Name: fixed target serial data collection at diamond light source
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Эта работа была поддержана программой iNEXT-Discovery (Grant 871037), финансируемой программой Horizon 2020 Европейской комиссии.

Сбор последовательных синхротронных данных является относительно новым методом на линиях луча MX, преодолевая разрыв между сверхбыстрыми сборами данных, которые в настоящее время выполняются в XFEL, и традиционными MX на основе синхротронов. Эта рукопись призвана дать обзор того, как успешно собирать последовательные данные с фиксированной целью на линии луча I24, алмазном источнике света для низких доз, серий доз и экспериментов с временным разрешением. Как и в случае со стандартной кристаллографией, пробоподготовка является основным узким местом в структуре раствора. SSX ничем не отличается, и приготовление однородной кристаллической суспензии в достаточных количествах еще не выиграло от нескольких десятилетий изучения и уточнения, как рост одиночных крупных кристаллов белка. Однако приготовление этих навозных средств выходит за рамки настоящего документа и кратко изложено в другом месте36. Критический шаг в подходе, описанном здесь, включает в себя тщательное использование доступного образца с использованием простых в использовании интерфейсов GUI (шаг 3) и автоматизированных конвейеров обработки данных (шаг 6) для информирования о загрузке чипа (шаг 1) и о том, как должен продолжаться эксперимент.
Конвейер быстрой обратной связи является мощным инструментом, который позволяет пользователям оценивать начальные показатели попадания во время сбора данных, чтобы информировать последующие протоколы загрузки чипов для успешного сбора данных. Сталкиваясь с низкой частотой попаданий (<5%), пользователи рискуют собрать неполные данные и/или потратить время луча на дополнительные коллекции. В этом случае образец может быть объединен, сконцентрирован путем мягкого центрифугирования и/или большие объемы могут быть загружены на этапе 1.5. Более высокая скорость попадания, как правило, благоприятна, однако существует точка убывающей отдачи, когда перегрузка приводит к нескольким кристаллам в одной и той же скважине. DIALS способен иметь дело с многорешетчатыми дифракционными данными50,но большую озабоченность, чем индексация и интеграция, вызывает пагубное влияние группировки кристаллов на даже активацию кристаллов лазерным светом или быстрое смешивание для экспериментов с точным временным разрешением. Поэтому следует проявлять особую осторожность, чтобы избежать перегрузки фиксированных целей для экспериментов с временным разрешением.
На этапе обработки индексации и интегрирования получается график с центральным крестом, представляющим направление луча, каждая точка представляет направление отражения hkl 001 отдельных решеток, а внешнее кольцо окружности представляет собой вращение на 90° от оси луча. Это покажет, имеют ли ваши кристаллы предпочтительную ориентацию, что может повлиять на полноту данных и указать на необходимость сбора большего количества данных или изменения протокола загрузки. На левой панели рисунка 7cпоказан эффект перегрузки чипа кристаллами HEWL. По мере того, как отверстия заполняются большим количеством кристаллов, они прилипают к угловым стенкам отверстий, а не заклиниваются у основания в случайной ориентации. Два ортогональных эллипса являются результатом кристаллов, лежащих на внутренних стенках чипа, которые находятся на ~ 35 ° к направлению луча. Это уменьшает объем нагруженных кристаллов, снижает скорость попадания и резко уменьшает долю кристаллов, лежащих в этих предпочтительных плоскостях.
Следует отметить, что в I24 доступны и другие последовательные подходы, такие как экструдеры LCP и микрофлюидные чипы. Они используют похожие графические интерфейсы и одни и те же конвейеры обработки, поэтому многое из вышеперечисленного останется применимым, даже если используется другой метод. Существует ряд последовательных подходов как для SSX, так и для SFX за пределами подхода с фиксированной целью, описанного здесь, каждый из которых имеет определенные преимущества перед другим в зависимости от эксперимента, который будет выполнен, и линии луча, используемой для эксперимента. Поскольку последовательные подходы быстро развиваются, рекомендуется проверять веб-страницы линии луча (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) на предмет последних обновлений и разговаривать с персоналом beamline как можно раньше при планировании времени луча. Доступ к I24 для стандартных и серийных экспериментов является бесплатным в точке использования. Для пользователей из Великобритании и ЕС расходы на проезд и проживание частично покрываются за счет iNEXT Discovery.

