Name: fixed target serial data collection at diamond light source
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen.

1. Klargjøring og lasting av en brikke
MERK: Prosessen skjer i et fuktighetskontrollert miljø (figur 1), vanligvis mellom 80 % og 90 % eller høyere relativ luftfuktighet, for å forhindre at proteinkrystaller tørker ut. Når de er lastet og forseglet, kan krystaller overleve i opptil 24 timer. Dette kan imidlertid variere sterkt mellom krystallsystemer. Innenfor kammeret er en lavdrevet vakuumpumpe festet til et lastetrinn for å holde en silisiumbrikke (figur 1), en silisiumbrikke, en sponholder med polyesterfolie (figur 2), en p200 pipette, 200 μL pipettespisser, pinsett, filterpapir og proteinkrystallslammet.
<ol><li>Forbered en brikkeholder.<ol>
<li>Klipp to ark polyesterfolie i firkanter ca 6 cm x 6 cm.</li>
		<li>Legg polyesterplatene over de to bunnplatene (store og små).</li>
		<li>Fest polyesterplatene på plass ved hjelp av metalltetningsringene.</li>
		<li>Trekk forsiktig i overflødig polyesterfolie for å fjerne eventuelle bretter for å gjøre visualisering og sentreringsprøver enklere senere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Velg en silisiumbrikke med passende store blenderåpninger (7-30 μm) i forhold til krystallenes størrelse.</li>
	<li>Glød utladning av brikken i 25 sekunder ved 0,39 mBar og bruk en strøm på 15 mA for å muliggjøre enkel spredning av mikrokrystaller på brikken.</li>
	<li>Plasser silisiumbrikken på sponlastetrinnet ved hjelp av pinsett med de hevede stolpene vendt ned.</li>
	<li>Påfør 200 μL mikrokrystallslam på den flate siden av brikken ved hjelp av en pipette.</li>
	<li>Spred ut krystallslammet for å dekke alle "byblokkene" på brikken.</li>
	<li>Hvis brikken er skadet, dekk eventuelle hull med et lite stykke polyesterfolie eller filterpipettespiss for å sikre at et jevnt vakuum kan påføres.</li>
	<li>Påfør et skånsomt vakuum til all overflødig væske er sugd gjennom brikken.</li>
	<li>Fjern brikken fra sponlastetrinnet med pinsett.</li>
	<li>Tørk forsiktig undersiden av brikken med filterpapir for å fjerne overflødig væske.</li>
	<li>Plasser den lastede brikken på den største halvdelen av sponholderen mellom føringsmerkene på den flate siden ned.</li>
	<li>Forsegle brikken ved å plassere den lille halvdelen av sponholderen på toppen.<ol>
<li>De to halvdelene av sponholderen vil klikke på plass. Hvis den andre halvdelen ikke sitter i flukt, snurr du holderen 180° for å justere magnetene riktig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skru sponholderen lukket med sekskantskruer for å feste brikken godt på plass. MERK: Alternativt kan en "chipless" chip lastes på en lignende måte, med et mindre volum krystallslam (~ 15 μL) smurt mellom de to lagene av polyesterfolie i sponholderen 37, eller et mindre volum kan lastes ved hjelp av en 50 μm tykk dobbeltsidig selvklebende avstandsstykke påført direkte på polyesterfolien som beskrevet tidligere 38 . Bruken av selvklebende avstandsstykker gjør det også mulig å laste flere prøver (eller varianter av prøver som ligand soaks) på hver chipless chip. En komplementær lastemetode som utnytter akustisk drop ejection (ADE) for å laste silisiumbrikker, kan også brukes på Diamond39. ADE gjør det mulig å laste brikker ved hjelp av mindre mengder krystallslam enn pipettelasting. Det er en spesielt nyttig teknikk når prøver er knappe, selv om den kjemiske sammensetningen og viskositeten til slammet må tas i betraktning.</li>
</ol>2. GUI og oppsett ved bjelkelinjen
<ol><li>Utfør all brikkejustering og oppsett for datainnsamling gjennom et enkelt EPICS Display Manager (edm) grafisk brukergrensesnitt (GUI) (Figur 3a). Dette gir et pek-og-klikk-grensesnitt for stråleinstrumentering og gir inngangsparametere for Python-basert datainnsamling. Undervinduer gir ekstra kontroll for innsamling fra underregioner i en prøveholder (figur 3b) eller laser-/LED-pumpesondeeksperimenter (figur 3c).</li>
</ol>3. Justere brikken
<ol><li>Plasser den lastede brikken på XYZ-scenen ved strålelinjen (vist i figur 4a) ved hjelp av de kinematiske brakettene.<ol>
<li>Pass på å unngå å trekke stadiene langs reiseretningen. Magnetene i de kinematiske monteringene er ganske sterke, så dette kan gjøres ganske enkelt ved et uhell.</li>
		<li>Når du nærmer deg braketten, skal sponholderen holdes i en liten vinkel (±30°). Når magnetene kommer i kontakt, la sponholderen rotere parallelt med gulvet (0°) og sponholderen klikker på plass (Figur 4b).</li>
