקת טיפה נמצאת כעת בפיתוח לשימוש על I24.
משאבה-בדיקה: הפעלת אור ניסוי סדרתי משאבה-בדיקה מופעל אור מוצג שולץ ואח '(2018) 49. פלואורואצטט דהידרוגנאז היה ספוג בפלואורואצטט עם פוטוקאאוט ושאב עם אור לייזר 320-360 ננומטר כדי לייצר מבנים ב -4 נקודות זמן (t = 0, 30, 752 ו - 2,052 ms). מבנה מצב המנוחה (0 אלפיות שני) מציג אתר פעיל ריק, למעט כמה מולקולות מים, וצפיפות שווה ערך בין תחומי המכסה של שני תתי-קבוצות החלבון. 30 אלפיות השנייה ו-752 אלפיות השנייה לאחר הפעלת האור ניתן לראות ירידה משמעותית בצפיפות האלקטרונים בתחום המכסה של subunit B ביחס ל- subunit A. הירידה בצפיפות האלקטרונים בתחום הכובע של subunit B עולה בקנה אחד עם המראה של פלואורואצטט באתר הפעיל של subunit A ב 752 ms. ערכת הנתונים הסופית ב 2,052 ms מראה סידור מבני נוסף של ligand, חשוד כדי להקל על הגיאומטריה הנכונה עבור התקפת SN2, ויצירת פוטנציאל של מצב ביניים בתגובה. על I24, מערכת לייזר Pharos נייד אשר טונה מ 210-2500 ננומטר מתן פולסים femtosecond יכול לשמש להפעלת אור. ניסויים ראשוניים הראו הפעלה מוצלחת של צילומי צילום באמצעות עירור של 308 ננומטר עם כריכה של הליבנד המשוחרר לחלבון היעד שנצפה. בעת כתיבת שורות אלה ההשתלבות במערכת הבטיחות של כוח האדם בקו הקורה נמשכת וצפויים ניסויי משתמש שגרתיים בתחילת 2021. לניסויים כאשר נדרשים פולסים פחות אינטנסיביים של אור, הפעלת אור עם נורות LED הנשלטות על ידי TTL בוצעה בהצלחה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> איור 1: ציוד טעינה לדוגמה במקום במקור אור היהלום. התפאורה מורכבת ממשאבת ואקום (א),תא כפפות (b)ו- humidifier (c). בתוך תיבת הכפפות לחץ ואקום משמש לפעול על שבב טעון עם תרחיף קריסטל מוחזק בלוק מדגם (ד)מחובר בקבוקון Büchner(e,חץ ירוק), באמצעות וסת לחץ(f,חץ צהוב) מחובר stopcock (g,חץ כחול). אוויר לח נשאב לאוהל באמצעות צינורות פלסטיק המחוברים לספינת הלחות(h),ונמדד באמצעות הייגרומטר (i). הרכיבים מוחזקים במקום באמצעות דוכנימלחציים( j ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> איור 2: מחזיקי מדגם. הם משתמשים בטבעת O ממתכת (א)כדי להדק סרט פוליאסטר על חלק עליון (b) ותחתון (c) חצי, עם החצי התחתון ספורטיבי הרכבות מגנטיות (ד) המשמשים להצמדת מחזיק המדגם לשלבי המדגם. סרט הפוליאסטר (6 מיקרומטר (e) או 3 מיקרומטר(f))כמו גם גומי O-טבעות (חצים לבנים) למנוע שבב טעון קריסטל להתייבש במהירות במחזיק מדגם אשר סגור הדוק עם ברגים משושה (גרם). צ'יפס מנוקים באמצעות אמבטיות רציפים של 15 דקות ב- dH2O, 1 M HCl, ו- dH2O(h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> איור 3: ממשק משתמש גרפי לאיסוף נתונים עבור איסוף נתוני יעד קבוע ב- I24. (א)מציג את הממשק העיקרי המשמש ליישור שבבים ולהגדרת פרמטרי איסוף נתונים(b) הוא ממשק המיפוי lite המשמש להגדרת אזורי משנה של שבב לאיסוף נתונים ו -( c) הוא ממשק להגדרת פרמטרים להארת לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> איור 4: תהליך הרכבת מחזיק שבב על הבמות כמתואר בשלב 3, נקודה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> איור 5: יישור שבבים. שבב מיושר על ידי לחיצה על שלושה סמנים פיודואליים על השבב המוצג ב(a). תצוגות של fiducials 0, 1 ו- 2 דרך מערכת הצפייה בקו הקרן על ציר מוצגים ב -( b), (c) ו -( ד). