Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Författarna vill tacka medlemmarna i Henne-labbet för hjälp och konceptuell rådgivning i slutförandet av denna studie. W.M.H. stöds av medel från Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund och UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R har fått stöd av ett T32-programbidrag (5T32GM008297).

1. Tillväxt och märkning av jästceller med 14C-ättiksyra
<ol><li>Inokulera en jästkultur genom att välja en koloni från en tallrik och dela ut den i 20 ml syntetiskt komplett (SC) medium som innehåller 2% dextros (se Kompletterande fil för receptet på SC-media). Inkubera vid 30 °C för natten med skakningar vid 200 varv/min. OBS: Tillväxttillstånd, provvolym och behandling kommer att skilja sig åt beroende på lipider av intresse. Innan fullständiga experiment körs bör op...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+biogenesis.">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li><li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets.">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+atherosclerosis:+A+perspective+for+the+1990s.">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li><li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet:+A+conserved+cellular+organelle.">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li><li>W&#228;ltermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes:+How+bacteria+fatten+up:+Lipid-body+formation+in+prokaryotes.">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li><li>Borrull, A., L&#243;pez-Mart&#237;nez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Roz&#232;s, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li><li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

Här presenteras ett mångsidigt radiomärkningsprotokoll för att kvantitativt övervaka syntesen av NL-arter i jäst. Detta protokoll är mycket modulärt, vilket gör att proceduren kan avslutas inom 3-6 dagar. Dessutom finns det en mängd litteratur om användningen av TLC för att separera lipidarter och metaboliter, vilket bör göra det möjligt för användaren att upptäcka flera lipidarter av intresse med en enkel förändring av TLC-lösningsmedelssystem16,1...

Acetyl-CoA är den grundläggande byggstenen i olika biomolekyler inklusive neutrala lipider (NLs), som fungerar som en mångsidig biomolekylär valuta för att bygga membran, generera ATP och reglera cellsignalering1,2. Tillgången till NLs som ska shuntas in i någon av dessa respektive vägar regleras delvis av deras lagring. Lipiddroppar (LD), cytoplasmiska organeller bestående av hydrofoba kärnor av triglycerider (TGs) och sterolestrar (SEs), är de viktigaste förvaringsfacken för de flesta cellulära NLs. Som sådan spärrar och reglerar LDs NLs, som kan försämras och därefter användas för biokemiska och metaboliska processer3,4. Det är känt att felreglering av NL och LD-associerade proteiner är korrelerad med uppkomsten av patologier inklusive lipodystrofi och metabola syndrom5,6. På grund av detta är nuvarande LD-forskning intensivt inriktad på hur NL-syntesen regleras rumsligt, tidsmässigt och över distinkta vävnader av multicellulära organismer. På grund av de allestädes närvarande cellulära rollerna för NLs, många enzymer som ansvarar för syntes och reglering av NLs bevaras i hela eukaryoter7. Faktum är att även vissa prokaryoter lagrar NLs i LDs8. Därför har genetiskt kanterbara modellorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirande jäst) varit användbara för studier av NL-syntes och reglering.
Separation och kvantifiering av NLs från cell extrakt kan åstadkommas på en mängd olika sätt, inklusive gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), högpresterande flytande kromatografi (HPLC) och ultra-prestanda flytande kromatografi-masspektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Kanske är den enklaste metoden för att separera NLs via tunn lagerkromatografi (TLC), vilket möjliggör efterföljande densitometrisk kvantifiering från enstandardkurva 12,13. Även om TLC endast ger en kurskornig separation av NLs, är det fortfarande en kraftfull teknik eftersom det är billigt, och det möjliggör snabb separation av NLs från flera prover samtidigt. Två av de viktigaste utmaningarna som studien av NLs via TLC står inför är: 1) det breda utbudet av cellulära överflöd av NL-arter och deras intermediärer, och 2) utbudet av hydrofilicitet/hydrofobi för lipid intermediärer inom NL syntesvägar. Kvantifieringen av NL-arter via TLC är därför vanligtvis begränsad till de vanligaste arterna. Införandet av en 14C-ättiksyra radiolabel kan dock avsevärt förbättra upptäckten av låg överflöd intermediärer inom NL vägar. Ättiksyra omvandlas snabbt till acetyl-coa av acetyl-CoA-syntas ACS214, vilket gör 14C-ättiksyra till ett lämpligt radiomärkningssubstrat i jäst15. Dessutom kan separation av både hydrofoba NLs och hydrofila intermediärer av NLs uppnås genom TLC genom användning av flera lösningsmedelssystem16. Här presenteras en metod för separation av NLs med 14C-ättiksyra metabolisk märkning i jäst. Lipider märkta under pulsperioden isoleras därefter av ett väletablerat totalt lipidisoleringsprotokoll17, följt av separation av NL-arter med TLC. Utveckling av TLC-plattor genom både autoradiografi för att visualisera märkta lipider och en kemisk spray för att visualisera totala lipider, tillåter flera kvantifieringsmetoder. Enskilda lipidband kan också enkelt extraheras från TLC-plattan med hjälp av ett rakblad, och scintillationsräkning kan användas för att kvantifiera mängden radiomärkt material i bandet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

