Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

लेखक इस अध्ययन के पूरा होने में मदद और वैचारिक सलाह के लिए हेन लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । डब्ल्यू.M एच को वेल्च फाउंडेशन (आई-1873), एनआईएच एनआईजीएमएस (GM119768), आरा पैरासघियन मेडिकल रिसर्च फंड और यूटी साउथवेस्टियन एंडोइन स्कॉलर्स प्रोग्राम से फंड द्वारा समर्थित किया गया है। एसआर को T32 प्रोग्राम ग्रांट (5T32GM008297) द्वारा समर्थित किया गया है।

1. 14सी-एसिटिक एसिड के साथ खमीर कोशिकाओं का विकास और लेबलिंग
<ol><li>एक थाली से एक कॉलोनी उठा और यह सिंथेटिक पूरा (अनुसूचित जाति) 2% डेक्सट्रोस युक्त मीडिया के 20 मिलील में वितरण द्वारा एक खमीर संस्कृति टीका (...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+biogenesis.">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li><li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets.">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+atherosclerosis:+A+perspective+for+the+1990s.">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li><li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet:+A+conserved+cellular+organelle.">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li><li>W&#228;ltermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes:+How+bacteria+fatten+up:+Lipid-body+formation+in+prokaryotes.">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li><li>Borrull, A., L&#243;pez-Mart&#237;nez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Roz&#232;s, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li><li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

यहां, खमीर में एनएल प्रजातियों के संश्लेषण की मात्रात्मक निगरानी करने के लिए एक बहुमुखी रेडियोलाबेलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल बहुत मॉड्यूलर है, जो प्रक्रिया को 3-6 दिनों के भीतर ?...

