Name: analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Yazarlar, bu çalışmanın tamamlanmasında yardım ve kavramsal tavsiyeler için Henne laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W.M.H., Welch Vakfı (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Tıbbi Araştırma Fonu ve UT Southwestern Endowed Scholars Programı'ndan fonlarla desteklenmektedir. S.R, bir T32 programı hibesi (5T32GM008297) tarafından desteklenmiştir.

1. Maya hücrelerinin 14C-asetik asit ile büyümesi ve etiketlenerek etiketlenerek
<ol><li>Bir tabaktan bir koloni seçerek ve % 2 dekstroz içeren 20 mL sentetik komple (SC) ortama dağıtarak bir maya kültürünü aşılayın (BKZ. SC ortamı tarifi için Ek Dosya). 200 rpm'de sallanarak bir gece boyunca 30 °C'de kuluçkaya yaslanın. NOT: Büyüme durumu, örnek hacmi ve tedavi, ilgi çekici lipitlere göre farklılık gösterecektir. Tam deneyler yapmadan önce, optimal büyüme ko...

<ol>
	<li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis.">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li><li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions.">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li><li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+biogenesis.">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li><li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets.">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+atherosclerosis:+A+perspective+for+the+1990s.">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li><li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet:+A+conserved+cellular+organelle.">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li><li>W&#228;ltermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes:+How+bacteria+fatten+up:+Lipid-body+formation+in+prokaryotes.">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li><li>Borrull, A., L&#243;pez-Mart&#237;nez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Roz&#232;s, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li><li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux.">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).</li><li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling.">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li><li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis.">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li><li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+[RNQ+]+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles.">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006 (2018).</li><li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).</li><li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li><li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation.">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Bligh+and+Dyer"+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents.">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state.">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li></ol>

Burada, mayadaki NL türlerinin sentezini nicel olarak izlemek için çok yönlü bir radyolabeling protokolü sunulmuştur. Bu protokol çok modülerdir, bu da prosedürün 3-6 gün içinde bitmesine izin verir. Ek olarak, kullanıcının TLC solvent sistemlerinin basit bir değişikliği ile ilgi çekici birkaç lipit türünü tespit etmesine izin vermeli olan lipit türlerini ve metabolitleri ayırmak için TLC kullanımı hakkında çok sayıda literatürvardır 16,<sup class="xref...

Asetil-CoA, membran oluşturmak, ATP üretmek ve hücre sinyalini düzenlemek için çok yönlü bir biyomoleküler para birimi olarak hizmet veren nötr lipitler (NL' ler) dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküllerin temel yapı taşıdır1,2. Bu ilgili yollardan herhangi birine sokılacak NL'lerin kullanılabilirliği, kısmen depolamaları tarafından düzenlenir. Lipid damlacıkları (LD'ler), trigliseritlerin hidrofobik çekirdeklerinden (TG' ler) ve sterol esterlerinden (SE) oluşan sitoplazmik organeller, çoğu hücresel NCI'nın ana depolama bölmeleridir. Bu nedenle, LD'ler, biyokimyasal ve metabolik süreçler için bozulabilen ve daha sonra kullanılabilecekNL'leriinzal eder ve düzenler 3,4. NL ve LD ilişkili proteinlerin yanlış düzenlenmesinin lipodystrofi ve metabolik sendromlar5,6dahil olmak üzere patolojilerin başlangıcı ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, mevcut LD araştırmaları yoğun bir şekilde NL sentezinin mekansal, zamansal ve çok hücreli organizmaların farklı dokularında nasıl düzenlendiğine odaklanmıştır. NL'ler için her yerde bulunan hücresel roller nedeniyle, NL'lerin sentezi ve düzenlenmesinden sorumlu birçok enzim ökaryotlar boyunca korunur7. Gerçekten de, bazı prokaryotes bile LD'lerde NL'leri depolar8. Bu nedenle, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) gibi genetik olarak çekilebilir model organizmalar NL sentezi ve regülasyonu için yararlı olmuştur.
