Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

De auteurs willen de leden van het Henne lab bedanken voor hulp en conceptueel advies bij de afronding van dit onderzoek. W.M.H. wordt ondersteund door fondsen van de Welch Foundation (I-1873), het NIH NIGMS (GM119768), het Ara Paresghian Medical Research Fund en het UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R. is ondersteund door een T32-programmasubsidie (5T32GM008297).

1. Groei en etikettering van gistcellen met 14C-azijnzuur
<ol><li>Ent een gistcultuur in door een kolonie uit een bord te plukken en deze te doseren in 20 ml synthetische complete (SC) media die 2% dextrose bevatten (zie Aanvullend bestand voor het recept van SC-media). Incubeer bij 30 °C voor een nacht met schudden bij 200 tpm. OPMERKING: Groeiconditie, monstervolume en behandeling zullen verschillen op basis van de lipide(en) van belang. Voorafgaand aan volledige experimenten moeten op...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+biogenesis.">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li><li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets.">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+atherosclerosis:+A+perspective+for+the+1990s.">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li><li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet:+A+conserved+cellular+organelle.">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li><li>W&#228;ltermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes:+How+bacteria+fatten+up:+Lipid-body+formation+in+prokaryotes.">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li><li>Borrull, A., L&#243;pez-Mart&#237;nez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Roz&#232;s, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li><li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

Hier wordt een veelzijdig radiolabeling protocol gepresenteerd om de synthese van NL soorten in gist kwantitatief te monitoren. Dit protocol is zeer modulair, waardoor de procedure binnen 3-6 dagen kan worden voltooid. Bovendien bestaat er een schat aan literatuur over het gebruik van TLC om lipidesoorten en metabolieten te scheiden, waardoor de gebruiker verschillende soorten lipiden van belang zou moeten kunnen detecteren met een eenvoudige wijziging van TLC-oplosmiddelsystemen16,<sup...

Acetyl-CoA is de fundamentele bouwsteen van diverse biomoleculen, waaronder neutrale lipiden (NLs), die dienen als een veelzijdige biomoleculaire valuta voor het bouwen van membranen, het genereren van ATP en het reguleren van celsignalering1,2. De beschikbaarheid van NLs die in een van deze respectieve trajecten moeten worden gemeden, wordt gedeeltelijk gereguleerd door hun opslag. Lipidedruppels (LDs), cytoplasmatische organellen bestaande uit hydrofobe kernen van triglyceriden (TGs) en sterolesters (SE's), zijn de belangrijkste opslagcompartimenten van de meeste cellulaire NLs. Als zodanig, LDs sequester en reguleren NLs, die kunnen worden afgebroken en vervolgens worden gebruikt voor biochemische en metabolische processen3,4. Het is bekend dat de verkeerde regulatie van NL- en LD-geassocieerde eiwitten gecorreleerd is met het begin van pathologieën waaronder lipodystrofie en metabool syndromen5,6. Hierdoor is het huidige LD-onderzoek intensief gericht op hoe NL-synthese ruimtelijk, tijdelijk en over verschillende weefsels van multicellulaire organismen wordt gereguleerd. Vanwege de alomtegenwoordige cellulaire rollen voor NLs, worden veel enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese en regulering van NLs bewaard in eukaryoten7. Inderdaad, zelfs sommige prokaryoten slaan NLs op in LDs8. Daarom zijn genetisch trekbare modelorganismen zoals Saccharomyces cerevisiae (ontluikende gist) nuttig geweest voor de studie van NL-synthese en -regulatie.