Последовательная синхротронная кристаллография (SSX) является новым методом сбора данных, который был вдохновлен рентгеновскими лазерами на свободных электронах (XFEL)1,2,3. При XFEL одна дифракционная картина регистрируется из обычно очень маленького кристалла белка, прежде чем кристалл разрушается чрезвычайно ярким рентгеновским импульсом. Это означает, как правило, что новый кристалл должен быть введен в рентгеновский пучок для получения другой дифракционной картины4. Эта потребность в постоянном пополнении кристаллов привела к разработке многих серийных методов доставки образцов5.
На синхротронах широко применяются классические (несерийные) методы кристаллографии вращения, использующие одиночный большой кристалл, который вращается в рентгеновском луче с использованием гониометра для сбора полного набора данных для структурного решения6. Для того, чтобы увеличить срок службы кристаллов, чтобы можно было собрать полный набор данных7,8, а также облегчить транспортировку и автоматическую передачу образцов, кристаллы криокулируются до ~ 100 K для сбора данных. При интенсивных микрофокусных линиях луча часто используются многокристаллические стратегии, поскольку радиационное повреждение может препятствовать сбору полного набора данных из монокристалла9,10,11. Несмотря на ограничения, налагаемые радиационным повреждением, количество используемых кристаллов остается относительно скромным, а используемый подход по существу идентичен эксперименту с монокристаллами.
SSX, с другой стороны, использует последовательную доставку образцов для получения одиночных дифракционных паттернов из тысяч случайно ориентированных кристаллов для создания полного набора данных. Отмечается, что серийные методы, включающие вращениекристаллов,находятся в стадии разработки12,13, хотя мы фокусируемся на неподвижных, нулевых вращениях, подходах. Существует широкий спектр систем доставки образцов с различными преимуществами и недостатками14,начиная от доставки потока кристаллов в потоке сфокусированной/вязкой струи15,16,17,микрофлюидного чипа18,19или кристаллов на неподвижную мишень, такую как травленый кремниевый чип20,21 . Как правило, кристаллы удерживаются при комнатной температуре, что позволяет наблюдать большее конформационное разнообразие и обеспечивает более физиологически значимуюсреду 22. SSX позволяет собирать наборы данных об очень низких дозах23,поскольку общая доза набора данных эквивалентна одному короткому рентгеновскому облучению одного кристалла. Другим важным преимуществом SSX является изучение динамики белка методами с временным разрешением, с реакциями, вызванными воздействием лазерного света24,25,26,27или смешиванием кристаллов и лиганда/подложки28,29. Использование меньших кристаллов означает, что лазерный свет может проникать во весь кристалл, равномерно инициируя реакцию без многофотонного поглощения, чтобы обеспечить четко определенные промежуточные продукты реакции для дифракционных данных, полученных в разных точкахвремени 27. Использование более крупных кристаллов и методов сбора данных на основе вращения страдает от ограниченной глубины проникновения лазера, неоднородной или многофотонной активации, повреждения излучения и механического накладного времени в развертках данных, что приводит к сочетанию промежуточных реакций, которые может оказаться трудным или невозможным для интерпретации при более высоких скоростях реакции. Меньшие кристаллы обеспечивают аналогичное преимущество в экспериментах по смешиванию, так как лиганды могут быстро и более равномерно диффундировать по всему кристаллу, что снова позволяет регистрировать определенные промежуточные продукты реакции с различными временными задержками30,31,32.