एसिटिल-सीओए तटस्थ लिपिड (एनएलएस) सहित विविध जैव अणुओं का मौलिक भवन ब्लॉक है, जो झिल्ली के निर्माण, एटीपी उत्पन्न करने और सेल सिग्नलिंग1,2को विनियमित करने के लिए एक बहुमुखी जैव अणु मुद्रा के रूप में काम करता है। इनमें से किसी भी संबंधित रास्ते में नृश किए जाने वाले एनएलएस की उपलब्धता उनके भंडारण द्वारा विनियमित है । लिपिड ड्रॉपलेट्स (एलडीएस), ट्राइग्लिसराइड्स (टीजीएस) और स्टेरोल-एस्टर (एसईएस) के हाइड्रोफोबिक कोर से बने साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स, अधिकांश सेलुलर एनएलएस के मुख्य भंडारण डिब्बे हैं। इस प्रकार, एलडी एनएलएस को अलग और विनियमित करता है, जिसे नीचा दिखाया जा सकता है और बाद में जैव रासायनिक और मेटाबोलिक प्रक्रियाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है3,4। यह ज्ञात है कि एनएल और एलडी से जुड़े प्रोटीन का गलत नियमन लिपोडिस्ट्रोफी और मेटाबोलिक सिंड्रोम5, 6सहित विकृत विकृत है। इस वजह से, वर्तमान एलडी अनुसंधान तीव्रता से इस बात पर केंद्रित है कि एनएल संश्लेषण को कैसे विस्तृत रूप से, अस्थायी रूप से और बहु-सेलुलर जीवों के अलग-अलग ऊतकों में विनियमित किया जाता है। एनएलएस के लिए सर्वव्यापी सेलुलर भूमिकाओं के कारण, एनएलएस के संश्लेषण और विनियमन के लिए जिम्मेदार कई एंजाइम पूरे यूकेरियोट्स 7 मेंसंरक्षितहोते हैं। दरअसल, यहां तक कि कुछ प्रोकारियोट्स एलडीएस8में एनएलएस स्टोर करते हैं । इसलिए, आनुवंशिक रूप से ट्रैकेबल मॉडल जीव जैसे सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (नवोदित खमीर) एनएल संश्लेषण और विनियमन के अध्ययन के लिए उपयोगी रहे हैं।
सेल अर्क से एनएलएस के पृथक्करण और मात्राकरण को असंख्य तरीकों से पूरा किया जा सकता है, जिसमें गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस), उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी), और अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एमएस)9,10, 11शामिल हैं। शायद एनएलएस को अलग करने के लिए सबसे सरल तरीका पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) के माध्यम से है, जो मानक वक्र12,13से बाद के घनत्व मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। हालांकि टीएलसी एनएलएस का केवल एक कोर्स-दानेदार पृथक्करण प्रदान करता है, यह एक शक्तिशाली तकनीक बनी हुई है क्योंकि यह सस्ती है, और यह एक साथ कई नमूनों से एनएलएस के तेजी से अलग होने की अनुमति देता है। टीएलसी के माध्यम से एनएलएस के अध्ययन का सामना करने वाली सबसे काफी चुनौतियों में से दो हैं: 1) एनएल प्रजातियों और उनके मध्यवर्ती के सेलुलर बहुतायत की व्यापक श्रृंखला, और 2) एनएल संश्लेषण मार्गों के भीतर लिपिड मध्यवर्ती की हाइड्रोफिलिसिटी/हाइड्रोफोबसिटी की सीमा । नतीजतन, टीएलसी के माध्यम से एनएल प्रजातियों का मात्राकरण आमतौर पर सबसे प्रचुर मात्रा में प्रजातियों तक सीमित है; हालांकि, 14सी-एसिटिक एसिड रेडियोलेबल की शुरूआत एनएल रास्तों के भीतर कम बहुतायत मध्यवर्ती का पता लगाने में काफी वृद्धि कर सकती है। एसिटिक एसिड को एसिटिल-सीओए सिंथेस्टेस एसी214द्वारा तेजी से एसिटिल-सीओए में परिवर्तित किया जाता है, जो 14सी-एसिटिक एसिड को खमीर15में उपयुक्त रेडियोलाबेलिंग सब्सट्रेट बनाता है। इसके अतिरिक्त, एनएलएस के हाइड्रोफोबिक एनएलएस और हाइड्रोफिलिक इंटरमीडिएट दोनों को अलग