Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Henne lab for hjælp og konceptuel rådgivning i afslutningen af denne undersøgelse. W.M.H. støttes af midler fra Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund og UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R er blevet understøttet af et T32-programtilskud (5T32GM008297).

1. Vækst og mærkning af gærceller med 14C-eddikesyre
<ol><li>Pod en gærkultur ved at plukke en koloni fra en plade og dispensere den til 20 mL syntetisk komplet (SC) medier, der indeholder 2% dextrose (se supplerende fil til opskriften på SC medier). Inkuber ved 30 °C for natten over med omrystning ved 200 omdrejninger i minuttet. BEMÆRK: Væksttilstand, prøvevolumen og behandling vil variere afhængigt af lipid(er) af interesse. Før der udføres fuldstændige eksperimenter, bør...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+biogenesis.">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li><li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets.">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+atherosclerosis:+A+perspective+for+the+1990s.">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li><li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet:+A+conserved+cellular+organelle.">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li><li>W&#228;ltermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes:+How+bacteria+fatten+up:+Lipid-body+formation+in+prokaryotes.">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li><li>Borrull, A., L&#243;pez-Mart&#237;nez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Roz&#232;s, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li><li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

Her præsenteres en alsidig radiolabelingsprotokol til kvantitativ overvågning af syntesen af NL-arter i gær. Denne protokol er meget modulopbygget, hvilket gør det muligt at afslutte proceduren inden for 3-6 dage. Derudover findes der et væld af litteratur om brugen af TLC til at adskille lipidarter og metabolitter, som skulle gøre det muligt for brugeren at opdage flere lipidarter af interesse med en simpel ændring af TLC-opløsningsmiddelsystemer16,19. D...

Acetyle-CoA er den grundlæggende byggesten i forskellige biomolekyler, herunder neutrale lipider (NLs), der tjener som en alsidig biomolekylær valuta til opbygning af membraner, generering af ATP og regulering af cellesignalering1,2. Tilgængeligheden af NLs, der skal shunted i nogen af disse respektive veje er til dels reguleret af deres opbevaring. Lipiddråber (LD'er), cytoplasmiske organeller bestående af hydrofobe kerner af triglycerider (TGs) og sterolestere (SE'er) er de vigtigste opbevaringsrum i de fleste cellulære NLs. Som sådan, LDs sequester og regulere NLs, som kan nedbrydes og efterfølgende anvendes til biokemiske og metaboliske processer3,4. Det er kendt, at misreguleringen af NL og LD-associerede proteiner er korreleret med starten af patologier, herunder lipodystrofi og metaboliske syndromer5,6. På grund af dette, nuværende LD forskning er intenst fokuseret på, hvordan NL syntese er reguleret rumligt, tidsmæssigt, og på tværs af forskellige væv af multi-cellulære organismer. På grund af de allestedsnærværende cellulære roller for NLs bevares mange enzymer, der er ansvarlige for syntese og regulering af NLs, i hele eukaryoter7. Faktisk, selv nogle prokaryoter gemme NLs i LDs8. Derfor har genetisk tractable modelorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirende gær) været nyttige til undersøgelse af NL syntese og regulering.
Adskillelsen og kvantificeringen af NLs fra celleekstrakter kan opnås på et utal af måder, herunder gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), højtydende væskekromatografi (HPLC) og ultraperformet væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Måske er den enkleste metode til adskillelse af NLs via tyndlagskromatografi (TLC), som giver mulighed for efterfølgende densitometrisk kvantificering fra en standardkurve12,13. Selvom TLC kun giver en kursuskornet adskillelse af NLs, forbliver det en kraftfuld teknik, fordi den er billig, og den giver mulighed for hurtig adskillelse af NLs fra flere prøver samtidigt. To af de største udfordringer, som undersøgelsen af NLs via TLC står over for, er: 1) den brede vifte af cellulære overfloder af NL-arter og deres mellemprodukter og 2) rækken af hydrofilicitet/hydrofobitet af lipidmellemprodukter inden for NL-synteseveje. Derfor er kvantificeringen af NL-arter via TLC typisk begrænset til de mest udbredte arter; indførelse af et 14C-eddikesyreradiolabel kan imidlertid i væsentlig grad øge påvisningen af mellemprodukter med lav forekomst inden for NL-veje. Eddikesyre omdannes hurtigt til acetyls-coA af acetyl-CoA-synthetase ACS214, hvilket gør 14 C-eddikesyretil et egnet radiolabelingssubstrat i gær15. Derudover kan TLC opnå adskillelse af både hydrofobe NLs og hydrofile mellemprodukter af NLs ved hjælp af flere opløsningsmiddelsystemer16. Her præsenteres en metode til adskillelse af NLs ved hjælp af 14C-eddikesyre metabolisk mærkning i gær. Lipider mærket i løbet af pulsperioden isoleres efterfølgende af en veletableret total lipidisolationsprotokol17, efterfulgt af adskillelsen af NL-arter med TLC. Udvikling af TLC plader af både autoradiografi at visualisere mærket lipider, og en kemisk spray til at visualisere samlede lipider, giver mulighed for flere metoder til kvantificering. Individuelle lipidbånd kan også let udtrækkes fra TLC-pladen ved hjælp af et barberblad, og scintillationstælling kan bruges til at kvantificere mængden af radiolabeleret materiale i båndet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

