Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Henne pour leur aide et leurs conseils conceptuels dans la réalisation de cette étude. W.M.H. est soutenu par des fonds de la Welch Foundation (I-1873), du NIH NIGMS (GM119768), du Ara Paresghian Medical Research Fund et du UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R a été soutenu par une subvention du programme T32 (5T32GM008297).

1. Croissance et étiquetage des cellules de levure avec de l’acide 14C-acétique
<ol><li>Inoculer une culture de levure en cueillant une colonie dans une assiette et en la distribuant dans 20 mL de milieux synthétiques complets (SC) contenant 2 % de dextrose (voir dossier supplémentaire pour la recette des milieux SC). Incuber à 30 °C pendant la nuit en agitant à 200 tr/min. REMARQUE: L’état de croissance, le volume de l’échantillon et le traitement diffèrent en fonction du...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. 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K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

Ici, un protocole de radiomarquage polyvalent pour surveiller quantitativement la synthèse des espèces NL dans la levure est présenté. Ce protocole est très modulaire, ce qui permet de terminer la procédure dans les 3-6 jours. De plus, il existe une abondante littérature sur l’utilisation de la TLC pour séparer les espèces lipidiques et les métabolites, ce qui devrait permettre à l’utilisateur de détecter plusieurs espèces lipidiques d’intérêt avec un simple changement des systèmes de solvants TLC<s...

L’acétyl-CoA est l’élément constitutif fondamental de diverses biomolécules, y compris les lipides neutres (LNL), qui servent de monnaie biomoléculaire polyvalente pour la construction de membranes, la génération d’ATP et la régulation de la signalisation cellulaire1,2. La disponibilité des LNL à être déviés dans l’une de ces voies respectives est, en partie, réglementée par leur stockage. Les gouttelettes lipidiques (LD), organites cytoplasmiques composés de noyaux hydrophobes de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE), sont les principaux compartiments de stockage de la plupart des LL cellulaires. En tant que tels, les LD séquestrent et régulent les LNL, qui peuvent être dégradés et ensuite utilisés pour les processus biochimiques et métaboliques3,4. On sait que la mauvaise régulation des protéines associées à la NL et à la LD est corrélée à l’apparition de pathologies telles que la lipodystrophie et les syndromes métaboliques5,6. Pour cette raison, la recherche actuelle sur la LD est intensément axée sur la façon dont la synthèse NL est régulée spatialement, temporellement et à travers des tissus distincts d’organismes multicellulaires. En raison des rôles cellulaires omniprésents des NL, de nombreuses enzymes responsables de la synthèse et de la régulation des LNL sont conservées dans l’ensemble des eucaryotes7. En effet, même certains procaryotes stockent les LL dans les LD8. Par conséquent, des organismes modèles génétiquement traitables tels que Saccharomyces cerevisiae (levure bourgeonnante) ont été utiles pour l’étude de la synthèse et de la régulation des NL.
La séparation et la quantification des LN à partir d’extraits cellulaires peuvent être réalisées de multiples façons, y compris la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la chromatographie liquide ultra-performance-spectrométrie de masse (UPLC-MS)9,10,11. Peut-être que la méthode la plus simple pour séparer les LNL est par chromatographie sur couche mince (TLC), qui permet une quantification densitométrique ultérieure à partir d’une courbe standard12,13. Bien que le TLC ne fournisse qu’une séparation des LNL, il reste une technique puissante car il est peu coûteux et permet la séparation rapide des LNL de plusieurs échantillons simultanément. Deux des défis les plus considérables auxquels est confrontée l’étude des LNL via TLC sont: 1) le large éventail d’abondances cellulaires des espèces NL et de leurs intermédiaires, et 2) la gamme d’hydrophilie / hydrophobicité des intermédiaires lipidiques dans les voies de synthèse NL. Par conséquent, la quantification des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador par LTC est généralement limitée aux espèces les plus abondantes; cependant, l’introduction d’un radiomarque de l’acide C-acétique 14peut améliorer considérablement la détection des intermédiaires de faible abondance dans les voies NL. L’acide acétique est rapidement converti en acétyl-CoA par l’acétyl-CoA synthétase ACS214, ce qui fait de l’acide 14C-acétique un substrat de radiomarquage approprié dans la levure15. De plus, la séparation des LNL hydrophobes et des intermédiaires hydrophiles des LNL peut être réalisée par TLC grâce à l’utilisation de plusieurs systèmes de solvants16. Ici, une méthode est présentée pour la séparation des LNL en utilisant le label métabolique de l’acide C-acétique 14dans la levure. Les lipides marqués pendant la période de pouls sont ensuite isolés par un protocole d’isolement lipidique total bien établi17,suivi de la séparation des espèces NL par TLC. Le développement de plaques TLC par autoradiographie pour visualiser les lipides marqués et par pulvérisation chimique pour visualiser les lipides totaux permet de multiples méthodes de quantification. Les bandes lipidiques individuelles peuvent également être facilement extraites de la plaque TLC à l’aide d’une lame de rasoir, et le comptage de scintillation peut être utilisé pour quantifier la quantité de matériau radiomarqué dans la bande.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