करने का लक्ष्य टीएलसी द्वारा मल्टीपल सॉल्वेंट सिस्टम16के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। यहां, खमीर में 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग का उपयोग करके एनएलएस के पृथक्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। नाड़ी अवधि के दौरान लेबल किए गए लिपिड को बाद में एक अच्छी तरह से स्थापित कुल लिपिड आइसोलेशन प्रोटोकॉल17द्वारा अलग किया जाता है, जिसके बाद टीएलसी द्वारा एनएल प्रजातियों को अलग किया जाता है। लेबल किए गए लिपिड की कल्पना करने के लिए दोनों ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा टीएलसी प्लेटों का विकास, और कुल लिपिड की कल्पना करने के लिए एक रासायनिक स्प्रे, मात्राकरण के कई तरीकों के लिए परमिट। व्यक्तिगत लिपिड बैंड भी आसानी से एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर टीएलसी प्लेट से निकाला जा सकता है, और प्रस्फुटन गिनती बैंड के भीतर रेडियोलेबल सामग्री की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

न्यूट्रल लिपिड (एनएलएस) हाइड्रोफोबिक, चार्जलेस बायोमॉलिक्यूल्स का एक वर्ग है जो ऊर्जा और लिपिड होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एनएलएस एसिटिल-सीओए से संश्लेषित डी नोवो हैं और मुख्य रूप से ट्राइग्लिसराइड्स (टीजीएस) और स्टेरोल-एस्टर (एसईईएस) के रूप में यूकेरियोट्स में मौजूद हैं। एनएलएस के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार एंजाइमों को मनुष्यों के लिए सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (खमीर) से अत्यधिक संरक्षित किया जाता है, जिससे खमीर को एनएल मेटाबोलिज्म एंजाइमों के कार्य और विनियमन को विच्छेदन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव बना दिया जाता है। जबकि बहुत कैसे एसीटाइल-CoA एनएल प्रजातियों के एक विविध सेट में परिवर्तित किया जाता है के बारे में जाना जाता है, एनएल चयापचय एंजाइमों को विनियमित करने के लिए तंत्र, और कैसे गलत विनियमन सेलुलर विकृतियों में योगदान कर सकते हैं, अभी भी खोजा जा रहा है । एनएल प्रजातियों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए कई तरीकों को विकसित किया गया है और दशकों के अनुसंधान में उपयोग किया गया है; हालांकि, प्रमुख एनएल प्रजातियों के व्यापक लक्षण वर्णन के लिए एक मात्रात्मक और सरल प्रोटोकॉल पर चर्चा नहीं की गई है । यहां, खमीर में प्रमुख एनएल प्रजातियों के डी नोवो संश्लेषण की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और अनुकूलनीय विधि प्रस्तुत की जाती है। हम 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग को पतली परत क्रोमेटोग्राफी के साथ अलग करने और शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण एनएलएस की विविध श्रृंखला को निर्धारित करने के लिए लागू करते हैं । इसके अतिरिक्त, इस विधि को आसानी से एनएल एंजाइमों या समय के साथ एनएल प्रजातियों के क्षरण के वीवो प्रतिक्रिया दरों में अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में, हमने यह प्रदशत किया है कि एनएल प्रजातियों की लेबलिंग, पता लगाने और मात्राकरण को 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग द्वारा पूरा किया जा सकता है। प्रमुख एनएल प्रजातियों को 50:40:10:1 (v/v/v/v%) ह...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