Neutrala lipider (NLs) är en klass hydrofoba, laddningsfria biomolekyler som spelar nyckelroller i energi och lipidhomeostas. NLs är syntetiserade de novo från acetyl-CoA och finns främst i eukaryoter i form av triglycerider (TGs) och sterol-estrar (SEs). Enzymerna som ansvarar för syntesen av NLs är mycket bevarade från Saccharomyces cerevisiae (jäst) till människor, vilket gör jäst till en användbar modellorganism för att dissekera funktionen och regleringen av NL metabolism enzymer. Medan mycket är känt om hur acetyl-CoA omvandlas till en mångfald av NL arter, mekanismer för reglering NL metabolism enzymer, och hur felreglering kan bidra till cellulära patologier, fortfarande upptäcks. Många metoder för isolering och karakterisering av NL-arter har utvecklats och använts under årtionden av forskning. Ett kvantitativt och enkelt protokoll för omfattande karakterisering av större NL-arter har dock inte diskuterats. Här presenteras en enkel och anpassningsbar metod för att kvantifiera de novo-syntesen av större NL-arter i jäst. Vi tillämpar 14C-ättiksyra metabolisk märkning i kombination med tunn lagerkromatografi för att separera och kvantifiera ett varierat utbud av fysiologiskt viktiga NLs. Dessutom kan denna metod enkelt tillämpas för att studera in vivo reaktionshastigheter av NL enzymer eller nedbrytning av NL arter över tid.

I detta protokoll har vi visat att märkning, detektion och kvantifiering av NL-arter kan åstadkommas genom 14C-ättiksyra metabolisk märkning. Större NL-arter kan separeras i ett lösningsmedelssystem på 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleumeter:Dietyleter:Ättiksyra (Figur 1A, B). Fosforavbildning möjliggör visualisering av märkt fri fettsyra (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) och squalene (SQ) (Figur...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Här presenteras ett protokoll för metabolisk märkning av jäst med 14C-ättiksyra, som är i kombination med tunn lagerkromatografi för separation av neutrala lipider.

