Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر هين على المساعدة والمشورة المفاهيمية في إنجاز هذه الدراسة. W.M.H. مدعوم بأموال من مؤسسة ويلش (I-1873)، وNIGMS المعاهد القومية للصحة (GM119768)، وصندوق البحوث الطبية آرا Paresghian، وبرنامج العلماء الموهوبين جنوب غرب UT. تم دعم S.R بمنحة برنامج T32 (5T32GM008297).

1. نمو ووضع العلامات على خلايا الخميرة مع 14حمض الخليك C
<ol><li>تلقيح ثقافة الخميرة عن طريق اختيار مستعمرة من لوحة والاستغناء عنها في 20 مل من الوسائط الاصطناعية كاملة (SC) التي تحتوي على 2٪ dextrose (انظر الملف التكميلي لوصفة وسائل الإعلام SC). احتضان عند 30 درجة مئوية لليلة واحدة مع اهت?...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+biogenesis.">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li><li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets.">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+atherosclerosis:+A+perspective+for+the+1990s.">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li><li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet:+A+conserved+cellular+organelle.">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li><li>W&#228;ltermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes:+How+bacteria+fatten+up:+Lipid-body+formation+in+prokaryotes.">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li><li>Borrull, A., L&#243;pez-Mart&#237;nez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Roz&#232;s, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li><li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

هنا، يتم تقديم بروتوكول تسمية إشعاعية متعددة لمراقبة كميا توليف الأنواع NL في الخميرة. هذا البروتوكول هو وحدات جدا، والذي يسمح لهذا الإجراء أن ينتهي في غضون 3-6 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، توجد ثروة من الأدب على استخدام TLC لفصل أنواع الدهون والأيض ، والتي يجب أن تسمح للمستخدم بالكشف عن العديد من ...

أسيتيل-CoA هو لبنة أساسية من الجزيئات الحيوية المتنوعة بما في ذلك الدهون المحايدة (NLs)، والتي هي بمثابة عملة الجزيئية الحيوية تنوعا لبناء الأغشية، وتوليد ATP، وتنظيم الإشارات الخلية1،2. وينظم تخزينها جزئيا توافر ال NLs لتحويلها إلى أي من هذه المسارات المعنية. قطرات الدهون (LDs)، العضيات السيتوبلازمية تتكون من النوى الكارهة للماء من الدهون الثلاثية (TGs) واستر الستيرول (SEs)، هي مقصورات التخزين الرئيسية لمعظم NLs الخلوية. على هذا النحو، LDs عزل وتنظيم NLs، والتي يمكن أن تتحلل وتستخدم في وقت لاحق للعمليات الكيميائية الحيوية والتمثيل الغذائي3،4. ومن المعروف أن سوء تنظيم NL والبروتينات المرتبطة LD يرتبط مع بداية الأمراض بما في ذلك ضمور الدهون ومتلازمات التمثيل الغذائي5،6. وبسبب هذا، تركز أبحاث LD الحالية بشكل مكثف على كيفية تنظيم توليف NL مكانيا وزمانيا وعبر أنسجة متميزة من الكائنات الحية متعددة الخلايا. نظرا للأدوار الخلوية في كل مكان لNLs، يتم الحفاظ على العديد من الإنزيمات المسؤولة عن توليف وتنظيم NLs في جميع أنحاء eukaryotes7. في الواقع ، حتى بعض prokaryotes مخزن NLs في LDs8. لذلك ، كانت الكائنات الحية النموذجية القابلة للسحب وراثيا مثل Saccharomyces cerevisiae (الخميرة الناشئة) مفيدة لدراسة توليف NL وتنظيمها.
يمكن فصل وتكميم NLs من مستخلصات الخلايا بطرق لا تعد ولا تحصى ، بما في ذلك قياس الطيف اللوني الكتلي للغاز (GC-MS) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، وقياس الطيف الكتلي السائل فائق الأداء (UPLC-MS)9و10و11. ولعل أبسط طريقة لفصل NLs هو عن طريق طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا (TLC)، والذي يسمح للقياس الكمي الكثافة اللاحقة من منحنى قياسي12،13. على الرغم من أن TLC يوفر فقط فصل مسار الحبيبات من NLs، فإنه لا يزال تقنية قوية لأنها غير مكلفة، وأنه يسمح لفصل سريع من NLs من عدة عينات في وقت واحد. اثنين من أكبر التحديات التي تواجه دراسة NLs عبر TLC هي: 1) مجموعة واسعة من وفرة الخلوية من الأنواع NL وسيطة لها، و 2) مجموعة من الميل المائي / hydrophobicity من وسيطة الدهون داخل مسارات توليف NL. وبالتالي، فإن التحديد الكمي لأنواع الأنواع من الكائنات البرية عبر TLC يقتصر عادة على أكثر الأنواع وفرة؛ ومع ذلك، يمكن إدخال 14C-خليك حمض شعري يعزز بشكل كبير الكشف عن وسيطة وفرة منخفضة داخل مسارات NL. يتم تحويل حمض الخليك بسرعة إلى أسيتيل-CoA بواسطة أسيتيل-CoA synthetase ACS214، مما يجعل 14حمض C-الخليك ركيزة مناسبة للتكبيل الإشعاعي في الخميرة15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق فصل كل من NLs الكارهة للماء والوسيطة المائية من NLs من قبل TLC من خلال استخدام أنظمة المذيبات المتعددة16. هنا، يتم تقديم طريقة لفصل NLs باستخدام 14C-ace حمض التمثيل الغذائي وضع العلامات في الخميرة. يتم عزل الدهون المسماة خلال فترة النبض في وقت لاحق من خلال بروتوكول عزل الدهون الكلي الراسخ17، يليه فصل أنواع NL بواسطة TLC. تطوير لوحات TLC من قبل كل من التصوير الشعاعي التلقائي لتصور الدهون المسماة ، ورذاذ كيميائي لتصور مجموع الدهون ، ويسمح لطرق متعددة للقياس الكمي. يمكن أيضا استخراج أشرطة الدهون الفردية بسهولة من لوحة TLC باستخدام شفرة حلاقة ، ويمكن استخدام عد التلألؤ لتحديد كمية المواد التي تحمل علامة إشعاعية داخل النطاق.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