		<li>Når du laster ut en brikke, følger du en omvendt bane. Roter og vinkle brikken bort fra stadiene før du trekker chipholderen bort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruk strålelinjens visningssystem på aksen og sponjusterings-GUI, og finn den øverste venstre fiducial av brikken. Fiducials er tre firkanter, to små og en store, i rette vinkler til hverandre (Figur 5a). Brikken er bakgrunnsbelyst slik at brikken vil se mørk ut med blenderåpninger som hvite firkanter.</li>
	<li>Midtstill på fiducial null i X, Y og Z (Figur 5b). Juster X og Y ved å flytte henholdsvis venstre/høyre og opp/ned. Juster Z ved å flytte brikken inn og ut av fokus.</li>
	<li>Klikk Angi fiducial null.</li>
	<li>Gjenta trinn 3.2 for fiducial en (øverst til høyre, figur 5c) og fiducial to (nederst til venstre, figur 5d) for å justere alle fiducials med røntgenstrålen.</li>
	<li>Generer en koordinatmatrise ved å trykke på lag koordinatsystem, dette beregner forskyvningen, tonehøyden, rullen og yaw av brikken i forhold til stadiene, slik at alle etterfølgende bevegelser kan gjøres i chipkoordinatorrammen.</li>
	<li>Klikk På blokkkontroll for å flytte XYZ-fasen til den første brønnen i hver byblokk for visuell bekreftelse på at brikken er godt justert.</li>
	<li>Hvis røntgenkorset er på linje med åpningene, justeres brikken. Hvis ikke, gjentar du trinn 3.2-3.3. MERKNADER: Ved vanskeligheter med å justere (ødelagte fiducials), kan forskjellige blenderåpninger på brikken brukes til justering ved hjelp av rullegardinmenyen "justeringstype". Mange forskjellige typer brikke er tilgjengelige for innsamling av faste måldata. Ulike brikketyper innkvarteres ved bruk av rullegardinmenyen "chip type". De vanligste brikketypene som brukes på I24 er 'Oxford' og 'custom' chips. Nummeret og avstanden mellom blenderåpninger og fiducials på brikken leses fra en brikkeordbok definert via rullegardinmenyen. Tilpasset brikke gjør at blenderavstanden kan defineres direkte, noe som er spesielt nyttig for tynnfilmark-på-ark eller andre "chipless" -brikker der krystaller er tilfeldig plassert over holderen37. En ny Python GUI, som tilbyr move-on-click-funksjonalitet og automatisert brikkejustering, er for tiden under utvikling, men er ennå ikke klar for rutinemessig bruk på tidspunktet for skrivingen av dette manuskriptet.</li>
</ol>4. Sette opp datainnsamling
MERK: Datainnsamlingsoppsettet avhenger av systemet som studeres, og eksperimentet som skal utføres. Dette kan variere fra det enkleste SSX-eksperimentet, samle en lav dosestruktur, til et tids løst eksperiment ved hjelp av lasere eller rask blanding for å starte en reaksjon som vil kreve flere komplette datasett på forskjellige tidsforsinkelser. Hvis du vil konfigurere en datainnsamling, må følgende parametere defineres.
<ol><li>Eksperimentelle variabler: Fyll ut mappen, filnavnet, eksponeringstiden, overføringen, detektoravstanden og antall bilder per blenderåpning etter behov.</li>
	<li>Brikketype: Som beskrevet ovenfor, match brikketypen med brikken som er i bruk.<ol>
<li>Hvis en tynn film eller "chipless"-brikke brukes, setter du brikketypen til Ingen.</li>
		<li>Definer antall trinn og trinnstørrelse i både x og y i brukergrensesnittet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Angi karttype: Dette gjør det mulig å velge underavsnitt av en brikke for datainnsamling (figur 3b). "Ingen" betyr at data samles inn fra hver blenderåpning på en brikke. 'Lite' betyr at data samles inn fra utvalgte byblokker på brikken (Figur 3b). Dette kan være nyttig hvis for eksempel en region på en brikke er kjent for å være dårlig lastet eller tom. "Full" gjør det mulig å velge individuelle blenderåpninger for datainnsamling. I dette tilfellet må en riktig formatert tekstfil angis. Detaljer og en mal kan fås fra bjelkepersonalet.</li>
	<li>Pumpesonde: Velg type pumpesondeeksperiment og ønsket tidsforsinkelse. Utløsningen av pumpen (vanligvis en LED eller laser) er ofte spesifikk for et bestemt eksperiment, så vil ikke bli beskrevet i detalj her.<ol>
<li>'Korte' forsinkelser refererer til eksperimenter når det er en dvel ved hver blenderåpning mellom pumpen og sonden (dvs. pumpe, sonde, 'gå til neste prøve.) Forsinkelser er vanligvis i rekkefølgen 1 sekund eller titalls millisekunder.</li>
		<li>Lange forsinkelser refererer til en opphisselse og besøk igjen (EAVA) strategi, hvor blenderåpninger besøkes to ganger, med en definert tidsforsinkelse mellom besøk (dvs. pumpe, flytte, pumpe, flytte, sonde, flytte, sonde, etc.). Tidsforsinkelsen beregnes og eksponeringstiden for røntgen (figur 3c) og den er vanligvis ~1 sekund eller mer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vanlige datainnsamlingsmetoder
MERK: Følgende er nøkkelparametrene som definerer typen eksperiment som utføres. Denne delen forutsetter at de andre innstillingene fra protokoll 3 "Konfigurere datainnsamling" er definert.