В микрофокусной лучевой линии I24 Diamond могут быть выполнены как обычные вращения, так и эксперименты SSX. Здесь представлен комплексный протокол подготовки образцов SSX и сбора данных с использованием фиксированных мишеней на I24 и протоколы анализа данных серийных данных на Diamond. Хотя рукопись и сопровождающие ее видеоролики должны позволить пользователям провести успешный эксперимент SSX на I24, следует отметить, что это быстро развивающаяся область, и подходы постоянно развиваются. Следует также отметить, что серийные методы доступны и на других синхротронных источниках, включая, но не ограничиваясь, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI и PXII)34и NSLS (FMX)35. Хотя специфика сбора и обработки последовательных данных будет отличаться в зависимости от источника, основные принципы останутся прежними. Приводимые ниже протоколы следует рассматривать как отправную точку и путь к базовому лагерю, а не как вершину того, что может быть достигнуто.
Этот протокол предполагает, что пользователи имеют белковую или низкомолекулярную кристаллическую систему, из которой получена микрокристаллическая суспензия порядка 0,5-2,0 мл с хорошей плотностью микрокристаллов на мл. Протоколы получения кристаллических суспензий были описаны ранее 36. Доступно много различных типов фиксированных мишеней, наиболее часто используемые в I24 используют точно определенный кремниевый чип. Чтобы отличаться от других макетов чипов, ниже и в интерфейсе beamline это называется «оксфордским чипом». Как описано ранее, макет оксфордского чипа содержит 8×8 «городских блоков», каждый из которых содержит 20×20 диафрагм в общей сложности 25 600 диафрагм20,21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chip Holders</td>
			<td>Custom Built</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chipless Chip Spacers</td>
			<td>SWISCII</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geobrick LV-IMS-II</td>
			<td>Delta Tau</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A&#160;multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mounts</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td>Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNF Laboport Vacuum Pump</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z262285-1EA</td>
			<td>Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 6 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15360562</td>
			<td>300 ft roll of 6 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar Sheets 3 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-675-4</td>
			<td>300 ft roll of 3 &#181;m thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>91000</td>
			<td>A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Chips</td>
			<td>University of Southampton</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stages</td>
			<td>Smaract</td>
			<td>N/A</td>
			<td>XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1byOne Humidifier (701UK-0003 )</td>
			<td>1byOne</td>
			<td>B01DENO0EQ</td>
			<td>Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixed target serial data collection at diamond light source