الدهون المحايدة (NLs) هي فئة من الجزيئات الحيوية الكارهة للماء والتهم التي تلعب أدوارا رئيسية في الطاقة وداء الدهون. يتم توليفها NLs دي نوفو من أسيتيل-CoA ومتواجدة في المقام الأول في eukaryotes في شكل الدهون الثلاثية (TGs) وستيرول-استر (SEs). يتم الحفاظ على الإنزيمات المسؤولة عن تركيب NLs للغاية من Saccharomyces cerevisiae (الخميرة) للبشر ، مما يجعل الخميرة كائنا نموذجيا مفيدا لتشريح وظيفة وتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL. في حين يعرف الكثير عن كيفية تحويل أسيتيل-CoA إلى مجموعة متنوعة من أنواع NL، لا يزال يتم اكتشاف آليات لتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL، وكيف يمكن أن يسهم سوء التنظيم في الأمراض الخلوية. وقد تم تطوير العديد من الطرق لعزل وتوصيف أنواع الأنواع NL واستخدامها على مدى عقود من البحث؛ ومع ذلك، لم يناقش بروتوكول كمي وبسيط لتوصيف شامل لأنواع الكائنات الرئيسية في النواة. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة وقابلة للتكيف لتحديد تركيب دي نوفو من الأنواع الرئيسية NL في الخميرة. نحن نطبق 14C-ace حمض الوسم الأيضي إلى جانب طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا لفصل وقياس مجموعة متنوعة من NLs الهامة من الناحية الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة لدراسة في معدلات رد فعل الجسم الحي من الإنزيمات NL أو تدهور الأنواع NL مع مرور الوقت.

في هذا البروتوكول، أثبتنا أن وضع العلامات والكشف والتحديد الكمي لأنواع NL يمكن تحقيقه من خلال وضع علامات أيضية لحامضC-acetic. يمكن فصل الأنواع الرئيسية NL في نظام المذيبات من 50:40:10:1 (v/v/v/v٪) هيكسان:الأثير البترولي:ديثيل الأثير:حمض الخليك (الشكل 1A, B). التصوير الفوسفو?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

هنا، يتم تقديم بروتوكول لتسمية الأيض من الخميرة مع 14حمض الخليك C، الذي يقترن كروماتوغرافيا طبقة رقيقة لفصل الدهون محايدة.