<ol><li>
Scenario 1: Datainnsamling med lav dose. Samling av et enkelt diffraksjonsbilde fra hver valgte blenderåpning på prøveholderen.<ol>
<li>Sett antall bilder per blenderåpning til 1.</li>
		<li>Sett pumpesonden til Ingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scenario 2: En doseserie som samler inn n bilder sekvensielt fra hver valgte blenderåpning på prøveholderen. Brikken står stille ved hver blenderåpning mens hvert sett med n-bilder samles inn.<ol>
<li>Sett antall bilder per blenderåpning til 'n'. Vær oppmerksom på at behandlingen forenkles hvis n=5, 10, 20 eller et annet multiplum av 10. Det er vanskelig å etablere trender dersom n < 5. Det er nyttig å vurdere den totale tiden som kreves for å dekke en brikke og antall bildefiler som produseres når n økes.</li>
		<li>Sett pumpesonden til Ingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scenario 3: Pumpe-sonde metoder<ol>
<li>Velg en metode fra rullegardinmenyen Pumpesonde for å åpne lasereksitasjonskontrollsenteret.</li>
		<li>For et pumpeprobeeksperiment fyll laserboe ved hvert blenderåpningsalternativ.</li>
		<li>For EAVA fyller du ut Laser Dwell ved hver blenderåpning og røntgeneksponering og klikker Beregn.</li>
		<li>Velg riktig Gjenta-alternativ i rullegardinmenyen edm GUI-pumpesonde for ønsket forsinkelsestid.</li>
		<li>Hvis eksperimentet krever et trinn før belysning, fyll ut Laser 2 Dwell-delen. </li>
		<li>Når alle eksperimentelle variabler er definert, trykker du på Angi parametere og oppretter en kort liste. Dette laster eksperimentelle variabler inn på geobrick-kontrolleren. Etter at dette er gjort, vil du trykke på Start vil flytte detektoren inn, bakgrunnsbelysningen ut og starte datainnsamlingen. På alle punkter i oppsettet av datainnsamling er det nyttig å ha et terminalvindu åpent der tilbakemelding om status og resultat for hvert av trinnene skrives ut.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Databehandling
MERK: Generelt sett kan databehandling deles inn i tre grupper basert på hvor viktig det er å få tilbakemeldinger. Rask tilbakemelding er nødvendig for å vise om krystaller er til stede og diffract, og i så fall i hvilke tall. Dette bør holde tritt med datainnsamlingen. Utføre dataindeksering og integrasjon som kan være tregere, men som fortsatt bør utføres på sammenlignbare tidsskalaer med datainnsamling. Sammenslåing og skalering av refleksjonsintensiteter i en mtz-fil for strukturløsning og generering av elektrontetthetskart representerer det siste trinnet og kan fortsatt være langsommere. Her vil startrørledninger på I24 bare for de to første stadiene bli diskutert, da de kreves for tilbakemelding i sanntid for å veilede eksperimentet ditt, men vær oppmerksom på at beregninger som trefffrekvens og skaleringsstatistikk ikke er en erstatning for inspeksjon av elektrontetthet, noe som kan gi den eneste bekreftelsen på at en ligand har bundet, eller en reaksjon oppstod, i crystallo.
<ol><li>Rask tilbakemelding<ol>
<li>For å laste inn databehandlingsmodulene, last i24 ssx inn i terminalen på en hvilken som helst strålelinjearbeidsstasjon.</li>
		<li>Slik kjører du hit-finding analyse type i24-ssx /path/to/visit/directory/ inn i terminalen: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ MERK: Dette åpner tre terminalvinduer, og når data er skrevet til disken, en grafisk fremstilling av spotsøkingsresultater fra Diffraksjonsintegrasjon for avanserte lyskilder (DIALS) 40,41(Figur 6a).<ol>
<li>Standardinnstillingene scorer hvert tiendebilde og oppdateres med noen få sekunders mellomrom for å minimere beregningsbelastningen.</li>
			<li>Endre standarden ved å legge til et argument på slutten av kommandoen ovenfor. For eksempel vil 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx kjøre treffsøk på alle andre bilder. Dette kan imidlertid legge utilbørlig belastning på klyngen (en delt ressurs!) og redusere behandlingstidene. Grafen er fargekodet basert på sannsynligheten for vellykket indeksering, rødt viser minst 15 Bragg flekker har blitt funnet (god sjanse for indeksering), blå viser lite eller ingen nyttig diffraksjon.</li>
			<li>Vis diffraksjonsbilder av interesse for DIALS-bildeviseren ved å klikke på flekkene på spotfinnergrensesnittet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilbakemeldinger om indeksering og integrering MERK: Indeksering og integrering av diffraksjonsdata utføres med DIALS ved hjelp av dials.still_process funksjon 40,41. Som sådan bør spesifikk informasjon relatert til krystallen din (forventet krystallromsgruppe, enhetscelle og en eksperimentgeometri) settes inn i en .phil-tekstfil.<ol>
<li>Last inn DIALS-moduler ved å skrive inn modulinnlastingshjul i en terminal.</li>
		<li>Hvis du vil begynne å behandle en datasetttype dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. Fremdriften for alle datasett som fremdeles behandles, kan overvåkes ved å kjøre stills_monitor skript ved å skrive inn monitor_stills_process.py (etter at du har utført modulbelastning i24 ssx og endret katalog til gjeldende besøk) (Figur 6b).</li>