NL'lerin hücre özlerinden ayrılması ve nicelleştirilmesi, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (UPLC-MS) 9,10,11dahil olmak üzere sayısız şekilde gerçekleştirilebilir. NL'leri ayırmak için belki de en basit yöntem, standart bir eğri12 , 13'ten sonraki densitometrik niceleme sağlayan ince tabaka kromatografisi (TLC) yoluyladır. TLC, NL'lerin yalnızca ders taneli bir ayrımını sağlasa da, ucuz olduğu için güçlü bir teknik olmaya devam eder ve AYNı anda birkaç örnekten NL'lerin hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. TLC aracılığıyla NIS'lerin incelenmesinin karşılaştığı en önemli zorluklardan ikisi şunlardır: 1) NL türlerinin ve aralarının geniş hücresel bolluk yelpazesi ve 2) NL sentez yolları içindeki lipid aralarının hidrofililik / hidrofobikliği aralığı. Sonuç olarak, NL türlerinin TLC aracılığıyla nicelemesi tipik olarak en bol türlerle sınırlıdır; bununla birlikte, 14C-asetik asit radyolabelinin tanıtılması, NL yollarında düşük bolluklu ara maddelerin tespitini önemli ölçüde artırabilir. Asetik asit, asetil-CoA sentezi ACS214tarafından hızla asetil-CoA'ya dönüştürülür, bu da 14C-asetik asidi mayada uygun bir radyolabelingsubstratı yapar 15. Ek olarak, hem hidrofobik NCI'lerin hem de NL'lerin hidrofilik aralarının ayrılması, çoklu solvent sistemleri kullanılarak TLC tarafından elde edilebilir16. Burada, mayada 14C-asetik asit metabolik etiketleme kullanılarak NL'lerin ayrılması için bir yöntem sunulmuştur. Nabız döneminde etiketlenen lipitler daha sonra iyi kurulmuş bir toplam lipid izolasyon protokolü17, ardından NL türlerinin TLC ile ayrılması. Etiketli lipitleri görselleştirmek için hem otoradyografi hem de toplam lipitleri görselleştirmek için kimyasal bir sprey ile TLC plakalarının geliştirilmesi, birden fazla niceleme yöntemine izin sağlar. Bireysel lipid bantları da jilet kullanılarak TLC plakasından kolayca çıkarılabilir ve bant içindeki radyolabelli malzeme miktarını ölçmek için scintillation sayımı kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC084H001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>800811O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof absolute ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid washed glass beads 425-600um</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bulbs for Pastuer pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS6500 scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>A481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (HPLC grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-linoleate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-475-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoLume scintillation liquid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC88247001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage phosphor screen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon FLA9500 imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 6mL scintillation vials</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tube caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-36A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-595-35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, anhydrous grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Adenine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1270000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine &#62;97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Theronine, reagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Uracil &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-anisaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>184519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, ACS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets, certified ACS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid crystalline/certified</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>110-15-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC saturation pad</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60G glass channeled plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9825743</td>
			<td>No fluorescent indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency plastic film</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>829903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein &#62;99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman exposure cassette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA29175523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1251</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of neutral lipid synthesis in saccharomyces cerevisiae by metabolic labeling and thin layer chromatography

Nötr lipitler (NL'ler), enerji ve lipid homeostazında kilit roller oynayan hidrofobik, şarjsız biyomoleküller sınıfıdır. NL'ler asetil-CoA'dan sentezlenir de novo ve öncelikle ökaryotlarda trigliseritler (TG' ler) ve sterol esterleri (SE' ler) şeklinde bulunur. NL'lerin sentezinden sorumlu enzimler, Saccharomyces cerevisiae'den (maya) insanlara yüksek oranda korunur ve mayayı NL metabolizma enzimlerinin işlevini ve düzenlemesini parçalamak için yararlı bir model organizma haline getirir. Asetil-CoA'nın çeşitli NL türlerine nasıl dönüştürüldüğü hakkında çok şey bilinmesine gerek varken, NL metabolizma enzimlerini düzenleme mekanizmaları ve yanlış düzenlemenin hücresel patolojilere nasıl katkıda bulunabileceği hala keşfedilmektedir. NL türlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için onlarca yıllık araştırmalar boyunca çok sayıda yöntem geliştirilmiş ve kullanılmıştır; bununla birlikte, büyük NL türlerinin kapsamlı karakterizasyonu için nicel ve basit bir protokol tartışılmamıştır. Burada, mayadaki büyük NL türlerinin de novo sentezini ölçmek için basit ve uyarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Fizyolojik açıdan önemli NL'lerin çeşitli aralıklarını ayırmak ve ölçmek için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilmiş 14C-asetik asit metabolik etiketleme uyguluyoruz. Ayrıca, bu yöntem NL enzimlerinin in vivo reaksiyon oranlarını veya NL türlerinin zaman içinde bozulmasını incelemek için kolayca uygulanabilir.

