Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
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Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Henne por ajuda e conselhos conceituais na conclusão deste estudo. O W.M.H. é apoiado por fundos da Fundação Welch (I-1873), do NIH NIGMS (GM119768), do Ara Paresghian Medical Research Fund e do UT Southwestern Endowed Scholars Program. A S.R foi apoiada por uma bolsa do programa T32 (5T32GM008297).

1. Crescimento e rotulagem de células de levedura com ácido acético de 14C
<ol><li>Inocular uma cultura de levedura, escolhendo uma colônia de um prato e distribuindo-a em 20 mL de mídia sintética completa (SC) contendo 2% de dextrose (ver Arquivo Suplementar para a receita de mídia SC). Incubar a 30 °C durante a noite com agitação a 200 rpm. NOTA: Condição de crescimento, volume amostral e tratamento diferem com base nos lipídios de interesse. Antes de realizar experimentos ...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. 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K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

Aqui, é apresentado um versátil protocolo de radiolabeling para monitorar quantitativamente a síntese de espécies de NL na levedura. Este protocolo é muito modular, o que permite que o procedimento seja concluído dentro de 3-6 dias. Além disso, existe uma riqueza de literatura sobre o uso de TLC para separar espécies lipídicas e metabólitos, o que deve permitir ao usuário detectar várias espécies lipídicas de interesse com uma simples mudança dos sistemas de solventes TLC16,</s...

Acetil-CoA é o bloco fundamental de construção de diversas biomoléculas, incluindo lipídios neutros (NLs), que servem como uma moeda biomolecular versátil para a construção de membranas, geração de ATP e regulação da sinalização celular1,2. A disponibilidade de NLs a serem desviados para qualquer uma dessas respectivas vias é, em parte, regulada pelo seu armazenamento. Gotículas lipídicas (LDs), organelas citoplasmáticas compostas de núcleos hidrofóbicos de triglicérides (TGs) e esterol-ésteres (SEs), são os principais compartimentos de armazenamento da maioria dos NLs celulares. Sendo assim, os LDs sequeram e regulam as NLs, que podem ser degradadas e posteriormente utilizadas para processos bioquímicos e metabólicos3,4. Sabe-se que a má regulação das proteínas associadas à NL e LD está correlacionada com o surgimento de patologias, incluindo lipodistrofia e síndromes metabólicas5,6. Por causa disso, a pesquisa atual de LD está intensamente focada em como a síntese de NL é regulada espacialmente, temporalmente e através de tecidos distintos de organismos multicelulares. Devido aos papéis celulares onipresentes para as NLs, muitas enzimas responsáveis pela síntese e regulação das NLs são conservadas ao longo dos eucariotes7. De fato, até alguns procariotes armazenam NLs em LDs8. Portanto, organismos modelos geneticamente tratáveis, como saccharomyces cerevisiae (levedura brotante) têm sido úteis para o estudo da síntese e regulação da NL.
A separação e quantificação dos NLs dos extratos celulares pode ser realizada de uma infinidade de formas, incluindo espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa líquida de ultra-desempenho (UPLC-MS)9,10,11. Talvez o método mais simples para separar NLs seja através da cromatografia de camada fina (TLC), que permite quantificação densitométrica subsequente a partir de uma curva padrão12,13. Embora o TLC forneça apenas uma separação de NLs em termos de curso, ela continua sendo uma técnica poderosa porque é barata, e permite a rápida separação de NLs de várias amostras simultaneamente. Dois dos desafios mais consideráveis enfrentados pelo estudo dos NLs via TLC são: 1) a ampla gama de abundâncias celulares de espécies NL e seus intermediários, e 2) a faixa de hidrofilicidade/hidrofobiidade de intermediários lipídicos dentro das vias de síntese da NL. Consequentemente, a quantificação das espécies de NL via TLC é tipicamente restrita às espécies mais abundantes; no entanto, a introdução de um rádio de ácido 14C-acético pode aumentar significativamente a detecção de intermediários de baixa abundância dentro de vias NL. O ácido acético é rapidamente convertido em acetil-CoA pelo acetil-CoA synthetase ACS214, que faz do ácido acético 14C um substrato de radiolabeling adequado na levedura15. Além disso, a separação tanto de NLs hidrofóbicos quanto de intermediários hidrofílicos de NLs pode ser alcançada pela TLC através do uso de múltiplos sistemas de solventes16. Aqui, é apresentado um método para a separação de NLs usando rotulagem metabólica de ácido acético de 14C na levedura. Os lipídios rotulados durante o período de pulso são posteriormente isolados por um protocolo de isolamento lipíduo total bem estabelecido17,seguido pela separação de espécies NL por TLC. O desenvolvimento de placas TLC tanto pela autoradiografia para visualizar lipídios rotulados, quanto um spray químico para visualizar lipídios totais, permite múltiplos métodos de quantificação. Bandas lipídicas individuais também podem ser facilmente extraídas da placa TLC usando uma lâmina de barbear, e a contagem de cintilação pode ser usada para quantificar a quantidade de material radiolabeled dentro da banda.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