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> איור 6: תוצאות עיבוד אוטומטי מוצגות כמתואר בשלב 6.1. התוויית קצב פגיעה מתעדכנתמוצגת( , inset). אם לוחצים על 'hit' בתמונת ההסתעפות המתאימה מוצגת במציג התמונות של המחוגים. שיעור הפגיעה באוסף הנתונים הנוכחי מוצג (29.6% בדוגמה זו). החלונית (ב)מציגה דוגמה לחלון המציג את שיעורי יצירת האינדקס והאינטגרציה הנוכחיים עבור נתונים שנאספו עד כה במהלך הביקור המתעדכנים בזמן אמת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> איור 7: ניתוח נתונים מעמיק יותר. הדמיה של פרמטרי תא יחידה יכולה לחשוף פולימורפים (א). פרמטרי תא יחידה ממוצעים מחושבים; עם זאת, זה עדיין לא חל על ממוצעים בודדים עבור פולימורפים. הדמיה של תת-קבוצה קטנה של נתונים (הנתונים המוצגים הם תת-קבוצה של 793 גבישי ניטריט נחושת מנתונים המתוארים ב- Ebrahim et al 2019) מספיקה לעתים קרובות כדי לחשוף מגמות. ניתן לייצר גם חלקות דו-ממדיות של פרמטרים שימושיים כדי לחשוף וריאציות המתעוררות עקב השפעות טעינה או התייבשות שניתן לטפל בהן עבור אוספי נתונים קרובים (b). תחזיות סטריוגרפיות יכולות לחשוף את הנוכחות, או היעדר, כיוונים מועדפים הניזונים בחזרה לפרוטוקול הטעינה (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

אנו מציגים מדריך מקיף להכנת מדגם יעד קבוע, איסוף נתונים ועיבוד נתונים עבור קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתית בקו קרן יהלום I24.

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

קריסטלוגרפיה סדרתית של סינכרוטרון, או SSX, היא אזור חדש יחסית ומתפתח במהירות של MX.It מתאים מאוד לניסויים במינון נמוך וטמפרטורת החדר, אבל אולי הכי חשוב, הוא ממש מתאים לדינמיקה הבאה. זה מאפשר סרטי סטופ-מושן של חלבונים בפעולה להיעשות. ב- I24, מצבים מרובים של SSX זמינים.פרוטוקול זה מתמקד ב- SSX מטרה קבועה, המאפשר מגוון רחב של ניסויים טוריים באמצעות כמויות מוגבלות של מדגם. שבבי הסיליקון עלולים להיפגע בעת טעינה וניקוי שלהם, אם אינך מכיר אותם. כמו כן, פרוטוקול יישור השבב חדש לחלוטין לקריסטלוגרפים רבים, ועיבוד הנתונים שונה במקצת מנתוני הסיבוב הסטנדרטיים שלך.כדי להכין מחזיק שבב, לחתוך שני גיליונות של רדיד פוליאסטר לתוך כ 6 על 6 ס"מ ריבועים, ומניחים את הסדינים על שתי לוחות הבסיס. באמצעות טבעות איטום מתכת, לתקן את הסדינים במקום, ולאחר מכן בזהירות למשוך על רדיד עודף כדי להסיר את כל הקמטים. לאחר מכן, בחר שבב סיליקון עם פתחים בגודל המתאים ביחס לגודל הגבישים שיש לנתח.זוהר לפרוק את השבב במשך 25 שניות ב 0.39 מיליבר, עם זרם 15 מיליאמפר. השתמש פינצטה למקם את שבב הסיליקון על שלב טעינת השבב, עם הסורגים מוגבהים מול למטה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה, להחיל 200 microliters של תרחיף microcrystal לצד השטוח של השבב, הפצת תרחיף כדי לכסות את כל בלוקי העיר של השבב.