		<li>Enhetscelledistribusjonen av indekserte diffraksjonsdata (figur 7a) kan overvåkes ved hjelp av kommandoen ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/bane/til/ringer/output/*refined.expt combine_all_input=true Dette er spesielt nyttig for å identifisere og løse enhetscellepolymorfer som beskrevet tidligere 42.</li>
		<li>'Visualzie' hvis og hvordan denne distribusjonen varierer over et fast mål ved å produsere en 2D-tomt (figur 7b) ved hjelp av kommandoen python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>Produser stereografiske projeksjoner av alle indekserte diffraksjonsdata (figur 7c) ved hjelp av DIALS-kommandoen dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =Sann /bane/til/ringer/utdata/*raffinert.expt. MERK: Det er en vanlig patologi når du behandler stillbilder av data fra krystaller der symmetrien til Bravais-gitteret er høyere enn romgruppesymmetrien som fusjonerte data, vises som en perfekt tvilling. Databehandlingsalgoritmer har utviklet seg for å løse denne patologien 43,44,45,46, men brukere bør være oppmerksomme på dette mens de behandler dataene sine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Seriell synkrotrondatainnsamling er en relativt ny teknikk ved MX-strålelinjer, som bygger bro mellom de ultraraske datainnsamlingene som for tiden utføres ved XFELer og tradisjonell synkrotronbasert MX. Dette manuskriptet tar sikte på å gi en oversikt over hvordan man lykkes med å samle inn seriedata med fast mål ved beamline I24, Diamond Light Source for lav dose, doseserier og tids løste eksperimenter. Som med standard krystallografi er prøvepreparering en stor flaskehals i strukturløsning. SSX er ikke annerledes, og tilberedning av en homogen krystallslam i tilstrekkelige mengder har ennå ikke hatt nytte av flere tiår med studier og raffinement som veksten av enkelt store proteinkrystaller har. Imidlertid er forberedelsen av disse slurries utenfor omfanget av dette papiret og har blitt oppsummert andre steder36. Det kritiske trinnet i tilnærmingen som er beskrevet her, innebærer nøye bruk av den tilgjengelige prøven ved hjelp av brukervennlige GUI-grensesnitt (trinn 3) og automatiserte databehandlingsforløp (trinn 6) for å informere brikkebelastningen (trinn 1) og hvordan et eksperiment skal fortsette.
Den raske tilbakemeldingspipeline er et kraftig verktøy som lar brukerne vurdere innledende trefffrekvenser under datainnsamling for å informere påfølgende brikkeinnlastingsprotokoller for vellykket datainnsamling. Når de står overfor en lav trefffrekvens (<5%), risikerer brukerne å samle ufullstendige data og / eller kaste bort stråletid med flere samlinger. I dette tilfellet kan prøven samles, konsentreres av skånsom sentrifugering, og/eller større volumer kan lastes inn i trinn 1.5. En høyere trefffrekvens er generelt gunstig, men det er et poeng med å redusere avkastningen der overbelastning fører til flere krystaller i samme brønn. DIALS er i stand til å håndtere multi-gitter diffraksjonsdata50, men en større bekymring enn indeksering og integrasjon er den skadelige effekten krystallgruppering kan ha på jevn aktivering av krystaller ved laserlys eller rask blanding for presis tid løst eksperimenter. Det bør derfor utvises særlig forsiktighet for å unngå overbelastning av faste mål for tids løste eksperimenter.
Indekserings- og integrasjonsbehandlingstrinnet produserer et plott med det sentrale korset som representerer stråleretningen, hvert punkt som representerer retningen til hkl 001-refleksjonen av individuelle gitter, og sirkelens ytre ring som representerer en rotasjon på 90 ° fra bjelkeaksen. Dette vil vise om krystallene dine har en foretrukket retning, noe som kan påvirke datafullhet og indikere behovet for å samle inn mer data eller variere lasteprotokollen. I panelet til venstre i figur 7cvises effekten av å overbelaste en brikke med HEWL-krystaller. Når blenderåpninger fylles med flere krystaller, holder de seg til de vinklede veggene i blenderåpningene i stedet for å luke ved foten i en tilfeldig retning. De to ortogonale ellipsene er et resultat av krystaller som ligger på brikkens indre vegger som er på ~ 35 ° til stråleretningen. Dette reduserer volumet av krystaller lastet, reduserer treffhastigheten, og reduserer dramatisk brøkdelen av krystaller som ligger i disse foretrukne planene.
Det skal bemerkes at andre serielle tilnærminger er tilgjengelige på I24, for eksempel LCP-ekstrudere og mikrofluidiske sjetonger. Disse bruker lignende GUIer, og de samme prosesseringsrørledningene så mye av det ovennevnte vil forbli aktuelt selv om en annen teknikk brukes. Det finnes en rekke serielle tilnærminger for både SSX og SFX utover den faste måltilnærmingen som er beskrevet her, hver har visse fordeler i forhold til den andre, avhengig av eksperimentet som skal utføres og strålelinjen som brukes til eksperimentet. Ettersom serielle tilnærminger utvikler seg raskt, anbefales det å sjekke beamline-nettsidene (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) for nylige oppdateringer og snakke med strålepersonell på et så tidlig stadium som mulig når du planlegger stråletid. Tilgang til I24 for standard- og serieeksperimenter er gratis ved bruk. For britiske og EU-brukere dekkes reise- og oppholdskostnader delvis gjennom iNEXT Discovery.