Lipídios neutros (NLs) são uma classe de biomoléculas hidrofóbicas e sem carga que desempenham papéis-chave na energia e homeostase lipídica. Os NLs são sintetizados de novo a partir de acetil-CoA e estão principalmente presentes em eucariotes na forma de triglicérides (TGs) e esterol-ésteres (SEs). As enzimas responsáveis pela síntese de NLs são altamente conservadas de Saccharomyces cerevisiae (levedura) para humanos, tornando a levedura um organismo modelo útil para dissecar a função e regulação das enzimas do metabolismo NL. Embora se saiba muito sobre como o acetil-CoA é convertido em um conjunto diversificado de espécies NL, mecanismos para regular enzimas do metabolismo NL, e como a regulação errada pode contribuir para patologias celulares, ainda estão sendo descobertos. Inúmeros métodos de isolamento e caracterização de espécies de NL foram desenvolvidos e utilizados ao longo de décadas de pesquisa; no entanto, um protocolo quantitativo e simples para a caracterização abrangente das principais espécies de NL não foi discutido. Aqui, é apresentado um método simples e adaptável para quantificar a síntese de nova das principais espécies de LN na levedura. Aplicamos 14rotulagem metabólica de ácido acético C juntamente com cromatografia de camada fina para separar e quantificar uma gama diversificada de NLs fisiologicamente importantes. Além disso, este método pode ser facilmente aplicado para estudar taxas de reação in vivo de enzimas NL ou degradação de espécies NL ao longo do tempo.

Neste protocolo, demonstramos que a rotulagem, detecção e quantificação de espécies NL podem ser realizadas por rotulagem metabólica de ácido acético C de 14C. As principais espécies de NL podem ser separadas em um sistema solvente de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter de diethyl:Ácido acético (Figura 1A, B). A imagem do fósforo permite a visualização de ácido graxo livre rotulado (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), ...