אם השבב פגום, לכסות את כל החורים עם חתיכה קטנה של רדיד פוליאסטר, כדי להבטיח כי ואקום אחיד ניתן ליישם. לאחר מכן להחיל ואקום עדין כדי לשאוף את כל הנוזל העודף דרך השבב. הסר את השבב משלב טעינת השבב, ולהכתים בזהירות את החלק התחתון של השבב עם נייר מסנן כדי להסיר נוזל עודף.מניחים את השבב הטעון על החצי הגדול יותר של מחזיק השבב בין סימני המדריך, צד שטוח כלפי מטה. מניחים את החצי הקטן של מחזיק השבב על השבב כדי לאטום אותו. שני החצאים של מחזיק השבב אמורים להיכנס למקומו.לאחר מכן, באמצעות ברגים מכוסים, לתקן את השבב בבטחה במקום. כדי ליישר את השבב, החזק את מחזיק השבב בזווית של 30 מעלות בעת התקרבות להר. לאחר מכן השתמש בתלייה קימתית כדי למקם את השבב הטעון על שלב XYZ בקו הקרן.כאשר המגנטים יוצרים קשר, אפשר למחזיק השבב להסתובב במקביל לזרימה ולחץ למקומו. לאחר הצבת השבב, השתמש במערכת הצפייה בקו הקרן על הציר ובממשק המשתמש הגרפי של יישור השבב כדי לאתר את ה- fiducial השמאלי העליון של השבב. כדי למרכז את 0 fiducial ב- X, Y ו- Z, עבור פנימה והחוצה של המוקד כדי ליישר Z, למעלה ולמטה כדי ליישר Y, ושמאלה וימינה כדי ליישר X.ולאחר מכן לחץ על הגדר Fiducial 0"לאחר יישור fiducial 1 ו- 2 עם קרן הרנטגן באותו אופן, לחץ על צור מערכת מתואמת"כדי ליצור מטריצה מתואמת.לאחר מכן לחץ על בלוק בדוק"כדי להעביר את שלב XYZ לבאר הראשונה של כל בלוק עיר. אם כוונת הרנטגן תואמת את פתחי הצמצם, השבב מיושר. בייצוג גרפי זה של תוצאות חיפוש נקודתי מ- DIALS ניתן לצפות בהתוויה של קצב פגיעה מתעדכן.אם לוחצים על חבטה, תמונת ההסתעפות המתאימה תוצג במציג התמונות של DIALS. בטבלה זו, ניתן לדמיין את שיעורי יצירת האינדקס והאינטגרציה הנוכחיים המתעדכנים בזמן אמת עם איסוף הנתונים במהלך הביקור. הדמיה של הפרמטרים של תא היחידה יכולה לחשוף פולימורפים.חלקות דו מימדיות של פרמטרים שימושיים ניתן גם לייצר כדי לחשוף וריאציות המתעוררות עקב טעינה או התייבשות אפקטים. תחזיות סטריאוטוגרפיות יכולות לחשוף את הנוכחות או היעדר הכיוונים המועדפים שניתן להזין בחזרה לפרוטוקול הטעינה. לדוגמה, בהקרנה זו, ניתן לראות את ההשפעות של עומס יתר על שבב עם גבישי ליזוזים.בעת טעינת השבב, pipette לאט ולהשתמש באצבע שלך כדי להניח את pipette מעל השבב. זה מונע ממך לגעת בשבב ולדקור בטעות חורים בסיליקון. בעת עיבוד נתונים, הפוך את השימוש בצינורות האוטומטיים לזמינים.זה ייתן לך מושג טוב כיצד הניסוי שלך מתקדם, ואם אתה צריך לשנות משהו. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת חלבון שניתן לגבש בכמויות משמעותיות. והתגובה יכולה להיות מופעלת על ידי צילומי רנטגן קלים או ערבוב מהיר.מחקרים דינמיים על סדרה של מבנים יכולים לספק תובנה על אופן תפקוד החלבונים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

אופטימיזציה של הצמיחה של גבישי אנדותיאפפסין לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...