Seriell synkrotronkrystallografi (SSX) er en ny metode for datainnsamling som ble inspirert av røntgenfrie elektronlasere (XFEL)1,2,3. Ved en XFEL registreres et enkelt diffraksjonsmønster fra en vanligvis veldig liten proteinkrystall, før krystallen ødelegges av den ekstremt lyse røntgenpulsen. Dette betyr vanligvis at en ny krystall må innføres i røntgenstrålen for å få et annet diffraksjonsmønster4. Dette behovet for å kontinuerlig etterfylle krystaller har drevet utviklingen av mange seriell prøveleveringsteknikker5.
Ved synkrotroner brukes klassiske (ikke-serielle) rotasjonskrystallografimetoder mye, og utnytter en enkelt stor krystall som roteres i en røntgenstråle ved hjelp av et goniometer for å samle et komplett datasett for strukturløsning6. For å øke levetiden til krystaller slik at et komplett datasett kan samles inn7,8, og også for å lette frakt og automatisert prøveoverføring, blir krystaller kryoolert til ~ 100 K for datainnsamling. Ved intense mikrofokusstråler brukes ofte multikrystallstrategier, da strålingsskader kan forby innsamling av et komplett datasett fra en enkelt krystall9,10,11. Til tross for grensene som pålegges av strålingsskader, forblir antall krystaller som brukes relativt beskjeden, og tilnærmingen som brukes er i hovedsak identisk med enkeltkrystalleksperimentet.
SSX bruker derimot seriell prøvelevering for å få enkle fortsatt diffraksjonsmønstre fra tusenvis av tilfeldig orienterte krystaller for å generere et komplett datasett. Det bemerkes at serielle teknikker som inkorporerer krystallrotasjon er under utvikling12,13 selv om vi fokuserer på still, null rotasjon, tilnærminger. Det finnes et bredt utvalg av prøveleveringssystemer med forskjellige fordeler og ulemper14, alt fra å levere en strøm av krystaller i en strømningsfokusert / viskøs jet15,16,17, mikrofluidisk chip18,19eller krystaller på et fast mål, for eksempel en etset silisiumbrikke20,21 . Vanligvis holdes krystaller ved romtemperatur, slik at større konformasjonsmangfold kan observeres og gir et mer fysiologisk relevant miljø22. SSX muliggjør innsamling av svært lave dosedatasett23, da den totale dosen av datasettet tilsvarer en enkelt kort røntgeneksponering av en krystall. En annen stor fordel SSX gir er studiet av proteindynamikk gjennom tidsløste metoder, med reaksjoner utløst av eksponering for laserlys24,25,26,27eller ved blanding av krystaller og ligand / substrat28,29. Bruk av mindre krystaller betyr at laserlys kan trenge inn i hele krystallen, og jevnt initiere reaksjonen uten multifotonabsorpsjon for å gi veldefinerte reaksjonsformidlere for diffraksjonsdata tatt på forskjelligetidspunkter 27. Bruk av større krystaller og rotasjonsbaserte datainnsamlingsmetoder lider av en begrenset lasergjennomtrengningsdybde, avviks- eller multifotonaktivering, strålingsskade og mekanisk overheadtid innen datasveiper, noe som resulterer i en blanding av reaksjonsforenkninger som kan vise seg vanskelig eller umulig å tolke ved raskere reaksjonshastigheter. Mindre krystaller gir en lignende fordel ved å blande eksperimenter, da ligander raskt og mer jevnt kan diffusere gjennom hele krystallen, slik at definerte reaksjonsforenkninger kan registreres på forskjellige tidspunkterforsinkelser 30,31,32.
Ved Diamonds mikrofokusstrålelinje I24 kan både konvensjonell rotasjon og SSX-eksperimenter utføres. Her presenteres en omfattende protokoll for SSX-prøveforberedelse og datainnsamling ved hjelp av faste mål på I24 og protokoller for dataanalyse av serielle data hos Diamond. Mens manuskriptet og tilhørende videoer skal tillate brukere å utføre et vellykket SSX-eksperiment på I24, bør det bemerkes at dette er et raskt utviklende felt og tilnærminger utvikler seg kontinuerlig. Det skal også bemerkes at serielle metoder er tilgjengelige ved andre synkrotronkilder, inkludert, men ikke begrenset til Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI og PXII)34og NSLS (FMX)35. Selv om spesifikasjonene for innsamling og behandling av serielle data vil variere mellom kilder, vil kjerneprinsippene forbli de samme. Protokollene nedenfor bør sees for å representere et utgangspunkt og en vei til baseleir i stedet for toppen av det som kan oppnås.
Denne protokollen antar at brukerne har et protein- eller lite molekylkrystallsystem, hvorfra en mikrokrystallslam på 0,5-2,0 ml med god tetthet av mikrokrystaller per ml er produsert. Protokoller for å skaffe krystallslam har blitt beskrevet tidligere 36. Mange forskjellige typer fast mål er tilgjengelige, de mest brukte på I24 bruker en presist definert silisiumbrikke. For å skille fra andre brikkeoppsett, under og i strålelinjegrensesnittet kalles dette en "Oxford-brikke". Som tidligere beskrevet består Oxford-chipoppsettet av 8×8 "byblokker", som hver inneholder 20×20 blenderåpninger for totalt 25 600 blenderåpninger20,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chip Holders</td>
			<td>Custom Built</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chipless Chip Spacers</td>
			<td>SWISCII</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geobrick LV-IMS-II</td>
			<td>Delta Tau</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A&#160;multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mounts</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td>Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNF Laboport Vacuum Pump</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z262285-1EA</td>
			<td>Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 6 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15360562</td>
			<td>300 ft roll of 6 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 3 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-675-4</td>
			<td>300 ft roll of 3 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>91000</td>
			<td>A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Chips</td>
			<td>University of Southampton</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1byOne Humidifier (701UK-0003 )</td>
			<td>1byOne</td>
			<td>B01DENO0EQ</td>
			<td>Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixed target serial data collection at diamond light source

Seriell datainnsamling er en relativt ny teknikk for synkrotronbrukere. Diamond Light Source er en brukerhåndbok for innsamling av faste måldata på I24, og presenteres med detaljerte trinnvise instruksjoner, figurer og videoer for jevn datainnsamling.