De scheiding en kwantificering van NLs uit celextracten kan op talloze manieren worden bereikt, waaronder gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS)9,10,11. Misschien is de eenvoudigste methode voor het scheiden van NLs via dunnelaagchromatografie (TLC), die latere densitometrische kwantificering mogelijk maakt van een standaardcurve12,13. Hoewel TLC slechts een koerskorrelige scheiding van NLs biedt, blijft het een krachtige techniek omdat het goedkoop is en het zorgt voor een snelle scheiding van NLs van meerdere monsters tegelijkertijd. Twee van de belangrijkste uitdagingen voor de studie van NLs via TLC zijn: 1) het brede scala aan cellulaire overvloed aan NL-soorten en hun tussenproducten, en 2) het bereik van hydrofielheid/hydrofobiciteit van lipide-tussenproducten binnen NL-syntheseroutes. Bijgevolg is de kwantificering van NL-soorten via TLC doorgaans beperkt tot de meest voorkomende soorten; de introductie van een 14C-azijnzuur radiolabel kan echter de detectie van tussenproducten met een lage overvloed binnen NL-trajecten aanzienlijk verbeteren. Azijnzuur wordt snel omgezet in acetyl-CoA door de acetyl-CoA synthetase ACS214, waardoor 14C-azijnzuur een geschikt radiolabeling substraat in gist15. Bovendien kan TLC zowel hydrofobe NLs als hydrofiele tussenproducten van NLs scheiden door het gebruik van meerdere oplosmiddelsystemen16. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de scheiding van NLs met behulp van 14C-azijnzuur metabolische etikettering in gist. Lipiden die tijdens de pulsperiode worden geëtiketteerd, worden vervolgens geïsoleerd door een goed vastgesteld totaal lipidenisolatieprotocol17, gevolgd door de scheiding van NL-soorten door TLC. Het ontwikkelen van TLC-platen door zowel autoradiografie om gelabelde lipiden te visualiseren, als een chemische spray om totale lipiden te visualiseren, maakt meerdere kwantificeringsmethoden mogelijk. Individuele lipidenbanden kunnen ook gemakkelijk uit de TLC-plaat worden gehaald met behulp van een scheermesje en scintillatietelling kan worden gebruikt om de hoeveelheid radioactief gelabeld materiaal in de band te kwantificeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

Neutrale lipiden (NLs) zijn een klasse van hydrofobe, chargeless biomoleculen die een sleutelrol spelen in energie en lipide homeostase. NLs worden gesynthetiseerd de novo van acetyl-CoA en zijn voornamelijk aanwezig in eukaryoten in de vorm van triglyceriden (TGs) en sterol-esters (SEs). De enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van NLs zijn sterk geconserveerd van Saccharomyces cerevisiae (gist) op de mens, waardoor gist een nuttig modelorganisme is om de functie en regulering van NL-metabolismeenzymen te ontleden. Hoewel er veel bekend is over hoe acetyl-CoA wordt omgezet in een diverse set NL-soorten, worden er nog steeds mechanismen ontdekt voor het reguleren van NL-metabolismeenzymen en hoe verkeerde regulatie kan bijdragen aan cellulaire pathologieën. Gedurende tientallen jaren van onderzoek zijn tal van methoden voor de isolatie en karakterisering van NL-soorten ontwikkeld en gebruikt; een kwantitatief en eenvoudig protocol voor de alomvattende karakterisering van grote NL-soorten is echter niet besproken. Hier wordt een eenvoudige en aanpasbare methode gepresenteerd om de de novo synthese van belangrijke NL-soorten in gist te kwantificeren. We passen 14C-azijnzuur metabolische etikettering in combinatie met dunne laagchromatografie toe om een divers scala aan fysiologisch belangrijke NLs te scheiden en te kwantificeren. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast om in vivo reactiesnelheden van NL-enzymen of afbraak van NL-soorten in de loop van de tijd te bestuderen.