यहां, 14सी-एसिटिक एसिड के साथ खमीर के मेटाबोलिक लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जिसे बेअसर लिपिड के पृथक्करण के लिए पतली परत क्रोमेटोग्राफी के साथ मिलकर किया जाता है।

मेटाबोलिक लेबलिंग और पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में तटस्थ लिपिड संश्लेषण का विश्लेषण

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

यह तकनीक आमतौर पर अधिकांश प्रयोगशाला वातावरण में पाए जाने वाले उपकरणों का उपयोग करती है और एक साथ कई नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देती है। यह विधि इस बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है कि लिपिड मेटाबोलिज्म एंजाइमों को सेलुलर संदर्भ में और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में कैसे विनियमित किया जाता है। एक खमीर संस्कृति प्लेट से अनुसूचित जाति मीडिया के 20 मिलीलीटर में एक कॉलोनी टीका 2% डेक्सट्रोस युक्त और २०० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ रात के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।अगले दिन, ताजा मीडिया के ५० मिलीलीटर में संस्कृति को ०.२ के अंतिम ओडी तक पतला करें और स्थिर चरण तक पहुंचने तक इसे 24 घंटे तक बढ़ाएं । प्रत्येक नमूने के लिए दो 20 मिलीलीटर एलिकोट्स शमन बफर तैयार करें और उन्हें शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसके साथ ही, 10 माइक्रोक्यूरी प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर डेक्सट्रोस फ्री एससी मीडिया में एसिटिक एसिड सोडियम नमक जोड़कर रेडियोलाबेलिंग मीडिया तैयार करें।10 मिनट के लिए 4, 100 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए। सुपरनेट निकालें और डेक्सट्रोस फ्री एससी मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ एक बार सेल पेलेट धोएं। पांच मिनट के लिए 4, 100 x g पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को फिर से ले लीजिए और उन्हें डेक्सट्रोस मुक्त मीडिया का उपयोग करके लेबल वाले दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।एक और दो मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र । डेक्सट्रोस फ्री एससी मीडिया के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और प्रत्येक सेल निलंबन में रेडियोलेबलिंग मीडिया के 500 माइक्रोलीटर को जल्दी से जोड़कर रेडियोलाबेलिंग अवधि शुरू करें। ट्यूबों को 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।इस बीच, पूर्व ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के लिए सुसज्जित अपकेंद्रित्र शांत शून्य से 10 डिग्री सेल्सियस और शमन बफर के एक 20 मिलीलीटर aliquots गल । एक बार रेडियोलाबेलिंग अवधि समाप्त हो गया है एक पिपेट का उपयोग करने के लिए बर्फ पर गल शमन बफर में पूरे एक मिलीलीटर नमूना डुबकी । तीन मिनट के लिए 5, 000 x g पर एक पूर्व ठंडा अपकेंद्रित्र में कताई द्वारा सेल गोली ले लीजिए और ताजा ठंड शमन बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें।भंवर और नमूनों को पूरी तरह से बफर बुझाने में उन्हें फिर से खर्च करने के लिए हिला और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए फिर से नमूनों अपकेंद्रित्र । एक बार कोशिकाओं को गोली मार रहे हैं, अच्छी तरह से नमूनों से सभी शमन बफर को हटा दें और एक पिपेट के साथ अतिरिक्त को हटा दें। आगे की प्रक्रिया के लिए ट्यूबों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।प्रत्येक नमूने के लिए 0.3 ग्राम एसिड धोया ग्लास मोतियों का वजन करें और उन्हें बर्फ पर दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्टोर करें। माइनस 80 डिग्री फ्रीजर से सेल छर्रों को निकालकर बर्फ पर रखें। फिर, प्रत्येक नमूने में मेथनॉल के 350 माइक्रोलीटर और क्लोरोफॉर्म के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।उन्हें पूर्व-तौला ग्लास मोती युक्त माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। एक मिनट के लिए तीन बार भंवर से कोशिकाओं Lyse, आंदोलनों के बीच बर्फ पर 30 दूसरे इनक्यूबेशन के साथ । कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ग्लास सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें और ट्यूब को ट्यूब के रूप में लेबल करें ए मेथनॉल के एक मिलीलीटर के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को धोएं, इसे भंवर दें, और मेथनॉल को ट्यूब ए में डालें और इसके बाद 400 माइक्रोलीटर पानी के 400 माइक्रोलीटर को ट्यूब ए में 4.45 मिलीलीटर की अंतिम नमूना मात्रा के लिए जोड़ें।भंवर एक मिनट के लिए नमूनों के बाद १००० x g पर एक पांच मिनट अपकेंद्रित्र के बाद स्पष्ट रूप से सेल इंटरफेस पर झूठ बोल मलबे के साथ जलीय और कार्बनिक चरणों को अलग करने के लिए । एक ग्लास चारागाह पिपेट का उपयोग करके, कार्बनिक चरण को एक नए ग्लास सेंट्रलाइज ट्यूब लेबल बी में इकट्ठा करें और एक मोलर पोटेशियम क्लोराइड का एक मिलीलीटर जोड़ें। मेथनॉल का एक मिलीलीटर और दो मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म को ट्यूब ए में जोड़ें और भंवर और अपकेंद्रित्र चरणों को दोहराएं।