Les lipides neutres (LNI) sont une classe de biomolécules hydrophobes et sans charge qui jouent un rôle clé dans l’homéostasie énergétique et lipidique. Les NL sont synthétisés de novo à partir de l’acétyl-CoA et sont principalement présents chez les eucaryotes sous forme de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE). Les enzymes responsables de la synthèse des LNL sont hautement conservées de Saccharomyces cerevisiae (levure) à l’homme, faisant de la levure un organisme modèle utile pour disséquer la fonction et la régulation des enzymes du métabolisme NL. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la façon dont l’acétyl-CoA est converti en un ensemble diversifié d’espèces NL, des mécanismes de régulation des enzymes du métabolisme NL et comment une mauvaise régulation peut contribuer aux pathologies cellulaires sont encore en cours de découverte. De nombreuses méthodes d’isolement et de caractérisation des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador ont été mises au point et utilisées au cours de décennies de recherche; toutefois, il n’a pas été question d’un protocole quantitatif et simple pour la caractérisation complète des principales espèces de Terre-Neuve-et-Labrador. Ici, une méthode simple et adaptable pour quantifier la synthèse de novo des principales espèces nl dans la levure est présentée. Nous appliquons 14marques métaboliques de l’acide C-acétique couplées à la chromatographie sur couche mince pour séparer et quantifier une gamme variée de NL physiologiquement importantes. De plus, cette méthode peut être facilement appliquée pour étudier les taux de réaction in vivo des enzymes NL ou la dégradation des espèces NL au fil du temps.

Dans ce protocole, nous avons démontré que le labeling, la détection et la quantification des espèces NL peuvent être réalisés par 14étiquetage métabolique de l’acide C-acétique. Les principales espèces nl peuvent être séparées dans un système de solvant de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Éther de pétrole:Éther diéthylique:Acide acétique (Figure 1A, B). L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’acide gras libre marqué (FFA), le triacyl...

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Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide 14C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.

Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Cette technique utilise des instruments couramment trouvés dans la plupart des environnements de laboratoire et permet l’analyse de plusieurs échantillons simultanément. Cette méthode peut fournir des informations clés sur la façon dont les enzymes du métabolisme des lipides sont régulées dans un contexte cellulaire et dans différents contextes génétiques. Inoculer une colonie d’une plaque de culture de levure dans 20 millilitres de milieux SC contenant 2% de dextrose et incuber à 30 degrés Celsius pendant la nuit en agitant à 200 tr / min.Le lendemain, diluer la culture dans 50 millilitres de milieux frais jusqu’à une DO finale de 0,2 et la faire croître pendant 24 heures jusqu’à ce que la phase stationnaire soit atteinte. Préparez deux aliquotes de 20 millilitres de tampon de trempe pour chaque échantillon et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Simultanément, préparez des milieux de radiomarquage en ajoutant du sel de sodium d’acide acétique aux milieux SC sans dextrose à une concentration finale de 10 microcuries par millilitre.Prélever les cellules en centrifugant à 4 100 x g pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et lavez la pastille de cellule une fois avec 20 millilitres de milieu SC sans dextrose. Prélever à nouveau les cellules en les centrifugant à 4 100 x g pendant cinq minutes et les transférer dans un tube de microcentrifugation marqué de deux millilitres à l’aide d’un milieu libre dextre.Centrifugez les cellules pendant encore deux minutes. Remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de milieux SC sans dextrose et commencez la période de radiomarquage en ajoutant rapidement 500 microlitres de milieux de radiomarquage à chaque suspension cellulaire. Incuber les tubes dans un incubateur rotatif à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes.Pendant ce temps, pré-refroidir la centrifugeuse équipée de tubes coniques de 50 millilitres à moins 10 degrés Celsius et décongeler une aliquote de 20 millilitres de tampon de trempe. Une fois la période de radiomarquage terminée, utilisez une pipette pour plonger l’échantillon entier d’un millilitre dans un tampon de trempe décongelé sur de la glace. Recueillir la pastille de la cellule en la faisant tourner dans une centrifugeuse pré-refroidie à 5 000 x g pendant trois minutes et ajouter 20 millilitres de tampon de trempe à froid frais.Vortex et secouez les échantillons pour les remettre complètement en service dans un tampon de trempe et centrifugez à nouveau les échantillons pour prélever les cellules. Une fois les cellules granulées, retirez soigneusement tout le tampon de trempe des échantillons en versant le surnageant et en enlevant l’excès avec une pipette. Conservez les tubes à moins 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur.Peser 0,3 gramme de billes de verre lavées à l’acide pour chaque échantillon et les stocker dans deux tubes de microcentrifugation millilitres sur de la glace. Retirez les granulés de cellules du congélateur à moins 80 degrés et placez-les sur de la glace. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de méthanol et 700 microlitres de chloroforme à chaque échantillon et ressuspendez les cellules.Transférez-les dans des tubes de microcentrifugation contenant des billes de verre pré-pesées. Lyser les cellules en tourbillonnant trois fois pendant une minute, avec une incubation de 30 secondes sur de la glace entre les agitations. Versez les cellules dans un tube de centrifugeuse en verre de 15 millilitres et étiquetez le tube comme tube A.Lavez le tube de microcentrifugation avec un millilitre de méthanol, vortexez-le et versez le méthanol dans le tube A.Ajoutez deux millilitres de chloroforme suivis de 400 microlitres d’eau dans le tube A pour un volume d’échantillon final de 4,45 millilitres.Vortex les échantillons pendant une minute suivie d’une centrifugation de cinq minutes à 1000 x g pour séparer clairement les phases aqueuse et organique avec les débris cellulaires se trouvant à l’interface. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, recueillir la phase organique dans un nouveau tube de centrifugeuse en verre étiqueté B et ajouter un millilitre d’un chlorure de potassium molaire. Ajouter un millilitre de méthanol et deux millilitres de chloroforme au tube A et répéter les étapes de vortex et de centrifugation.Vortex et tube centrifuge B pour séparer la phase aqueuse et la phase organique. Retirez la couche aqueuse supérieure et rassemblez toute la couche organique inférieure dans un flacon en verre de quatre millilitres. Évaporer complètement le solvant des extraits lipidiques en séchant sous gaz inerte et préchauffer un four à 145 degrés Celsius pour chauffer la plaque TLC.Déterminer les quantités relatives de radiomarque prises par les cellules avant de les charger sur la plaque TLC. Reconstituer les lipides de l’échantillon dans 40 à 50 microlitres de chloroforme et de méthanol mélangés à un rapport de un pour un en vortexant pendant cinq minutes. Préparer 101 millilitres du solvant de phase mobile dans un cylindre gradué en verre.Ensuite, versez le solvant dans une chambre TLC en verre contenant un tampon de saturation TLC de 20 par 20 et un couvercle hermétique. Préparez une plaque canalisée de gel de silice 60G de 20 par 20 et marquez une ligne à 1,5 centimètre au-dessus du fond de la plaque à l’aide d’un crayon. Une fois que la plaque a été suffisamment chauffée et que le tampon de saturation TLC est saturé de solvant, retirez la plaque TLC du four et procédez immédiatement au chargement.À l’aide d’une pipette, repérez cinq microlitres d’échantillon sur l’origine de chaque voie située à 1,5 centimètre au-dessus du fond de la plaque TLC et répétez le chargement jusqu’à ce que 20 à 40 microlitres d’échantillon entraitré dans chaque voie. Une fois l’étalon et les échantillons chargés, placez la plaque dans la chambre de développement et attendez que le solvant ait atteint le sommet de la plaque. Lorsque la plaque est complètement développée, retirez-la de la chambre et laissez-la sécher dans la hotte pendant 20 minutes.Une fois la plaque séchée, recouvrez-la d’un film plastique et placez-la dans une cassette en développement avec un écran d’autoradiographie. Retirez l’écran de la cassette en développement et placez-le à l’intérieur d’un imageur au phosphore. Vaporisez la plaque TLC avec un réactif p-anisaldéhyde jusqu’à ce que la silice soit saturée, puis faites-la cuire dans un four à 145 degrés pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que des bandes soient apparues.Pour quantifier les espèces lipidiques, grattez le gel de silice contenant des espèces lipidiques individuelles et transférez-les dans des flacons de scintillation en verre. Ajouter six millilitres de liquide de scintillation et vortex vigoureusement jusqu’à ce que la bande de silice ait été réduite en petits morceaux. Placez la grille avec les flacons de scintillation dans un compteur de scintillation et comptez en ajustant le temps de comptage à deux minutes par flacon.L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’autoradiogramme de l’acide gras sans étiquette, du triacylglycérol, du diacylglycérol, du cholestérol et du squalane. Il a été démontré que les espèces lipidiques purifiées peuvent être séparées dans cette méthode et ensuite visualisées par pulvérisation de la plaque TLC avec un réactif p-anisaldéhyde. Les espèces visualisées comprennent tous les lipides mentionnés précédemment en plus des esters stériles.En appliquant une période de poursuite de 10 minutes dans des milieux sans radiomarque après le pouls, on a observé au niveau du principal bassin de squalane disparaître et le cholestérol total était élevé. De même, l’apparition du diacylglycérol dans la période de poursuite était corrélée à une diminution du signal des acides gras libres. Avant d’effectuer le protocole complet, il est important de déterminer si les cellules absorberont le radiomarque de l’acide acétique dans l’état de croissance et le fond génétique d’intérêt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Recherche

Biochimie

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

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Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

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Étiquetage et visualisation des produits d&apos;expression du génome mitochondrial dans Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

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Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

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Évaluation de la localisation des protéines submitochondriales dans la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mesure des taux de renouvellement des protéines dans les cellules cultivées sénescentes et non divisées avec marquage métabolique et spectrométrie de masse

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...