Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Forfatterne vil takke medlemmene av Henne-laboratoriet for hjelp og konseptuelle råd i gjennomføringen av denne studien. W.M.H. støttes av midler fra Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund og UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R har blitt støttet av et T32-programstipend (5T32GM008297).

1. Vekst og merking av gjærceller med 14C-eddiksyre
<ol><li>Inokuler en gjærkultur ved å plukke en koloni fra en tallerken og dispensere den i 20 ml syntetisk komplette (SC) medier som inneholder 2% dekstrose (se Tilleggsfil for oppskrift av SC-medier). Inkuber ved 30 °C for overnatting med risting ved 200 o/min. MERK: Veksttilstanden, prøvevolumet og behandlingen vil variere basert på lipid(er) av interesse. Før du kjører fulle eksperimenter, bør optimale vekstforhold og kulturv...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+biogenesis.">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li><li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets.">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+atherosclerosis:+A+perspective+for+the+1990s.">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li><li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet:+A+conserved+cellular+organelle.">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li><li>W&#228;ltermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes:+How+bacteria+fatten+up:+Lipid-body+formation+in+prokaryotes.">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li><li>Borrull, A., L&#243;pez-Mart&#237;nez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Roz&#232;s, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li><li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

Her presenteres en allsidig radiomerkingsprotokoll for kvantitativ overvåking av syntesen av NL-arter i gjær. Denne protokollen er veldig modulær, noe som gjør at prosedyren kan fullføres innen 3-6 dager. I tillegg eksisterer et vell av litteratur om bruk av TLC for å skille lipidarter og metabolitter, noe som bør tillate brukeren å oppdage flere lipidarter av interesse med en enkel endring av TLC løsningsmiddelsystemer16,19. Denne protokollen bidrar til...

Acetyl-CoA er den grunnleggende byggesteinen i forskjellige biomolekyler, inkludert nøytrale lipider (NLs), som tjener som en allsidig biomolekylær valuta for å bygge membraner, generere ATP og regulere cellesignalering1,2. Tilgjengeligheten av NLs som skal shunted inn i noen av disse respektive veiene er delvis regulert av deres lagring. Lipiddråper (LDer), cytoplasmatiske organeller sammensatt av hydrofobe kjerner av triglyserider (TG) og sterol-estere (SE), er de viktigste lagringsrommene til de fleste cellulære NLer. Som sådan, LDs sequester og regulere NLs, som kan degraderes og deretter brukes til biokjemiske og metabolske prosesser3,4. Det er kjent at feilregulering av NL- og LD-assosierte proteiner er korrelert med utbruddet av patologier, inkludert lipodystrofi og metabolske syndromer5,6. På grunn av dette er nåværende LD-forskning intenst fokusert på hvordan NL-syntese reguleres romlig, timelig og på tvers av distinkte vev av multi-cellulære organismer. På grunn av allestedsnærværende cellulære roller for NLs, er mange enzymer som er ansvarlige for syntesen og reguleringen av NLs bevart gjennom eukaryoter7. Faktisk lagrer selv noen prokaryoter NLs i LDer8. Derfor har genetisk gjennomførbare modellorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær) vært nyttige for studiet av NL-syntese og regulering.
Separasjon og kvantifisering av NLer fra celleekstrakter kan oppnås på en rekke måter, inkludert gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS), høyytelses væskekromatografi (HPLC) og ultraytelses væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Kanskje den enkleste metoden for å skille NLer er via tynn lagkromatografi (TLC), som muliggjør etterfølgende densitometrisk kvantifisering fra en standardkurve12,13. Selv om TLC bare gir en kurskornet separasjon av NLs, forblir det en kraftig teknikk fordi den er billig, og det gir mulighet for rask separasjon av NLs fra flere prøver samtidig. To av de viktigste utfordringene studien av NLs står overfor via TLC er: 1) det brede spekteret av cellulære overflod av NL-arter og deres mellomprodukter, og 2) omfanget av hydrofilisitet/hydrofobiskhet av lipid mellomprodukter innenfor NL-synteseveier. Følgelig er kvantifiseringen av NL-arter via TLC vanligvis begrenset til de mest tallrike artene; Imidlertid kan innføring av en 14C-eddiksyreradiomerket forbedre påvisning av lave overflodsforenkninger innenfor NL-veier betydelig. Eddiksyre omdannes raskt til acetyl-CoA av acetyl-CoA-syntetase ACS214, noe som gjør 14C-eddiksyre til et egnet radiomerket substrat i gjær15. I tillegg kan separasjon av både hydrofobe NLs og hydrofile mellomprodukter av NLs oppnås ved TLC ved bruk av flere løsningsmiddelsystemer16. Her presenteres en metode for separasjon av NLs ved hjelp av 14C-eddiksyre metabolsk merking i gjær. Lipider merket i løpet av pulsperioden isoleres deretter av en veletablert total lipidisolasjonsprotokoll17, etterfulgt av separasjon av NL-arter av TLC. Utvikling av TLC-plater ved både autoradiografi for å visualisere merkede lipider, og en kjemisk spray for å visualisere totale lipider, tillater flere metoder for kvantifisering. Individuelle lipidbånd kan også enkelt ekstraheres fra TLC-platen ved hjelp av et barberblad, og scintillasjonstelling kan brukes til å kvantifisere mengden radiomerket materiale i båndet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