Datainnsamling og serier med lav dose Lav dose (Trinn 5.1: Scenario 1) og doseringsserier (Trinn 5.2: Scenario 2) ble samlet inn på kobbernitritt reduktase mikrokrystaller ved I24 og har blitt publisert tidligere 42. Alle prøver ble utarbeidet som beskrevet i trinn 1, data samlet inn i henhold til trinn 3, 4 og 5, og behandlet ved hjelp av metoder i trinn 6. I dette arbeidet ble det samlet inn en hurtigdoseserie med 20 diffraksjonsbilder tatt ved hver blenderåpning (dvs. n=20 i datainnsamlings-GUI vist ovenfor) før de gikk over til en ny prøve. Fra disse dataene ble det identifisert en bimodal fordeling av enhetsceller i romgruppe P213 (a = b = c = 97,25 Å, og a = b = c = 96,38 Å). Identifisering og separering av disse enhetscellepolymorfer for behandling viste en markert forbedring i datakvalitetsindikatorer og avslørte to forskjellige strukturer i en fleksibel sløyfe mellom rester 189-193 i stedet for blandet tilstand observert ved behandling av alle data sammen. Identifisering av slike polymorfer kan utgjøre hele forskjellen i en delikat tidsavklart strukturell studie der bare små strukturelle endringer forventes. Videre viste doseserien som ble samlet inn en doseavhengig enhetscelleendring i krystallen, med økt doseskifte befolkningen til fordel for den større enhetscellen.
Lignende arbeid ble utført av Ebrahim et al (2019)47, hvor en doseserie (Trinn 5.2: Scenario 2) ble samlet inn fra en fargestoff-type heme peroksidase fra Streptomyces lividans (DtpAa) for å sammenligne lavdose strukturer fra SSX (Trinn 5.1: Scenario 1) med de som måles i samme faste målsystem ved hjelp av SFX. SFX-data ble samlet inn ved SACLA Beamline BL2 EH3 med en pulslengde på 10 femtosekonds og en repetisjonshastighet på 30 Hz. Pulsvarigheten på 10 femtosecond sikrer at doseavhengige effekter ikke finnes i SFX-dataene. SFX-data ble sammenlignet med SSX-data samlet inn på strålelinje I24, der 10 sekvensielle 10 millisekundeksponeringer ble målt ved hver prøveposisjon (dvs. n=10). Den doseavhengige migrasjonen av et heme jernkoordinert vannmolekyl vekk fra jernet ble observert, samt en konformasjonsendring i en av heme-propionategruppene i SSX-doseserien. Selv om den ikke var skadefri som SFX-strukturen, tillot doseserien fe-O-bindingslengden på et nulldosedatasett (ferric heme) å bli ekstrapolert, med dette enig innen eksperimentell feil med verdien oppnådd fra SFX.
De serielle krystallografi datainnsamlingsmetodene som er beskrevet her, kan også enkelt tilpasses for å gi nye prøvemiljøer for for eksempel å studere anaerobe proteinstrukturer ved romtemperatur. Som skissert i Rabe et al 2020 48, laster du inn en 'ark-på-ark' prøve, eller 'chipless chip', med forskjellige tetningsfilmer i et anerobt kammer muliggjør romtemperaturinnsamling av strukturelle data fra dioksygenfølsomme prøver.
Pumpe sonde Selv om følgende representative resultater ikke ble samlet inn på Diamond Beamline I24, er disse metodene utviklet i nært samarbeid mellom anlegg i iNEXT-programmet for å arbeide mot standardmetoder innen utvikling av seriell krystallografimetode. Beamline I24 tilbyr, eller vil snart tilby, tilsvarende innsamlingsmetoder til de som er beskrevet nedenfor for å utføre slike eksperimenter ved hjelp av metodene beskrevet i protokollene ovenfor.
Pumpeprobe: Rask blanding Rask blanding SSX har blitt utført ved strålelinje T-REXX ved PETRA III av Mehrabi et al (2019) 28 ved hjelp av en piezo drevet dråpeinjektor for å initiere reaksjoner på faste mål. Dette arbeidet presenterer et prinsippbevis om chip mixing eksperimentbinding GlcNac3til lysozyme mikrokrystaller, med binding som forekommer innen 50 ms av en 75 pL dråpe som påføres prøven. Denne studien ble fulgt opp med en 7-struktur tidsløst serie av xylose isomerase aktivitet, som demonstrerer glukosebinding innen 15 ms og dannelsen av en åpen ringkonformasjon i glukosemolekylet etter en 60 sekunders forsinkelse. Et tilsvarende oppsett for dråpeinjeksjon er for tiden under utvikling for bruk på I24.