In dit protocol hebben we aangetoond dat het labelen, detecteren en kwantificeren van NL-soorten kan worden bereikt door 14C-azijnzuur metabolische etikettering. Grote NL-soorten kunnen worden gescheiden in een oplosmiddelsysteem van 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexaan:Petroleumether:Diethylether:Azijnzuur (Figuur 1A,B). Fosforbeeldvorming maakt visualisatie mogelijk van gelabeld vrij vetzuur (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), cholesterol (Chol) en squalee...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Deze techniek maakt gebruik van instrumenten die vaak in de meeste laboratoriumomgevingen worden aangetroffen en maakt het mogelijk om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren. Deze methode kan belangrijke inzichten bieden in hoe lipidenmetabolisme enzymen worden gereguleerd in een cellulaire context en in verschillende genetische achtergronden. Ent een kolonie van een gistkweekplaat in 20 milliliter SC-media met 2% dextrose en incubeer bij 30 graden Celsius voor een nacht met schudden bij 200 tpm.Verdun de volgende dag de cultuur in 50 milliliter verse media tot een laatste OD van 0,2 en laat het 24 uur groeien totdat de stationaire fase is bereikt. Bereid twee 20 milliliter aliquots blusbuffer voor elk monster en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Bereid tegelijkertijd radiolabelmedia voor door azijnzuurnatriumzout toe te voegen aan dextrosevrije SC-media in een uiteindelijke concentratie van 10 microcurie per milliliter.Verzamel de cellen door gedurende 10 minuten op 4, 100 x g te centrifugeren. Verwijder het supernatant en was de celkorrel eenmaal met 20 milliliter dextrosevrije SC-media. Verzamel de cellen opnieuw door gedurende vijf minuten op 4, 100 x g te centrifugeren en breng ze over op een gelabelde microcentrifugebuis van twee milliliter met behulp van dextrous vrije media.Centrifugeer de cellen nog twee minuten. Resuspendeer de cellen in 500 microliters dextrosevrije SC-media en begin de radiolabelperiode door snel 500 microliters radiolabelingmedia toe te voegen aan elke celsuspensie. Incubeer de buizen gedurende 20 minuten in een roterende incubator op 30 graden Celsius.Koel ondertussen de centrifuge uitgerust voor 50 milliliter conische buizen tot min 10 graden Celsius en ontdooi een 20 milliliter aliquots blusbuffer. Zodra de radiolabelperiode is afgelopen, gebruikt u een pipet om het hele monster van één milliliter in ontdooide blusbuffer op ijs te dompelen. Verzamel de celkorrel door gedurende drie minuten in een voorgekoelde centrifuge op 5.000 x g te draaien en voeg 20 milliliter verse koude blusbuffer toe.Vortex en schud de monsters om ze volledig te resuspend in het doven van buffer en centrifugeer de monsters opnieuw om de cellen te verzamelen. Zodra de cellen zijn geplet, verwijdert u alle blusbuffer grondig uit de monsters door het supernatant af te gieten en het overtollige met een pipet te verwijderen. Bewaar de buizen op min 80 graden Celsius voor verdere verwerking.Weeg 0,3 gram zuur gewassen glazen kralen voor elk monster en bewaar ze in twee milliliter microcentrifugebuizen op ijs. Haal de celkorrels uit de min 80 graden vriezer en leg ze op ijs. Voeg vervolgens 350 microliter methanol en 700 microliter chloroform toe aan elk monster en geef de cellen opnieuw op.Breng ze over in microcentrifugebuizen met voorgewogen glasparels. Lyse de cellen door driemaal gedurende één minuut te vortexen, met 30 seconden incubatie op ijs tussen agitaties. Giet de cellen in een glazen centrifugebuis van 15 milliliter en label de buis als buis A.Was de microcentrifugebuis met één milliliter methanol, draai deze om en giet de methanol in buis A.Voeg twee milliliter chloroform toe gevolgd door 400 microliter water aan buis A voor een eindmonstervolume van 4,45 milliliter.Draai de monsters gedurende één minuut, gevolgd door een centrifugeren van vijf minuten