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Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ácido acético de 14C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Esta técnica utiliza instrumentos comumente encontrados na maioria dos ambientes laboratoriais e permite a análise de várias amostras simultaneamente. Este método pode fornecer insights-chave sobre como enzimas de metabolismo lipídico são reguladas em um contexto celular e em diferentes origens genéticas. Inocular uma colônia de uma placa de cultura de levedura em 20 mililitros de mídia SC contendo 2% de dextrose e incubar a 30 graus Celsius durante a noite com agitação a 200 rpm.No dia seguinte, diluir a cultura em 50 mililitros de mídia fresca para um OD final de 0,2 e cultivá-la por 24 horas até que a fase estacionária seja atingida. Prepare duas alíquotas de 20 mililitros de tampão para cada amostra e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Simultaneamente, prepare a mídia de rotulagem de radiolateração adicionando sal de sódio ácido acético à mídia SC livre dextrose em uma concentração final de 10 microcurie por mililitro.Recolher as células por centrifugação a 4,100 x g por 10 minutos. Remova o supernatante e lave a pelota celular uma vez com 20 mililitros de mídia SC livre de dextrose. Colete as células novamente por centrifugação a 4,100 x g por cinco minutos e transfira-as para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros rotulados usando mídia livre dextrous.Centrifugar as células por mais dois minutos. Resuspenja as células em 500 microliters de mídia SC livre de dextrose e inicie o período de radiolabeling adicionando rapidamente 500 microliters de mídia de radiolabeling a cada suspensão celular. Incubar os tubos em uma incubadora rotativa a 30 graus Celsius por 20 minutos.Enquanto isso, pré esfrie a centrífuga equipada para tubos cônicos de 50 mililitros a menos 10 graus Celsius e descongele uma alíquota de 20 mililitros de tampão de saciamento. Uma vez que o período de rotulagem de rádio tenha terminado use uma pipeta para mergulhar toda a amostra de um mililitro em tampão descongelado no gelo. Colete a pelota de célula girando em uma centrífuga pré-resfriada a 5.000 x g por três minutos e adicione 20 mililitros de tampão frio fresco.Vórtice e agitar as amostras para resususpensá-las em saciar tampão e centrifugar as amostras novamente para coletar as células. Uma vez que as células sejam pelotas, remova completamente todo o tampão saciado das amostras derramando o sobrenatário e removendo o excesso com uma pipeta. Armazene os tubos a menos 80 graus Celsius para posterior processamento.Pesar 0,3 gramas de contas de vidro lavadas com ácido para cada amostra e armazená-las em dois tubos de microcentrífugo mililitro no gelo. Remova as pelotas de células do congelador de menos 80 graus e coloque-as no gelo. Em seguida, adicione 350 microliters de metanol e 700 microliters de clorofórmio a cada amostra e resuspenja as células.Transfira-os para tubos de micro centrífugas contendo contas de vidro pré-pesadas. Lyse as células vórtices três vezes por um minuto, com 30 segundos de incubação no gelo entre agitações. Despeje as células em um tubo de centrífuga de vidro de 15 mililitros e rotule o tubo como tubo A.Lave o tubo de microcentrífuga com um mililitro de metanol, vórtice, e despeje o metanol no tubo A.Adicione dois mililitros de clorofórmio seguidos por 400 microliters de água para tubo A para um volume final de amostra de 4,45 mililitros.Vórtice as amostras por um minuto seguido de uma centrifugação de cinco minutos a 1000 x g para separar claramente as fases aquosas e orgânicas com detritos celulares deitados na interface. Usando uma pipeta de pastagem de vidro, colete a fase orgânica em um novo tubo de centrífuga de vidro rotulado B e adicione um mililitro de um cloreto de potássio molar. Adicione um mililitro de metanol e dois mililitros de clorofórmio ao tubo A e repita os passos de vórtice e centrífugação.Vórtice e tubo de centrífuga B para separar a fase aquosa e orgânica. Remova a camada aquosa superior e colete toda a camada orgânica inferior em um frasco de vidro de quatro mililitros. Evaporar completamente o solvente dos extratos lipíduos secando sob gás inerte e pré-aquecer um forno a 145 graus Celsius para aquecer a placa TLC.Determine quantidades relativas de radiolabel tomadas pelas células antes de carregá-las na placa TLC. Reconstitua os lipídios amostrais em 40 a 50 microlitres de clorofórmio e metanol misturados a uma proporção de um para um por vórtice por cinco minutos. Prepare 101 mililitros do solvente de fase móvel em um cilindro graduado em vidro.Em seguida, despeje o solvente em uma câmara TLC de vidro contendo uma almofada de saturação de 20 por 20 TLC e uma tampa apertada de encaixe. Prepare uma placa canalizada de 20 por 20 gel de sílica 60G e marque uma linha 1,5 centímetros acima da parte inferior da placa usando um lápis. Uma vez que a placa tenha sido suficientemente aquecida e a almofada de saturação TLC esteja saturada com solvente, remova a placa TLC do forno e continue imediatamente a carregá-la.Usando uma pipeta, localize cinco microliters de amostra sobre a origem de cada pista localizada 1,5 centímetros acima da parte inferior da placa TLC e repita o carregamento até que 20 a 40 microliters de amostra tenha sido carregado em cada pista. Uma vez que o padrão e as amostras tenham sido carregadas, coloque a placa na câmara em desenvolvimento e espere até que o solvente chegue ao topo da placa. Quando a placa estiver totalmente desenvolvida, remova-a da câmara e deixe-a secar no capô da fumaça por 20 minutos.Depois que a placa estiver seca, cubra-a com filme plástico e coloque-a em um em desenvolvimento com uma tela autordiografia. Remova a tela do em desenvolvimento e coloque-a dentro de um imager de fósforo. Pulverize a placa TLC com reagente p-Anisaldeído até que a sílica esteja saturada, depois asse em forno de 145 graus por cinco minutos ou até que as bandas tenham aparecido.Para quantificar espécies lipídicas, raspe o gel de sílica contendo espécies lipídicas individuais e transfira-as para frascos de cintilação de vidro. Adicione seis mililitros de fluido de cintilação e vórtice vigorosamente até que a banda de sílica tenha sido reduzida a pequenos pedaços. Coloque o rack com os frascos de cintilação em um contador de cintilação e conte ajustando o tempo de contagem para dois minutos por frasco.A imagem do fósforo permite a visualização de autordiograma de ácido graxo sem rótulo, triacylglicerol, diacylglycerol, colesterol e esqualano. Foi demonstrado que espécies lipídicas purificadas podem ser separadas neste método e posteriormente visualizadas pela pulverização da placa TLC com reagente p-Anisaldeído. Espécies visualizadas incluem todos os lipídios mencionados anteriormente, além de ésteres estéreis.Aplicando um período de perseguição de 10 minutos na mídia sem rótulo de rádio após o pulso, foi observado na maior piscina de esqualano desaparecido e o colesterol total foi elevado. Da mesma forma, o aparecimento de diacilglicerol no período de perseguição correlaciona-se com uma diminuição no sinal de ácidos graxos livres. Antes de realizar o protocolo completo, é importante determinar se as células irão captar o radiolabel ácido acético na condição de crescimento e no histórico genético de interesse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Bioquímica

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...