Bu protokolde, NL türlerinin etiketlenmesi, tespiti ve niceliğinin 14C-asetik asit metabolik etiketleme ile gerçekleştirilebileceğini göstermiş olduk. Büyük NL türleri 50:40:10:1 (v/v/v%) Heksan:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit (Şekil 1A,B)çözücü sisteminde ayrılabilir. Fosfor görüntüleme, etiketli serbest yağ asidi (FFA), triyasilgliserol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) ve squalene (SQ) görselleştirilmesine izin verir (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Bu teknik, çoğu laboratuvar ortamında yaygın olarak bulunan aletleri kullanır ve aynı anda birkaç numunenin analizini sağlar. Bu yöntem, lipid metabolizması enzimlerinin hücresel bağlamda ve farklı genetik arka planlarda nasıl düzenlendiği hakkında önemli içgörüler sağlayabilir. Bir koloniyi bir maya kültür plakasından% 2 dekstroz içeren 20 mililitre SC ortamına aşıla ve 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yatır.Ertesi gün, kültürü 50 mililitre taze ortamda 0,2'lik son bir OD'ye seyreltin ve sabit faza ulaşılana kadar 24 saat boyunca büyütün. Her örnek için iki adet 20 mililitrelik söndürme tamponu hazırlayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aynı zamanda, mililitre başına 10 mikrokürie'lik son konsantrasyonda dekstroz içermeyen SC ortamına asetik asit sodyum tuzu ekleyerek radyolabeling ortamı hazırlayın.Hücreleri 10 dakika boyunca 4,100 x g'da santrifüjleyarak toplayın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 20 mililitre dekstroz içermeyen SC ortamıyla bir kez yıkayın. Hücreleri beş dakika boyunca 4, 100 x g'da santrifüjleyarak tekrar toplayın ve dekstroz içermeyen ortam kullanarak etiketli iki mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri iki dakika daha santrifüjleyin. Hücreleri 500 mikrolitre dekstrozsuz SC ortamına yeniden boşaltın ve her hücre süspansiyonu için hızlı bir şekilde 500 mikrolitre radyolabeling ortamı ekleyerek radyolabeling dönemine başlayın. Tüpleri 30 santigrat derecede dönen bir inkübatörde 20 dakika kuluçkaya yatırın.Bu arada, 50 mililitre konik tüp için donatılmış santrifüjü eksi 10 santigrat dereceye kadar önceden soğutun ve bir adet 20 mililitrelik söndürme tamponu çözün. Radyolabeling süresi sona erdiğinde, bir mililitrelik numunenin tamamını buzdaki çözülmüş söndürme tamponuna daldırmak için bir pipet kullanın. Üç dakika boyunca 5.000 x g'da önceden soğutulmuş bir santrifüjde dönerek hücre peletini toplayın ve 20 mililitre taze soğuk söndürme tamponu ekleyin.Vortex ve söndürme tamponunda tamamen yeniden dirsinmek için örnekleri sallayın ve hücreleri toplamak için örnekleri tekrar santrifüj edin. Hücreler peletlendikten sonra, üsttan dökerek ve fazlalıkları bir pipetle çıkararak tüm söndürme tamponunu numunelerden iyice çıkarın. Daha fazla işlem için tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.Her örnek için 0,3 gram asitle yıkanmış cam boncukları tartın ve buz üzerinde iki mililitre mikrosantrifüj tüpünde saklayın. Hücre topaklarını eksi 80 derecelik dondurucudan çıkarın ve buza yerleştirin. Daha sonra, her numuneye 350 mikrolitre metanol ve 700 mikrolitre kloroform ekleyin ve hücreleri yeniden biriktirin.Bunları önceden tartılmış cam boncuklar içeren mikro santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri bir dakika boyunca üç kez girdaplayarak, ajitasyonlar arasındaki buzda 30 saniye inkübasyon ile lyse. Hücreleri 15 mililitrelik bir cam santrifüj tüpüne dökün ve tüpü A.Tüp A olarak etiketleyin Mikrosantrifüj tüpünü bir mililitre metanol ile yıkayın, vorteksleyin ve metanolünü A tüpüne dökün.