Nøytrale lipider (NLs) er en klasse hydrofobe, ladløse biomolekyler som spiller nøkkelroller i energi og lipid homeostase. NLs er syntetisert de novo fra acetyl-CoA og er primært til stede i eukaryoter i form av triglyserider (TGs) og sterol-estere (SE). Enzymene som er ansvarlige for syntesen av NLs er sterkt bevart fra Saccharomyces cerevisiae (gjær) til mennesker, noe som gjør gjær til en nyttig modellorganisme for å dissekere funksjonen og reguleringen av NL-metabolismenzymer. Mens mye er kjent om hvordan acetyl-CoA omdannes til et mangfoldig sett med NL-arter, oppdages mekanismer for regulering av NL-metabolismeenzymer, og hvordan feilregulering kan bidra til cellulære patologier. Tallrike metoder for isolering og karakterisering av NL-arter har blitt utviklet og brukt over flere tiår med forskning; Det er imidlertid ikke diskutert en kvantitativ og enkel protokoll for omfattende karakterisering av store NL-arter. Her presenteres en enkel og tilpasningsdyktig metode for å kvantifisere de novo-syntesen av store NL-arter i gjær. Vi bruker 14C-eddiksyre metabolsk merking kombinert med tynn lagkromatografi for å skille og kvantifisere et mangfoldig utvalg av fysiologisk viktige NLs. I tillegg kan denne metoden lett brukes til å studere in vivo reaksjonshastigheter av NL enzymer eller nedbrytning av NL-arter over tid.

I denne protokollen har vi vist at merking, deteksjon og kvantifisering av NL-arter kan oppnås ved 14C-eddiksyre metabolsk merking. Store NL-arter kan separeres i et løsningsmiddelsystem på 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleum eter:Diethyl ether:Acetic acid (Figur 1A,B). Fosforavbildning gjør det mulig å visualisere merket fri fettsyre (FFA), triacylglyserol (TG), diacylglyserol (DG), kolesterol (Chol) og squalene (SQ) (Figur 1A</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Her presenteres en protokoll for metabolsk merking av gjær med 14C-eddiksyre, som er kombinert med tynn lagkromatografi for separasjon av nøytrale lipider.