Neutrale lipider (NLs) er en klasse af hydrofobe, afgiftsfri biomolekyler, der spiller nøgleroller i energi og lipidhomøostase. NLs syntetiseres de novo fra acetyl-CoA og er primært til stede i eukaryoter i form af triglycerider (TGs) og sterol-estere (SE). De enzymer, der er ansvarlige for syntesen af NLs er stærkt bevaret fra Saccharomyces cerevisiae (gær) til mennesker, hvilket gør gær en nyttig model organisme til at dissekere funktion og regulering af NL metabolisme enzymer. Mens meget er kendt om, hvordan acetyl-CoA omdannes til et mangfoldigt sæt af NL arter, mekanismer til regulering af NL metabolisme enzymer, og hvordan mis-regulering kan bidrage til cellulære patologier, er stadig ved at blive opdaget. Talrige metoder til isolering og karakterisering af NL arter er blevet udviklet og anvendt gennem årtiers forskning; der er imidlertid ikke blevet drøftet en kvantitativ og enkel protokol for en omfattende karakterisering af større NL-arter. Her præsenteres en enkel og fleksibel metode til at kvantificere de novosyntesen af større NL-arter i gær. Vi anvender 14C-eddikesyre metaboliske mærkning kombineret med tyndt lag kromatografi til at adskille og kvantificere en bred vifte af fysiologisk vigtige NLs. Derudover kan denne metode let anvendes til at studere in vivo reaktionshastigheder af NL enzymer eller nedbrydning af NL arter over tid.

I denne protokol har vi vist, at mærkning, påvisning og kvantificering af NL-arter kan opnås ved 14C-eddikesyre metabolisk mærkning. Større NL-arter kan adskilles i et opløsningsmiddelsystem på 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexin:Petroleum ether:Diethyl ether:Eddikesyre(figur 1A, B). Fosforbilleddannelse gør det muligt at visualiseringere fri fedtsyre (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) og squalen (SQ) (Figur 1A...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Her præsenteres en protokol for metabolisk mærkning af gær med 14C-eddikesyre, som er kombineret med tyndlagskromatografi til adskillelse af neutrale lipider.