Analys av neutral lipidsyntes i Sackaromyces cerevisiae av metabolisk märkning och tunnskiktskromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Denna teknik använder instrument som ofta finns i de flesta laboratoriemiljöer och möjliggör analys av flera prover samtidigt. Denna metod kan ge viktiga insikter om hur lipidmetabolismenzymer regleras i ett cellulärt sammanhang och i olika genetiska bakgrunder. Inokulera en koloni från en jästkulturplatta till 20 milliliter SC-media som innehåller 2%dextros och inkubera vid 30 grader Celsius för natten med skakningar vid 200 rpm.Nästa dag späd kulturen i 50 milliliter färska medier till en slutlig OD på 0,2 och odla den i 24 timmar tills den stationära fasen nås. Förbered två 20 milliliter alikvoter av släckbuffert för varje prov och lagra dem på minus 80 grader Celsius. Förbered samtidigt radiomärkningsmedier genom att tillsätta ättiksyranatriumsalt till dextrosfria SC-medier vid en slutlig koncentration av 10 mikrocurie per milliliter.Samla cellerna genom att centrifugera vid 4 100 x g i 10 minuter. Ta bort supernatanten och tvätta cellpelleten en gång med 20 milliliter dextrosfria SC-medier. Samla cellerna igen genom att centrifugera vid 4 100 x g i fem minuter och överför dem till ett märkt två milliliter mikrocentrifugrör med hjälp av dextrous fria medier.Centrifuga cellerna i ytterligare två minuter. Återanvänd cellerna i 500 mikroliter dextros fria SC-media och börja radiomärkningsperioden genom att snabbt lägga till 500 mikroliter radiomärkningsmedier till varje cellupphängning. Inkubera rören i en roterande inkubator vid 30 grader Celsius i 20 minuter.Under tiden, förkyl centrifugen utrustad för 50 milliliter koniska rör till minus 10 grader Celsius och tina en 20 milliliter alikvoter av släckbuffert. När radiomärkningsperioden är slut använder du en pipett för att doppa hela provet på en milliliter i tinad släckbuffert på is. Samla cellpelleten genom att snurra i en förkyld centrifuge vid 5 000 x g i tre minuter och tillsätt 20 milliliter färsk kallsläckningsbuffert.Virvel och skaka proverna för att helt återanvända dem i släckbufferten och centrifugera proverna igen för att samla in cellerna. När cellerna har pellets, ta noggrant bort all släckningsbuffert från proverna genom att hälla av supernaten och ta bort överskottet med en pipett. Förvara rören på minus 80 grader Celsius för vidare bearbetning.Väg 0,3 gram syratvättade glaspärlor för varje prov och förvara dem i två milliliter mikrocentrifugrör på is. Ta bort cellpelletsen från minus 80 graders frys och lägg dem på is. Tillsätt sedan 350 mikroliter metanol och 700 mikroliter kloroform till varje prov och återanvänd cellerna.Överför dem till mikrocentrifugrör som innehåller förvägda glaspärlor. Lyse cellerna genom att virvla tre gånger i en minut, med 30 sekunders inkubation på is mellan agitationer. Häll cellerna i ett 15 milliliter glascentrifugrör och märk röret som rör A.Tvätta mikrocentrifugröret med en milliliter metanol, virvel det, och häll metanol i rör A.Tillsätt två milliliter kloroform följt av 400 mikroliter vatten till rör A för en slutlig provvolym på 4,45 milliliter.Virvelproverna i en minut följt av en fem minuters centrifugering vid 1000 x g för att tydligt separera vattenhaltiga och organiska faser med cellrester som ligger vid gränssnittet. Använd en glasbetespipett, samla den organiska fasen i ett nytt glascentrifugrör märkt B och tillsätt en milliliter av en molaliumklorid. Tillsätt en milliliter metanol och två milliliter kloroform till rör A och upprepa virvel- och centrifugeringsstegen.Virvel- och centrifugerör B för att separera vattenfasen och den organiska fasen. Ta bort det övre vattenskiktet och samla hela det nedre organiska lagret i en fyra milliliter glasflaska. Avdunsta lösningsmedlet helt från lipidextrakten genom att torka under inert gas och förvärma en ugn till 145 grader Celsius för uppvärmning av TLC-plattan.Bestäm relativa mängder radiolabel som tas upp av cellerna innan de lastas på TLC-plattan. Reconstitute provet lipider i 40 till 50 mikroliter kloroform och metanol blandas i ett 1-1-förhållande genom att virvla i fem minuter. Förbered 101 milliliter av det mobila faslösningsmedlet i en glasklassad cylinder.Häll sedan lösningsmedlet i en TLC-kammare i glas som innehåller en 20 av 20 TLC mättnadsdyna och ett tätt passande lock. Förbered en kanaliserad 20 av 20 kiselgel 60G-platta och markera en linje 1,5 centimeter över botten av plattan med en penna. När plattan har värmts upp tillräckligt och TLC-mättnadsdynan är mättad med lösningsmedel, ta bort TLC-plattan från ugnen och fortsätt omedelbart att ladda den.Använd en pipett och placera fem mikroliter prov på varje körfälts ursprung som ligger 1,5 centimeter ovanför botten av TLC-plattan och upprepa lastningen tills 20 till 40 mikroliter prov har lastats in i varje körfält. När standarden och proverna har laddats placerar du plattan i utvecklingskammaren och väntar tills lösningsmedlet har nått toppen av plattan. När plattan är fullt utvecklad, ta bort den från kammaren och låt den torka i rökhuven i 20 minuter.När plattan har torkats, täck den med plastfilm och placera den i en utvecklande kassett med en autoradiografiskärm. Ta bort skärmen från den utvecklande kassetten och placera den inuti en fosforbildare. Spraya TLC-plattan med p-Anisaldehyd reagens tills kiseldioxiden är mättad och grädda den sedan i en 145 graders ugn i fem minuter eller tills band har dykt upp.För att kvantifiera lipidarter skrapa kiselgelen som innehåller enskilda lipidarter och överför dem till glasscintillationsflaskor. Tillsätt sex milliliter scintillationsvätska och virvel kraftigt tills kiseldioxidbandet har reducerats till små bitar. Placera racket med scintillationsflaskan i en scintillationsräknare och räkna genom att justera räknetiden till två minuter per flaska.Fosforavbildning möjliggör visualisering av autoradiogram av etikettfri fettsyra, triacylglycerol, diacylglycerol, kolesterol och squalane. Det visades att renade lipidarter kan separeras i denna metod och därefter visualiseras genom sprutning av TLC-plattan med p-anisaldehydreagens. Visualiserade arter inkluderar alla tidigare nämnda lipider förutom sterila estrar.Genom att tillämpa en 10 minuters jaktperiod i radiolabel-fria medier efter pulsen observerades det vid den stora poolen av squalane försvann och totalt kolesterol var förhöjt. På samma sätt korrelerade utseendet på diacylglycerol under jaktperioden med en minskning av de fria fettsyrorna signalen. Innan du utför hela protokollet är det viktigt att avgöra om cellerna kommer att upptag av ättiksyraradiabeln i tillväxttillståndet och genetisk bakgrund av intresse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analys av peptidoglykan genom vätskekromatografi, masspektrometri och bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Användning av Grafix för påvisande av transienta interactorer av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Märkning och visualisering av mitokondriella genomuttrycksprodukter i bagerijäst Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Bedömning av inochondriell proteinlokalisering i spirande jäst sackaromyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mätning av proteinomsättningshastigheter i senescenta och icke-delande odlade celler med metabolisk märkning och masspektrometri

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...