bij 1000 x g om de waterige en organische fasen duidelijk te scheiden met celresten die op de interface liggen. Verzamel met behulp van een glazen weidepipet de organische fase in een nieuwe glazen centrifugebuis met het label B en voeg een milliliter van één molair kaliumchloride toe. Voeg een milliliter methanol en twee milliliter chloroform toe aan buis A en herhaal de vortex- en centrifugeerstappen.Vortex en centrifugebuis B om de waterige en organische fase te scheiden. Verwijder de bovenste waterige laag en verzamel de hele organische onderste laag in een glazen flacon van vier milliliter. Verdampt het oplosmiddel volledig uit de lipideextracten door te drogen onder inert gas en verwarm een oven voor op 145 graden Celsius voor het verwarmen van de TLC-plaat.Bepaal de relatieve hoeveelheden radiolabel die door de cellen worden opgenomen voordat u ze op de TLC-plaat laadt. Reconstitueren van de monsterlipiden in 40 tot 50 microliter chloroform en methanol gemengd in een één-op-één verhouding door vortexen gedurende vijf minuten. Bereid 101 milliliter van het mobiele fase-oplosmiddel in een glazen gegradueerde cilinder.Giet vervolgens het oplosmiddel in een glazen TLC-kamer met een 20 bij 20 TLC verzadigingskussen en een nauwsluitend deksel. Bereid een gekanaliseerde 20 bij 20 silicagel 60G plaat voor en markeer een lijn 1,5 centimeter boven de bodem van de plaat met een potlood. Zodra de plaat voldoende is verwarmd en het TLC-verzadigingskussen verzadigd is met oplosmiddel, verwijdert u de TLC-plaat uit de oven en gaat u onmiddellijk verder met het laden ervan.Plaats met behulp van een pipet vijf microliters monster op de oorsprong van elke rijstrook die zich 1,5 centimeter boven de bodem van de TLC-plaat bevindt en herhaal de belasting totdat in elke rijstrook 20 tot 40 microliter monster is geladen. Zodra de standaard en de monsters zijn geladen, plaatst u de plaat in de ontwikkelkamer en wacht u tot het oplosmiddel de bovenkant van de plaat heeft bereikt. Wanneer de plaat volledig is ontwikkeld, verwijdert u deze uit de kamer en laat u deze 20 minuten drogen in de zuurkast.Nadat de plaat is gedroogd, bedek je deze met plastic folie en plaats je deze in een ontwikkelende cassette met een autoradiografiescherm. Verwijder het scherm van de zich ontwikkelende cassette en plaats het in een fosforbeeld. Besproei de TLC-plaat met p-Anisaldehyde-reagens totdat het silica verzadigd is en bak het vervolgens vijf minuten in een oven van 145 graden of totdat er banden zijn verschenen.Om lipidesoorten te kwantificeren, schraapt u de silicagel die individuele lipidesoorten bevat en draagt u deze over naar glazen scintillatieflacons. Voeg zes milliliter scintillatievloeistof en vortex krachtig toe totdat de silicaband tot kleine stukjes is gereduceerd. Plaats het rek met de scintillatiefons in een scintillatieteller en tel door de teltijd aan te passen aan twee minuten per flacon.Fosfor beeldvorming maakt visualisatie van autoradiogram van label-vrij vetzuur, triacylglycerol, diacylglycerol, cholesterol en squalaan mogelijk. Er werd aangetoond dat gezuiverde lipidensoorten in deze methode kunnen worden gescheiden en vervolgens kunnen worden gevisualiseerd door de TLC-plaat te besproeien met p-Anisaldehydereagens. Gevisualiseerde soorten omvatten alle eerder genoemde lipiden naast steriele esters.Door het toepassen van een 10 minuten chase periode in radiolabel-vrije media na de pols, werd het waargenomen bij de grote pool van squalaan verdwenen en totale cholesterol werd verhoogd. Evenzo correleerde het verschijnen van diacylglycerol in de achtervolgingsperiode met een afname van het signaal van vrije vetzuren. Voorafgaand aan het uitvoeren van het volledige protocol, is het belangrijk om te bepalen of de cellen het azijnzuur radiolabel zullen opnemen in de groeiconditie en genetische achtergrond van belang.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...