Analyse af neutral lipidsyntese i Saccharomyces cerevisiae ved metabolisk mærkning og tyndt lag kromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Denne teknik bruger instrumenter, der almindeligvis findes i de fleste laboratoriemiljøer og giver mulighed for analyse af flere prøver samtidigt. Denne metode kan give vigtige indsigter i, hvordan lipidmetabolismenzymer reguleres i en cellulær kontekst og i forskellige genetiske baggrunde. Pod en koloni fra en gærkulturplade i 20 milliliter SC-medier, der indeholder 2%dextrose og inkuberes ved 30 grader Celsius for natten over med rysten ved 200 rpm.Den næste dag fortyndes kulturen i 50 milliliter friske medier til en endelig OD på 0,2 og vokser den i 24 timer, indtil den stationære fase er nået. Forbered to 20 milliliter aliquots af slukningsbuffer for hver prøve og opbevar dem ved minus 80 grader Celsius. Samtidig fremstilles radiomærkningsmedier ved at tilsætte eddikesyrenatriumsalt til dextrose frie SC-medier ved en endelig koncentration på 10 mikrocurie pr. milliliter.Opsamle cellerne ved centrifugering ved 4, 100 x g i 10 minutter. Fjern supernatanten, og vask cellepillen én gang med 20 milliliter dextrose-frie SC-medier. Opsamle cellerne igen ved centrifugering ved 4, 100 x g i fem minutter og overføre dem til en mærket to milliliter mikrocentrifuge rør ved hjælp af dextrous frie medier.Centrifuge cellerne i yderligere to minutter. Genbrug cellerne i 500 mikroliter af dextrose frie SC medier og begynde radiolabeling periode ved hurtigt at tilføje 500 mikroliter af radiolabeling medier til hver celle suspension. Inkubat rørene i en roterende inkubator ved 30 grader Celsius i 20 minutter.I mellemtiden forkøles centrifuge udstyret til 50 milliliter koniske rør til minus 10 grader Celsius og tø en 20 milliliter aliquots af slukning buffer. Når radiolabelingsperioden er afsluttet, skal du bruge en pipette til at kaste hele prøven på en milliliter i optøet slukningsbuffer på is. Opsamles cellepillen ved at dreje i en forkølet centrifuge ved 5.000 x g i tre minutter og tilsæt 20 milliliter frisk koldslukningsbuffer.Vortex og ryst prøverne til fuldt ud at genbruge dem i slukning buffer og centrifuge prøverne igen for at indsamle cellerne. Når cellerne er pelleted, grundigt fjerne alle slukning buffer fra prøverne ved at hælde ud supernatant og fjerne det overskydende med en pipette. Opbevar rørene ved minus 80 grader Celsius til videre behandling.Der afvejes 0,3 gram syrevaskede glasperler til hver prøve, og de opbevares i to milliliter mikrocentrifugerør på is. Fjern cellepillerne fra minus 80 graders fryser og læg dem på is. Derefter tilsættes 350 mikroliter methanol og 700 mikroliter kloroform til hver prøve og genbruges cellerne.De overføres til mikrocentrifugerør, der indeholder for vejede glasperler. Lys cellerne ved at hvirvle tre gange i et minut, med 30 sekunders inkubation på is mellem agitationer. Hæld cellerne i en 15 milliliter glas centrifuge rør og mærke røret som rør A.Wash mikrocentrifuge røret med en milliliter methanol, vortex det, og hæld methanol i rør A.Add to milliliter chloroform efterfulgt af 400 mikroliter vand til rør A for en endelig prøve volumen på 4,45 milliliter.Vortex prøverne i et minut efterfulgt af en fem minutter centrifugering på 1000 x g for klart at adskille vandige og organiske faser med cellerester liggende på grænsefladen. Ved hjælp af en glasgræsningspipette opsamles den organiske fase i et nyt glascentrifugerør mærket B og tilsæt en milliliter af en molar kaliumchlorid. Der tilsættes en milliliter methanol og to milliliter kloroform til rør A, og hvirvel- og centrifugeringstrinnene gentages.Vortex og centrifuge rør B for at adskille den vandige og organiske fase. Fjern det øverste vandige lag og opsaml hele det nederste