जलीय और कार्बनिक चरण को अलग करने के लिए भंवर और अपकेंद्रित्र ट्यूब बी। ऊपरी जलीय परत को हटा दें और पूरे नीचे कार्बनिक परत को चार मिलीलीटर ग्लास शीशी में इकट्ठा करें। निष्क्रिय गैस के नीचे सूखने से लिपिड अर्क से सॉल्वेंट को पूरी तरह से वाष्पित करें और टीएलसी प्लेट को गर्म करने के लिए ओवन को 145 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।टीएलसी प्लेट पर लोड करने से पहले कोशिकाओं द्वारा उठाए गए रेडियोलेबल की सापेक्ष मात्रा निर्धारित करें। नमूने लिपिड को क्लोरोफॉर्म के 40 से 50 माइक्रोलीटर में पुनर्गठित करें और मेथनॉल को पांच मिनट तक भंवर से एक-से-एक अनुपात में मिलाया जाए। एक ग्लास स्नातक सिलेंडर में मोबाइल फेज सॉल्वरों के 101 मिलीलीटर तैयार करें।फिर, सॉल्वेंट को एक ग्लास टीएलसी चैंबर में डालें जिसमें 20 बाय 20 टीएलसी संतृप्ति पैड और एक टाइट फिटिंग ढक्कन होता है। एक मोड़ा 20 बाय 20 सिलिका जेल 60G प्लेट तैयार करें और पेंसिल का उपयोग करके प्लेट के नीचे 1.5 सेंटीमीटर की रेखा को चिह्नित करें। एक बार जब प्लेट पर्याप्त रूप से गर्म हो जाती है और टीएलसी संतृप्ति पैड को सॉल्वेंट से संतृप्त किया जाता है, तो टीएलसी प्लेट को ओवन से हटा दें और तुरंत इसे लोड करने के लिए आगे बढ़ें।एक पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक लेन की उत्पत्ति पर नमूना के पांच माइक्रोलीटर हाजिर टीएलसी प्लेट के नीचे १.५ सेंटीमीटर स्थित है और जब तक नमूना के 20 से ४० माइक्रोलीटर प्रत्येक लेन में लोड किया गया है दोहराने लोडिंग । एक बार मानक और नमूने लोड हो जाने के बाद, प्लेट को विकासशील कक्ष में रखें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सॉल्वेंट प्लेट के शीर्ष पर न पहुंच जाए। जब प्लेट पूरी तरह से विकसित हो जाए, तो इसे चैंबर से हटा दें और इसे 20 मिनट के लिए धुएं के हुड में सूखने दें।प्लेट सूखने के बाद इसे प्लास्टिक फिल्म से ढक कर ऑटोरेडियोग्राफी स्क्रीन के साथ एक विकासशील कैसेट में रखें। स्क्रीन को विकासशील कैसेट से निकालें और इसे फॉस्फोर इमेजर के अंदर रखें। जब तक सिलिका संतृप्त न हो जाए तब तक टीएलसी प्लेट को पी-एनिसलेडिहाइड रिएजेंट के साथ स्प्रे करें, फिर इसे पांच मिनट के लिए 145 डिग्री ओवन में बेक करें या जब तक बैंड दिखाई न दें।लिपिड प्रजातियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, सिलिका जेल को अलग-अलग लिपिड प्रजातियों से युक्त परिमार्जन करें और उन्हें ग्लास प्रस्फुटन शीशियों में स्थानांतरित करें। छह मिलीलीटर प्रस्फुटन तरल पदार्थ और भंवर को सख्ती से जोड़ें जब तक कि सिलिका बैंड छोटे टुकड़ों में कम न हो जाए। प्रस्फुटन शीशियों के साथ रैक को एक प्रस्फुटन काउंटर में रखें और गिनती के समय को दो मिनट प्रति शीशी में समायोजित करके गिनती करें।फॉस्फोर इमेजिंग लेबल-मुक्त फैटी एसिड, ट्राइसिल्गालिसेरोल, डायसिलग्लाइसरोल, कोलेस्ट्रॉल और स्क्व्वाटेन के ऑटोरेडियोग्राम के दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह प्रदर्शित किया गया था कि शुद्ध लिपिड प्रजातियों को इस विधि में अलग किया जा सकता है और बाद में पी-एनिसल्डिहाइड रिएजेंट के साथ टीएलसी प्लेट के छिड़काव से कल्पना की जा सकती है। विज़ुअलाइज़ेड प्रजातियों में बाँझ एस्टर के अलावा पहले से उल्लिखित सभी लिपिड शामिल हैं।नाड़ी के बाद रेडियोलाबेल मुक्त मीडिया में एक 10 मिनट का पीछा अवधि लागू करके, यह फुलटेन के प्रमुख पूल में देखा गया था गायब हो गया और कुल कोलेस्ट्रॉल ऊंचा था । इसी तरह, चेस अवधि में डिसिल्लीसेरोल की उपस्थिति मुक्त फैटी एसिड सिग्नल में कमी के साथ सहसंबद्ध है। पूर्ण प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाएं विकास की स्थिति और ब्याज की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में एसिटिक एसिड रेडियोलेबल को तेज करेंगी या नहीं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Isobaric लेबलिंग, व्यापक तरल क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और सॉफ्टवेयर असिस्टेड ठहराव द्वारा डीप Proteome profile

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण चयापचय का निरपेक्ष क्वांटिफिकेशन

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री और जैव सूचना विज्ञान द्वारा पेप्टिडोग्लाइकन का अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई स्पलिसिओसोम सबकॉम्प्लेक्स के क्षणिक इंटरप् इंटरेक्टर्स का पता लगाने के लिए ग्रेफिक्स का उपयोग

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

बेकर के खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अभिव्यक्ति उत्पादों की लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की तैयारी और क्रायो-एफआईबी माइक्रोमशीनिंग

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae में Submitochondrial प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

मेटाबोलिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सेनेसेंट और गैर-विभाजित सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन टर्नओवर दरों का मापन

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...