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

وتستخدم هذه التقنية أدوات توجد عادة في معظم البيئات المختبرية وتسمح بتحليل عدة عينات في وقت واحد. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى رئيسية حول كيفية تنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي للدهون في السياق الخلوي وفي خلفيات وراثية مختلفة. تلقيح مستعمرة من لوحة ثقافة الخميرة إلى 20 ملليلتر من وسائل الإعلام SC تحتوي على 2٪ dextrose واحتضان في 30 درجة مئوية لليلة واحدة مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.في اليوم التالي، تمييع الثقافة في 50 ملليلتر من وسائل الإعلام الطازجة إلى OD النهائي من 0.2 وتنمو لمدة 24 ساعة حتى يتم التوصل إلى مرحلة ثابتة. إعداد اثنين من aliquots 20 ملليلتر من إخماد العازلة لكل عينة وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. في وقت واحد، وإعداد وسائل الإعلام ال تسمية إشعاعية عن طريق إضافة ملح الصوديوم حمض الخليك إلى وسائط SC dextrose الحرة بتركيز نهائي قدره 10 ميكروكوري لكل ملليلتر.جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4، 100 × ز لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant وغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 20 ملليلتر من وسائط SC dextrose الحرة. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4، 100 × ز لمدة خمس دقائق ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي ميكرولتر اثنين المسمى باستخدام وسائل الإعلام الحرة dextrous.طرد الخلايا لمدة دقيقتين أخريين. إعادة تشغيل الخلايا في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام SC dextrose الحرة وتبدأ فترة التسمية الإشعاعية عن طريق إضافة بسرعة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام التسمية الإشعاعية إلى كل تعليق الخلية. احتضان الأنابيب في حاضنة دوارة في 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.وفي الوقت نفسه، قبل تبريد الطرد المركزي مجهزة لأنابيب مخروطية 50 ملليلتر إلى ناقص 10 درجة مئوية وذوبان واحد 20 ملليلتر aliquots من إخماد العازلة. بمجرد انتهاء فترة التسمية الإشعاعية استخدام ماصة لإغراق عينة ملليلتر واحد بأكمله في مخزن مؤقت لإرواء مذاب على الجليد. جمع بيليه الخلية عن طريق الغزل في جهاز طرد مركزي المبردة مسبقا في 5, 000 × ز لمدة ثلاث دقائق وإضافة 20 ملليلتر من العازلة التبريد التبريد الطازج.دوامة ويهز العينات لإعادة إنفاقها بالكامل في إخماد العازلة والطرد المركزي العينات مرة أخرى لجمع الخلايا. مرة واحدة هي بيليه الخلايا، وإزالة تماما كل عازلة التبريد من العينات عن طريق صب قبالة supernatant وإزالة الزائدة مع ماصة. تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة.تزن 0.3 غرام من حبات الزجاج الحمضي غسلها لكل عينة وتخزينها في اثنين من أنابيب الطرد المركزي ميكرولتر على الجليد. إزالة الكريات الخلية من الفريزر ناقص 80 درجة ووضعها على الجليد. ثم أضف 350 ميكرولتر من الميثانول و700 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة وإعادة إنفاق الخلايا.نقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على حبات زجاجية وزنها مسبقا. ليس الخلايا عن طريق الدوامة ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة، مع حضانة 30 ثانية على الجليد بين التحريضات. صب الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الزجاج 15 ملليلتر وتسمية أنبوب A.Wash أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع ملليلتر واحد من الميثانول، دوامة ذلك، وصب الميثانول في أنبوب A.Add اثنين من ملليلتر من الكلوروفورم تليها 400 ميكرولتر من الماء إلى أنبوب A لحجم عينة النهائي من 4.45 ملليلتر.