organiske lag i et fire milliliter glasglas. Fordamp opløsningsmidlet helt fra lipidekstrakterne ved at tørre under inert gas og forvarme en ovn til 145 grader Celsius til opvarmning af TLC-pladen.Bestem de relative mængder radiolabel, som cellerne har taget op, før de indlæses på TLC-pladen. Prøvelæbene i 40 til 50 mikroliter af chloroform og methanol, der blandes i et en-til-en-forhold ved hvirvelstrømning i fem minutter. Forbered 101 milliliter af det mobile faseopløsningsmiddel i en glas gradueret cylinder.Hæld derefter opløsningsmidlet i et glas TLC-kammer, der indeholder en 20 med 20 TLC mætningspude og et tætsluttende låg. Forbered en kanaliseret 20 af 20 silica gel 60G plade og markere en linje 1,5 centimeter over bunden af pladen ved hjælp af en blyant. Når pladen er tilstrækkeligt opvarmet, og TLC-mætningspuden er mættet med opløsningsmiddel, skal du fjerne TLC-pladen fra ovnen og straks fortsætte med at indlæse den.Ved hjælp af en pipette kan du få øje på fem mikroliter prøve på oprindelsen af hver vognbane, der er placeret 1,5 centimeter over bunden af TLC-pladen, og gentage belastningen, indtil 20 til 40 mikroliter prøve er blevet indlæst i hver vognbane. Når standarden og prøverne er indlæst, skal pladen placeres i udviklingskammeret og ventes, indtil opløsningsmidlet er nået til toppen af pladen. Når pladen er fuldt udviklet, skal du fjerne den fra kammeret og lade den tørre i røghætten i 20 minutter.Når pladen er tørret, skal du dække den med plastfolie og placere den i en kassette under udvikling med en autoradiografiskærm. Fjern skærmen fra den udviklende kassette og læg den inde i en fosfor billedgiver. Sprøjt TLC-pladen med p-Anisaldehydreagens, indtil silica er mættet, og bag den derefter i en 145 graders ovn i fem minutter, eller indtil der er dukket bånd op.For at kvantificere lipidarter skal du skrabe silicagelen, der indeholder individuelle lipidarter, og overføre dem til glasscintillationsglas. Tilsæt seks milliliter scintillation væske og vortex kraftigt, indtil silicabåndet er blevet reduceret til små stykker. Placer stativet med scintillationsglassene i en scintillationstæller, og tæl ved at justere optællingstiden til to minutter pr. hætteglas.Fosforbilleddannelse giver mulighed for visualisering af autoradiogram af etiketfri fedtsyre, triacylglycerol, diacylglycerol, kolesterol og squalane. Det blev påvist, at rensede lipidarter kan adskilles ved denne metode og efterfølgende visualiseres ved sprøjtning af TLC-pladen med p-Anisaldehydreagens. Visualiserede arter omfatter alle tidligere nævnte lipider ud over sterile estere.Ved at anvende en 10 minutters chase periode i radiolabel-fri medier efter pulsen, blev det observeret på den store pulje af squalane forsvandt og total kolesterol blev forhøjet. På samme måde korrelerede udseendet af diacylglycerol i jagtperioden med et fald i det frie fedtsyresignal. Før du udfører den fulde protokol, er det vigtigt at afgøre, om cellerne vil optage eddikesyreradiolabel i væksttilstanden og den genetiske baggrund af interesse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Udnyttelse af grafix til påvisning af forbigående interactorer af saccharomyces cerevisiae splejsning splejsstoffer

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mærkning og visualisering af mitokondriegenomudtryksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af Saccharomyces cerevisiae til Kryo-Elektron Tomografi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Vurdering af indsendeokondrial protein lokalisering i spirende gær saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Måling af proteinomsætningshastigheder i senescerende og ikke-delende dyrkede celler med metabolisk mærkning og massespektrometri

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...