Последовательный сбор данных является относительно новым методом для пользователей синхротрона. Руководство пользователя по сбору фиксированных целевых данных в I24, Diamond Light Source представлено с подробными пошаговыми инструкциями, рисунками и видео для плавного сбора данных.

Watch this Scientific Journal Video about Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source at JoVE.com

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Мы представляем исчерпывающее руководство по подготовке образцов с фиксированной целью, сбору данных и обработке данных для последовательной синхротронной кристаллографии на diamond beamline I24.

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Последовательная синхротронная кристаллография, или SSX, является относительно новой и быстро развивающейся областью MX.Она очень хорошо подходит для экспериментов с низкой дозой и комнатной температурой, но, возможно, самое главное, она действительно хорошо подходит для следования динамике. Это позволяет снимать стоп-моушн фильмы о белках в действии. В I24 доступно несколько режимов SSX.Этот протокол фокусируется на SSX с фиксированной целью, что позволяет проводить широкий спектр последовательных экспериментов с использованием ограниченного количества образца. Кремниевые чипы могут быть повреждены при загрузке и очистке, если вы с ними не знакомы. Кроме того, протокол выравнивания чипа является совершенно новым для многих кристаллографов, а обработка данных немного отличается от ваших стандартных данных о вращении.Чтобы подготовить держатель для чипов, разрежьте два листа полиэфирной фольги примерно на квадраты размером 6 на 6 сантиметров и поместите листы поверх двух опорных пластин. Используя металлические уплотнительные кольца, закрепите листы на месте, затем осторожно потяните за лишнюю фольгу, чтобы удалить любые складки. Затем выберите кремниевый чип с соответствующими размерами отверстий относительно размера анализируемых кристаллов.Тлеющий разряд чипа в течение 25 секунд при 0,39 миллибар, с током 15 миллиампер. Используйте пинцет, чтобы поместить кремниевый чип на ступень загрузки чипа, с поднятыми стержнями, обращенными вниз. Затем, используя пипетку, нанесите 200 микролитров микрокристаллического суспензии на плоскую сторону чипа, распределив суспензию, чтобы покрыть все городские кварталы чипа.Если чип поврежден, закройте любые отверстия небольшим кусочком полиэфирной фольги, чтобы обеспечить равномерное применение вакуума. Затем примените мягкий вакуум, чтобы аспирировать всю лишнюю жидкость через чип. Извлеките чип из стадии загрузки чипа и тщательно промойте нижнюю часть чипа фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю жидкость.Поместите загруженный чип на большую половину держателя чипа между направляющими метками, плоской стороной вниз. Поместите маленькую половину держателя чипа на чип, чтобы запечатать его. Две половинки держателя чипа должны защелкнуться на месте.Затем, используя шестигранные болты, надежно закрепите чип на месте. Чтобы выровнять чип, удерживайте держатель чипа под углом 30 градусов при приближении к креплению. Затем используйте кинематические крепления, чтобы поместить загруженный чип на ступень XYZ на линии луча.Когда магниты соприкоснутся, позвольте держателю чипа вращаться параллельно потоку и нажмите на место. После того, как чип размещен, используйте систему просмотра линии луча по оси и графический пользовательский интерфейс выравнивания чипа, чтобы найти верхнюю левую фидуциаль чипа. Чтобы сосредоточиться на фидуциальном 0 в X, Y и Z, перемещайтесь внутрь и вне фокуса, чтобы выровнять Z, вверх и вниз, чтобы выровнять Y, а также влево и вправо, чтобы выровнять X.Затем нажмите установить Fiducial 0"После выравнивания фидуциального 1 и 2 с рентгеновским лучом таким же образом нажмите кнопку Создать систему координат", чтобы создать матрицу координат.Затем нажмите «Проверка блока», чтобы переместить стадию XYZ в первую колодцу каждого городского квартала. Если рентгеновское перекрестие совпадает с диафрагмами, чип выравнивается. В этом графическом представлении результатов поиска пятен с помощью DIALS можно наблюдать график обновления скорости попадания.При нажатии на удар соответствующее дифракционное изображение будет отображаться в средстве просмотра изображений DIALS. В этой таблице можно визуализировать текущие показатели индексации и интеграции, которые обновляются в режиме реального времени по мере сбора данных во время посещения. Визуализация параметров ячейки блока позволяет выявить полиморфы.Двумерные графики полезных параметров также могут быть получены для выявления изменений, которые возникают из-за эффектов нагрузки или обезвоживания. Стереографические проекции могут выявить наличие или отсутствие предпочтительных ориентаций, которые могут быть возвращены в протокол загрузки. Например, в этой проекции можно наблюдать эффекты перегрузки чипа кристаллами лизоцима.При загрузке чипа медленно используйте палец, чтобы положить пипетку над чипом. Это предотвращает прикосновение к чипу и случайное пронзание отверстий в кремнии. При обработке данных используйте доступные автоматизированные конвейеры.Это даст вам хорошее представление о том, как продвигается ваш эксперимент, и нужно ли вам что-то варьировать. Этот метод может быть применен к любой белковой системе, которая может кристаллизоваться в значительных количествах. И реакция может быть спровоцирована легкими рентгеновскими лучами или быстрым перемешиванием.Динамические исследования ряда структур могут дать представление о том, как функционируют белки.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Оптимизация роста кристаллов эндотиапепсина для серийных кристаллографических экспериментов

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Протокол подготовки и передачи образцов для внутривакуумной длинноволновой кристаллографии на лучевой линии I23 на алмазном источнике света

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...