دوامة العينات لمدة دقيقة واحدة تليها جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في 1000 × ز لفصل واضح بين المراحل المائية والعضوية مع حطام الخلية ملقاة على واجهة. باستخدام ماصة مرعى زجاجي، اجمع المرحلة العضوية في أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد يحمل علامة B وأضف ملليلتر واحد من كلوريد البوتاسيوم المولاري. إضافة ملليلتر واحد من الميثانول واثنين من ملليلتر من الكلوروفورم إلى أنبوب A وتكرار دوامة وخطوات الطرد المركزي.دوامة والطرد المركزي أنبوب B لفصل المرحلة المائية والعضوية. إزالة الطبقة المائية العليا وجمع الطبقة العضوية أسفل كامل في قارورة زجاجية أربعة ملليلتر. تتبخر تماما المذيبات من مقتطفات الدهون عن طريق التجفيف تحت الغاز الخامل وتسخين الفرن إلى 145 درجة مئوية لتسخين لوحة TLC.تحديد الكميات النسبية من الخلايا التي تناولتها قبل تحميلها على لوحة TLC. إعادة تشكيل عينة الدهون في 40 إلى 50 ميكرولتر من الكلوروفورم والميثانول مختلطة بنسبة واحد إلى واحد عن طريق الدوامة لمدة خمس دقائق. إعداد 101 ملليلتر من المذيب المرحلة المتنقلة في اسطوانة تخرج الزجاج.ثم، صب المذيبات في غرفة TLC الزجاج تحتوي على 20 في 20 TLC وسادة التشبع وغطاء ضيق المناسب. إعداد توجيه 20 من قبل 20 هلام السيليكا 60G لوحة ووضع علامة على خط 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة باستخدام قلم رصاص. مرة واحدة وقد تم تسخين لوحة بما فيه الكفاية وتشبع لوحة التشبع TLC مع المذيبات، وإزالة لوحة TLC من الفرن والمضي قدما على الفور لتحميله.باستخدام ماصة، بقعة خمسة ميكرولترات من العينة على أصل كل حارة تقع 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة TLC وتكرار التحميل حتى 20 إلى 40 ميكرولتر من العينة قد تم تحميلها في كل حارة. مرة واحدة وقد تم تحميل معيار والعينات، ووضع لوحة في غرفة النامية والانتظار حتى المذيبات قد وصلت إلى الجزء العلوي من لوحة. عندما يتم تطوير اللوحة بالكامل، قم بإزالتها من الغرفة واتركها تجف في غطاء الدخان لمدة 20 دقيقة.بعد تجفيف اللوحة، قم بتغطيتها بفيلم بلاستيكي ووضعها في كاسيت متطور بشاشة تصوير تلقائي. قم بإزالة الشاشة من شريط كاسيت النامية ووضعها داخل صور الفوسفور. رش لوحة TLC مع ع-Anisaldehyde كاشف حتى تشبع السيليكا، ثم خبز في فرن 145 درجة لمدة خمس دقائق أو حتى ظهرت العصابات.لقياس أنواع الدهون، كشط هلام السيليكا التي تحتوي على أنواع الدهون الفردية ونقلها إلى قارورة التلألؤ الزجاج. إضافة ستة ملليلتر من السائل التلألؤ ودوامة بقوة حتى تم تخفيض الفرقة السيليكا إلى قطع صغيرة. ضع الحامل مع قنينات التلألؤ في عداد التلألؤ وعد عن طريق ضبط وقت العد إلى دقيقتين لكل قارورة.التصوير الفوسفوري يسمح لتصور autoradiogram من الأحماض الدهنية الخالية من التسمية، triacylglycerol، diacylglycerol، والكوليسترول، والقذارة. وقد ثبت أن الأنواع الدهنية المنقى يمكن فصلها في هذه الطريقة وتصور في وقت لاحق عن طريق رش لوحة TLC مع كاشف ف-أنيسالدهيد. وتشمل الأنواع المرئية جميع الدهون المذكورة سابقا بالإضافة إلى استر العقيمة.من خلال تطبيق فترة مطاردة 10 دقيقة في وسائل الإعلام الخالية من البيل الإشعاعي بعد النبض ، لوحظ في المجموعة الرئيسية من القذارة اختفت وارتفع الكوليسترول الكلي. وبالمثل، فإن ظهور diacylglycerol في فترة مطاردة يرتبط مع انخفاض في إشارة الأحماض الدهنية الحرة. قبل تنفيذ البروتوكول الكامل، من المهم تحديد ما إذا كانت الخلايا سوف تمتص الخلايا من الخلايا الحمضية الخليكية في حالة النمو والخلفية الوراثية للاهتمام.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

قياس معدلات دوران البروتين في الخلايا المستزرعة الشائخة وغير المنقسمة مع وضع العلامات الأيضية وقياس الطيف الكتلي

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...