Örnekleri bir dakika boyunca girdaplayın ve ardından 1000 x g'da beş dakikalık bir santrifüjleme ile sulu ve organik aşamaları arayüzde yatan hücre kalıntılarıyla net bir şekilde ayırın. Cam mera pipeti kullanarak, organik fazı B etiketli yeni bir cam santrifüj tüpüne toplayın ve bir mililitre azı dişi potasyum klorür ekleyin. A tüpüne bir mililitre metanol ve iki mililitre kloroform ekleyin ve girdap ve santrifüj adımlarını tekrarlayın.Sulu ve organik fazı ayırmak için girdap ve santrifüj tüpü B. Üst sulu tabakayı çıkarın ve tüm alt organik tabakayı dört mililitrelik bir cam şişeye toplayın. Lipid özlerindeki çözücüyü inert gaz altında kurutarak tamamen buharlaştırın ve TLC plakasını ısıtmak için fırını 145 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.Hücreleri TLC plakasına yüklemeden önce hücreler tarafından alınan göreceli radyolabel miktarlarını belirleyin. Örnek lipitleri 40 ila 50 mikrolitre kloroform ve metanolde beş dakika boyunca girdaplayarak bire bir oranında yeniden inşa edin. Cam mezunu bir silindirde 101 mililitre mobil faz çözücü hazırlayın.Ardından, çözücüyü 20 x 20 TLC doygunluk pedi ve sıkı bir montaj kapağı içeren bir cam TLC haznesine dökün. Kanallı bir 20'ye 20 silika jel 60G plaka hazırlayın ve bir kalem kullanarak plakanın altından 1,5 santimetre yukarıda bir çizgi işaretleyin. Plaka yeterince ısıtıldıktan ve TLC doygunluk pedi çözücü ile doyuruldıktan sonra, TLC plakasını fırından çıkarın ve hemen yüklemeye devam edin.Bir pipet kullanarak, TLC plakasının dibinden 1,5 santimetre yukarıda bulunan her şeridin kökenine beş mikrolitre numune tespit edin ve her şeride 20 ila 40 mikrolitre numune yüklenene kadar tekrar yüklemeyi tekrarlayın. Standart ve numuneler yüklendikten sonra, plakayı gelişmekte olan odaya yerleştirin ve çözücü plakanın tepesine ulaşana kadar bekleyin. Plaka tamamen geliştirildiğinde, hazneden çıkarın ve duman kaputunda 20 dakika kurumasını bekleyin.Plaka kuruduktan sonra plastik filmle örtün ve otoradyografi ekranı ile gelişmekte olan bir kasete yerleştirin. Ekranı gelişmekte olan kasetten çıkarın ve fosfor görüntüleyicinin içine yerleştirin. TLC plakasını silika doyurulana kadar p-Anisaldehit reaktifi ile püskürtün, ardından 145 derece fırında beş dakika veya bantlar ortaya çıkana kadar pişirin.Lipid türlerini ölçmek için, bireysel lipit türlerini içeren silika jelini kazıyın ve cam scintillation şişelerine aktarın. Silika bandı küçük parçalara indirgenene kadar altı mililitre scintillation sıvısı ve girdabı kuvvetlice ekleyin. Scintillation şişeleri ile rafı bir scintillation sayacına yerleştirin ve sayım süresini şişe başına iki dakikaya ayarlayarak sayın.Fosfor görüntüleme, etiketsiz yağ asidi, triacylglycerol, diacylglycerol, kolesterol ve squalane otoradyogramının görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntemde saflaştırılmış lipit türlerinin ayrılabileceği ve daha sonra TLC plakasının p-Anisaldehit reaktifi ile püskürtülmesiyle görselleştirilebileceği gösterilmiştir. Görselleştirilmiş türler, steril esterlere ek olarak daha önce bahsedilen tüm lipitleri içerir.Nabzı takip eden radyolabel içermeyen medyada 10 dakikalık bir kovalama süresi uygulanarak, majör squalane havuzunda gözlendi ve toplam kolesterol yükseldi. Benzer şekilde, kovalama döneminde diacylglycerol görünümü serbest yağ asitleri sinyalinde bir azalma ile ilişkilidir. Tam protokolü gerçekleştirmeden önce, hücrelerin büyüme durumunda ve ilginin genetik arka planında asetik asit radyolabelini alıp almayacağını belirlemek önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...