Pumpe-sonde: Lysaktivering Et lysaktivert pumpe-sonde serieeksperiment presenteres i Schulz et al (2018) 49. Fluoracetat dehydrogenase ble gjennomvåt med fotocaged fluoracetat og pumpet med 320-360 nm laserlys for å produsere strukturer på 4 tidspunkter (t = 0, 30, 752 og 2,052 ms). Hviletilstandsstrukturen (0 ms) viser et tomt aktivt sted, med unntak av noen få vannmolekyler, og tilsvarende tetthet mellom cap-domenene til begge proteinunderenheter. 30 ms og 752 ms etter lysaktivering kan det observeres en betydelig reduksjon i elektrontetthet i hettedomenet til underenhet B i forhold til underenhet A. Reduksjonen i elektrontetthet i hettedomenet til underenhet B sammenfaller med utseendet av fluoracetat i det aktive stedet for underenhet A på 752 ms. Det endelige datasettet på 2052 ms viser ytterligere strukturell omorganisering av liganden, mistenkt for å lette riktig geometri for SN2-angrep, og potensiell dannelse av en mellomliggende tilstand i reaksjonen. På I24 kan et bærbart Pharos lasersystem som kan justeres fra 210-2500 nm som gir femtosecond-pulser brukes til lysaktivering. Innledende eksperimenter viste vellykket aktivering av et fotosebilde ved hjelp av 308 nm eksitasjon med binding av den frigjorte liganden til målproteinet som ble observert. I skrivende stund pågår integrering i stråletelefonens sikkerhetssystem, og rutinemessige brukerforsøk forventes tidlig i 2021. For eksperimenter når mindre intense lyspulser kreves, har lysaktivering med TTL-kontrollerte lysdioder blitt utført.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Figur 1: Prøvelasteutstyr på plass ved Diamantlyskilde. Oppsettet består av en vakuumpumpe (a), hanskeboks (b) og luftfukter (c). Innenfor hanskeboksen brukes vakuumtrykket til å virke på en brikke lastet med krystallslam som holdes i en prøveblokk (d) festet til en Büchner-kolbe (e, grønn pil), via en trykkregulator (f, gul pil) festet til en stoppekran (g, blå pil). Fuktig luft pumpes inn i teltet via plastrør festet til luftfukteren (h), og måles ved hjelp av et hygrometer (i). Komponentene holdes på plass ved hjelp av klemmestativer (j). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Figur 2: Prøveholdere. De bruker en metall O-ring (a) for å klemme polyesterfilm på en topp (b) og bunn (c) halvdel, med den nederste halvdelen sportslige magnetiske fester (d) som brukes til å feste prøveholderen til prøvestadiene. Polyesterfilmen (6 μm (e) eller 3 μm (f)) samt gummi O-ringer (hvite piler) forhindrer at en krystallbelastet brikke tørker raskt i en prøveholder som er tett lukket med sekskantskruer (g). Sjetonger rengjøres med sekvensielle 15-minutters bad i dH2O, 1 M HCl og dH2O (h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Figur 3: Datainnsamling GUI for innsamling av faste måldata ved I24. (a) Viser hovedgrensesnittet som brukes til å justere brikker og definere datainnsamlingsparametere, (b) er mapping lite-grensesnittet som brukes til å definere underregioner av en brikke for datainnsamling og (c) er et grensesnitt for å definere parametere for laserbelysning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Figur 4: Prosessen med å montere en brikkeholder på stadiene som beskrevet i trinn 3, punkt 1. Klikk her for å se en større versjon av denne <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Figur 5: Sponjustering. En brikke justeres ved å klikke på tre fiducial markører på brikken vist i (a). Visninger av fiducials 0, 1 og 2 gjennom beamline on-axis visningssystem vises i (b), (c) og (d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Figur 6: Resultater av automatisk behandling vises som beskrevet i trinn 6.1. En oppdatering av trefffrekvenstegning vises (a, inset). Hvis et "treff" klikkes på det tilsvarende diffraksjonsbildet, vises det i bildeviseren for oppringinger. Trefffrekvensen for gjeldende datainnsamling vises (29,6 % i dette eksemplet). Panel (b) viser et eksempel på et vindu som viser gjeldende indekserings- og integrasjonsfrekvenser for data som er samlet inn så langt under besøket som oppdateres i sanntid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Figur 7: Mer detaljert dataanalyse. Visualisering av enhetscelleparametere kan vise polymorfer (a). Gjennomsnittlige enhetscelleparametere beregnes. Dette strekker seg imidlertid ikke til individuelle gjennomsnitt for polymorfer. Visualisering av et lite delsett av data (data vist er et delsett av 793 kobbernitritt-reduktasekrystaller fra dataene beskrevet i Ebrahim et al 2019) er ofte tilstrekkelig til å avsløre trender. 2D-plott med nyttige parametere kan også produseres for å avdekke variasjoner som oppstår på grunn av innlastings- eller dehydreringseffekter som kan løses for kommende datainnsamlinger (b). Stereografiske projeksjoner kan avsløre tilstedeværelsen, eller fraværet, foretrukne orienteringer som strømmer tilbake til lasteprotokollen (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Vi presenterer en omfattende guide til klargjøring av faste målekseringer, datainnsamling og databehandling for seriell synkrotronkrystallografi ved Diamond beamline I24.