Analyse av nøytral lipidsyntese i saccharomyces cerevisiae ved metabolsk merking og tynn lagkromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Denne teknikken bruker instrumenter som vanligvis finnes i de fleste laboratoriemiljøer og muliggjør analyse av flere prøver samtidig. Denne metoden kan gi viktig innsikt i hvordan lipidmetabolismenzymer reguleres i cellulær kontekst og i ulike genetiske bakgrunner. Inokuler en koloni fra en gjærkulturplate til 20 milliliter SC-medier som inneholder 2% dextrose og inkuberer ved 30 grader Celsius for natten med risting ved 200 rpm.Neste dag fortynner du kulturen i 50 milliliter ferske medier til en endelig OD på 0,2 og vokser den i 24 timer til den stasjonære fasen er nådd. Forbered to 20 milliliter aliquots av slukkebuffer for hver prøve og lagre dem på minus 80 grader Celsius. Lag samtidig radiomerkingsmedier ved å tilsette natriumsalt av eddiksyre til dekstrosefrie SC-medier ved en endelig konsentrasjon på 10 mikrocurie per milliliter.Samle cellene ved sentrifugering ved 4,100 x g i 10 minutter. Fjern supernatanten og vask cellepellet en gang med 20 milliliter dekstrosefrie SC-medier. Samle cellene igjen ved sentrifugering på 4, 100 x g i fem minutter og overfør dem til et merket to milliliter mikrosenterrør ved hjelp av dextrousfrie medier.Sentrifuger cellene i ytterligere to minutter. Resuspend cellene i 500 mikroliter av dextrose gratis SC media og begynne radiolabeling perioden ved raskt å legge 500 mikroliter av radiolabeling media til hver celle suspensjon. Inkuber rørene i en roterende inkubator ved 30 grader Celsius i 20 minutter.I mellomtiden, forkjøl sentrifugen utstyrt for 50 milliliter koniske rør til minus 10 grader Celsius og tine en 20 milliliter aliquots av slukkebuffer. Når radiomerkingsperioden er over, bruk en pipette til å kaste hele den ene milliliterprøven inn i tint slukkebuffer på is. Samle cellepellet ved å spinne i en ferdigkjølt sentrifuge ved 5000 x g i tre minutter og tilsett 20 milliliter fersk kald slukkebuffer.Virvel og rist prøvene for å resuspendere dem helt i slukkebuffer og sentrifugere prøvene igjen for å samle cellene. Når cellene er pelletert, fjern grundig all slukkebuffer fra prøvene ved å helle av supernatanten og fjerne overskuddet med en pipette. Oppbevar rørene på minus 80 grader Celsius for videre behandling.Vei 0,3 gram syrevaskede glassperler for hver prøve og oppbevar dem i to milliliter mikrocentrifugerør på is. Fjern cellepellets fra minus 80 graders fryser og legg dem på is. Tilsett deretter 350 mikroliter metanol og 700 mikroliter kloroform til hver prøve og resuspend cellene.Overfør dem til mikro sentrifugerør som inneholder forhåndsveide glassperler. Lyse cellene ved å virvelere tre ganger i ett minutt, med 30 sekunder inkubasjon på is mellom agitasjoner. Hell cellene i et 15 milliliter glass sentrifugerør og merk røret som rør A.Vask mikrocentrifugerøret med en milliliter metanol, virvel det, og hell metanol i rør A.Tilsett to milliliter kloroform etterfulgt av 400 mikroliter vann til rør A for et endelig prøvevolum på 4,45 milliliter.Virvel prøvene i ett minutt etterfulgt av en fem minutters sentrifugering ved 1000 x g for å tydelig skille de vandige og organiske fasene med cellerester som ligger ved grensesnittet. Bruk en glassbeitepipette, samle den organiske fasen i et nytt glass sentrifugerør merket B og tilsett en milliliter av en molar kaliumklorid. Tilsett en milliliter metanol og to milliliter kloroform i rør A og gjenta virvel- og sentrifugeringstrinnene.Virvel- og sentrifugerør B for å skille den vandige og organiske fasen. Fjern det øvre vandige laget og samle hele det nederste organiske laget i et fire milliliter hetteglass. Fordamp oppløsningsvæsken helt fra lipidekstraktene ved å tørke under inertgass og forvarme en ovn til 145 grader Celsius for oppvarming av TLC-platen.Bestem relative mengder radiomerke tatt opp av cellene før du laster dem på TLC-platen. Rekonstituer prøvelipidene i 40 til 50 mikroliter kloroform og metanol blandet med et en-til-en-forhold ved å virvelere i fem minutter. Forbered 101 milliliter av det mobile faseløsningsmidlet i en glassutdannet sylinder.Hell deretter oppløsningsvæsken i et TLC-kammer i glass som inneholder en 20 x 20 TLC metningspute og et tettsittende lokk. Forbered en kanalisert 20 x 20 silikagel 60G plate og merk en linje 1,5 centimeter over bunnen av platen ved hjelp av en blyant. Når platen er tilstrekkelig oppvarmet og TLC-metningsputen er mettet med løsningsmiddel, fjern TLC-platen fra ovnen og fortsett umiddelbart å laste den.Bruk en pipette for å få øye på fem mikroliter prøve på opprinnelsen til hvert kjørefelt som ligger 1,5 centimeter over bunnen av TLC-platen og gjenta lastingen til 20 til 40 mikroliter prøve er lastet inn i hvert kjørefelt. Når standarden og prøvene er lastet, plasserer du platen i utviklingskammeret og venter til løsningsmidlet har nådd toppen av platen. Når platen er ferdig utviklet, fjern den fra kammeret og la den tørke i avtrekkshetten i 20 minutter.Etter at platen er tørket, dekk den med plastfilm og legg den i en utviklende kassett med en autoradiografiskjerm. Fjern skjermen fra den utviklende kassetten og plasser den inne i en fosforbilde. Spray TLC-platen med p-Anisaldehyd reagens til silikaen er mettet, og stek den deretter i en 145 graders ovn i fem minutter eller til båndene har dukket opp.For å kvantifisere lipidarter, skrap silikagelen som inneholder individuelle lipidarter og overfør dem til glassskrapingsflasker. Tilsett seks milliliter scintillasjonsvæske og virvel kraftig til silikabåndet er redusert til små biter. Plasser stativet med scintillation hetteglassene i en scintillation counter og tell ved å justere telletiden til to minutter per hetteglass.Fosforavbildning gjør det mulig å visualisere autoradiogram av etikettfri fettsyre, triacylglyserol, diacylglyserol, kolesterol og squalane. Det ble demonstrert at rensede lipidarter kan skilles i denne metoden og deretter visualiseres ved sprøyting av TLC-platen med p-Anisaldehyde reagens. Visualiserte arter inkluderer alle tidligere nevnte lipider i tillegg til sterile estere.Ved å bruke en 10 minutters jaktperiode i radiolabelfrie medier etter pulsen, ble det observert ved det store bassenget av squalane forsvant og totalt kolesterol ble forhøyet. På samme måte korrelerte utseendet på diacylglyserol i jaktperioden med en reduksjon i det frie fettsyresignalet. Før du utfører hele protokollen, er det viktig å avgjøre om cellene vil ta opp eddiksyreradiomerket i veksttilstanden og genetisk bakgrunn av interesse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utnyttelse av Grafix for påvisning av forbigående interagere av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Merking og visualisering av mitokondriegenomuttrykksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Vurdering av lokalisering av submitochondrialprotein i spirende gjær saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Måling av proteinomsetningshastigheter i senescent og ikke-dele kultivert celler med metabolsk merking og massespektrometri

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...