Seriedatasamling med fast mål ved diamantlyskilde

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Seriell synkrotronkrystallografi, eller SSX, er et relativt nytt og raskt utviklende område av MX.It er veldig godt egnet til eksperimenter med lav dose og romtemperatur, men kanskje viktigst av alt, det er veldig godt egnet til å følge dynamikken. Dette gjør at stop-motion filmer av proteiner i aksjon kan gjøres. På I24 er flere moduser for SSX tilgjengelig.Denne protokollen fokuserer på SSX med fast mål, som tillater et bredt spekter av serielle eksperimenter ved hjelp av begrensede mengder utvalg. Silisiumbrikkene kan bli skadet når du laster og rengjør dem, hvis du ikke er kjent med dem. Chipjusteringsprotokollen er også helt ny for mange krystallografer, og databehandlingen er litt forskjellig fra standard rotasjonsdata.For å forberede en sponholder, kutt to ark med polyesterfolie i omtrent 6 x 6 centimeter firkanter, og legg arkene over de to baseplatene. Bruk metalltetningsringer til å feste arkene på plass, og trekk deretter forsiktig i overflødig folie for å fjerne eventuelle bretter. Velg deretter en silisiumbrikke med passende store blenderåpninger i forhold til størrelsen på krystallene som skal analyseres.Glød utladning av brikken i 25 sekunder ved 0,39 millibar, med en 15 milliamperestrøm. Bruk pinsett til å plassere silisiumbrikken på sponlastetrinnet, med de hevede stolpene vendt ned. Deretter, ved hjelp av en pipette, påfør 200 mikroliter av mikrokrystallslammet på den flate siden av brikken, spre slurry for å dekke alle byens blokker av brikken.Hvis brikken er skadet, dekk eventuelle hull med et lite stykke polyesterfolie for å sikre at et jevnt vakuum kan påføres. Påfør deretter et skånsomt vakuum for å aspirere all overflødig væske gjennom brikken. Fjern brikken fra sponlastetrinnet, og flekk forsiktig undersiden av brikken med filterpapir for å fjerne overflødig væske.Plasser den lastede brikken på den største halvdelen av sponholderen mellom føringsmerkene, flat side ned. Plasser den lille halvdelen av sponholderen på brikken for å forsegle den. De to halvdelene av sponholderen skal klikke på plass.Deretter, ved hjelp av sekskantskruer, fest brikken sikkert på plass. For å justere brikken, hold sponholderen i en 30-graders vinkel mens du nærmer deg braketten. Bruk deretter de kinematiske brakettene til å plassere den lastede brikken på XYZ-scenen ved bjelkelinjen.Når magnetene kommer i kontakt, la sponholderen rotere parallelt med strømmen, og klikk på plass. Når brikken er plassert, bruk strålelinjen på aksevisningssystemet og det grafiske brukergrensesnittet for brikkejustering for å finne den øverste venstre fiducial av brikken. For å fokusere på fiducial 0 i X, Y og Z, flytt inn og ut av fokus for å justere Z, opp og ned for å justere Y, og venstre og høyre for å justere X.Deretter klikker du på Angi Fiducial 0"Etter å ha justert fiducial 1 og 2 med røntgenstrålen på samme måte, klikker du på Lag koordineringssystem"For å generere en koordinerende matrise.Klikk deretter på Blokker sjekk"for å flytte XYZ-scenen til den første brønnen i hver byblokk. Hvis røntgenkorset er på linje med blenderåpningene, justeres brikken. I denne grafiske representasjonen av spotfunnresultater fra DIALS kan en oppdatering av trefffrekvensplott observeres.Hvis du klikker et treff, vises det tilsvarende diffraksjonsbildet i DIALS-bildevisningsprogrammet. I denne tabellen kan gjeldende indekserings- og integrasjonshastigheter som oppdateres i sanntid etter hvert som dataene samles inn under besøket, visualiseres. Visualisering av enhetscelleparametrene kan avsløre polymorfer.Todimensjonale tomter med nyttige parametere kan også produseres for å avdekke variasjoner som oppstår på grunn av lasting eller dehydreringseffekter. Stereografiske projeksjoner kan avsløre tilstedeværelsen eller fraværet av foretrukne orienteringer som kan mates tilbake til lasteprotokollen. For eksempel, i denne projeksjonen, kan effekten av å overbelaste en chip med lysozymekrystaller observeres.Når du laster inn brikken, pipette sakte og bruk fingeren til å hvile pipetten over brikken. Dette forhindrer deg i å berøre brikken og ved et uhell stikke hull i silisiumet. Når du behandler data, må du gjøre bruk av de automatiserte datasamlebåndene tilgjengelige.Dette vil gi deg en god ide om hvordan eksperimentet ditt utvikler seg, og om du trenger å variere noe. Denne metoden kan brukes på ethvert proteinsystem som kan krystalliseres i betydelige mengder. Og reaksjonen kan utløses av lette røntgenstråler eller rask blanding.Dynamiske studier på en rekke strukturer kan gi innsikt i hvordan proteiner fungerer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt selvstendig karakterisering og datainnsamling fra krystaller av biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse av SEC-SAXS-data via EFA-overføring og spredning

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimalisering av veksten av endothiapepsinkrystaller for serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturell bestemmelse av et enzym:Substrat kompleks av seriell krystallografi i en allsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Prøvepreparerings- og overføringsprotokoll for langbølgelengdekrystallografi i vakuum på beamline I23 ved diamantlyskilde

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...