Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dominique James i Dr. Ken Hoyt's lab for at give TRSP analyse af vaporizable fase-shift nanodroplets

1. Gør lipid film
<ol><li>Forbered lipidfilm til mikrobubblegenerering ved hjælp af 90% DSPC og 10% DSPE-PEG2K ved at blande lipiderne i det korrekte forhold ved hjælp af følgende retninger:<ol>
<li>Lav stock lipider af DSPC og DSPE-PEG2K i kloroform. Veje 50 mg af hver lipid pulver i separate hætteglas. Tilsæt 1 mL kloroform til hvert hætteglas ved hjælp af en 1 mL glassprøjte.</li>
		<li>Der tilsættes 287 μL DSPC-lager og 113 μL DSPE-PEG2K-lager (begge 50 mg/mL) i et 20 mL scintillationsglas med en glassp...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

En omfattende mængde litteratur er tilgængelig, der diskuterer formulering, fysik og potentielle anvendelser af mikrobobler og faseskiftdråber til in vivo imaging og terapi. Denne diskussion vedrører eksplicit at generere lipid mikrobubbles og konvertere dem til sub-mikron fase-shift dråber ved hjælp af et lavt kogepunkt DFB gas og højtryk ekstrudering. Den metode, der er skitseret her, er beregnet til at give en relativt enkel metode til fremstilling af store mængder lipidmikrobubbles og DFB faseskiftdråber ved...

Ultralyd kontrast agenter (UCAs) er hastigt stigende i popularitet for billedbehandling og terapi applikationer. Mikrokøb, de oprindeligeucas, er i øjeblikket mainstream agenter, der anvendes i kliniske diagnostiske applikationer. Mikrobobler er gasfyldte kugler, typisk 1-10 μm i diameter, omgivet af lipid, protein eller polymer skaller1. Deres størrelse og in vivo stabilitet kan dog begrænse deres funktionalitet i mange applikationer. Faseskift nanodroplets, som indeholder en overophedet flydende kerne, kan overvinde nogle af disse begrænsninger på grund af deres mindre størrelse og forbedrede cirkulation-liv2. Når den overophedede væskekerne udsættes for varme eller akustisk energi, fordampes den til at danne en gasmikrobubble2,3,4,5. Da fordampningstærsklen er direkte relateret til dråbestørrelse5,6, ville det være meget ønskeligt at formulere dråbeaffjedring med ensartet størrelse for at opnå ensartede aktiveringstærskler. Formuleringsmetoder, der producerer ensartede dråbestørrelser, er ofte komplekse og dyre, mens mere omkostningseffektive tilgange resulterer i polydisperseløsninger7. En anden begrænsning er evnen til at generere stabile faseskiftdråber med lavkogende punkt perfluorcarbon (PFC) gasser, som er afgørende for effektiv aktivering in vivo8. I dette manuskript er en protokol beskrevet til generering af stabile filtrerede lavkogningspunkt fordampelige faseskiftdråber til in vivobilleddannelse og terapiapplikationer.
Der er mange metoder til fremstilling af monodispersed submicron fase-skift dråber7. En af de mest robuste metoder til styring af størrelse er brugen af mikrofluidiske enheder. Disse enheder kan være dyre, har langsomme dråber produktion (~ 104-106 dråber / s)7, og kræver omfattende uddannelse. Mikrofluidiske enheder kræver også generelt gasser med høj kogepunkt for at undgå spontan fordampning og tilstopning af systemet7. En nylig undersøgelse foretaget af de Gracia Lux et al.9 viser imidlertid, hvordan køling af et mikrofluidizer kan bruges til at generere høje koncentrationer af faseskift under mikron (1010-1012/mL) ved hjælp af lavt kogepunktdecafluorobutan (DFB) eller octafluoropropan (OFP).
Generelt er lavkognitsgasser som DFB eller OFP lettere at håndtere ved hjælp af præformede gasbobler. Vaporizable dråber kan fremstilles af prækursor lipid-stabiliseret bobler ved at kondensere gassen ved hjælp af lave temperaturer og forhøjet tryk5,10. Koncentrationen af dråber produceret ved hjælp af denne metode afhænger af prækursor mikrobubble koncentration og effektiviteten af konvertering af bobler til dråber. Koncentreret mikrobobler er blevet rapporteret fra tip sonikering nærmer sig > 1010 MB/mL11, mens en separat undersøgelse har rapporteret dråbe koncentrationer spænder fra ~ 1-3 x1011 dråber / mL fra kondenseret OFP og DFP bobler12. Når monodispersed dråber ikke er et problem, kondensering metoder er de mest ligetil og billigste metoder til at generere lipid-stabiliseret fase-skift dråber ved hjælp af lavkogning punkt PFC'er. Metoder til at generere ensartet størrelse bobler før kondensering kan bidrage til at skabe mere monodisperse populationer af dråber. Det er imidlertid også vanskeligt at generere monodisperse prækursorbobler, hvilket kræver dyrere tilgange såsom mikrofluidics eller gentagne differentialcentrifugeringsteknikker11. En alternativ tilgang til produktion af DFB og OFB nanodroplets er for nylig blevet offentliggjort ved hjælp af spontan nukleation af dråber i liposomer13. Denne metode, udnytte en "Ouzo" effekt, er en enkel måde at generere lavkogning punkt PFC dråber uden at skulle kondensere bobler. Størrelsesfordelingen af PFC-dråberne kan styres af delikat titrering og blanding af PFC-, lipid- og ethanolkomponenter, der bruges til at starte nukleation af dråberne. Det er også værd at bemærke, at blanding af perfluorcarboner kan bruges til at kontrollere stabilitet og aktivering tærskler for nanodroplets14,15. Nyere arbejde af Shakya et al. viser, hvordan aktivering af nanodråbe kan indstilles ved at emulgere højkogningpunkt-PFC'er i et kulbrinte endoskelet for at lette heterogen nukleation i dråbekernen16, hvilket er en tilgang, der kan overvejes sammen med andre former for filtrering af dråbestørrelse.
Når de er dannet, kan faseskiftdråber ekstruderes efter dannelse for at skabe flere monodispersepopulationer. Faktisk er en lignende protokol til den metode, der er beskrevet her, tidligere blevet offentliggjort af Kopechek et al.17 ved hjælp af høj kogepunkt dodecofluorpentane (DDFP) som dråbekernen. Læsere, der søger at bruge faseskiftdråber med højkogningspunkt perfluorcarboner (stabile ved stuetemperatur), bør i stedet henvise til artiklen ovenfor. Generering og ekstrudering af dråber med lav kogepunkt gasser, såsom DFB og OFP, er mere kompliceret og er bedst gribes an ved at kondensere præformede gasbobler.
I denne protokol, en fælles metode til at generere præformede lipid mikrobubbles med en DFB gas kerne ved hjælp af sonde tip sonikering er beskrevet. Dernæst bruges en kommerciel ekstruder til at kondensere præformede mikrobubbles i submicron faseskift nanodråber (figur 1). De resulterende dråber kan derefter aktiveres ved varme og ultralyd. Denne metode kan producere større mængder nanodråbeopløsning end konventionelle kondensmetoder med smallere størrelsesfordelinger uden behov for dyre mikrofluidiske enheder. Produktionen af nanodråbeløsninger med smal størrelsesfordelinger kan sandsynligvis generere mere ensartede fordampningstærskler. Dette vil maksimere deres potentiale for mange applikationer såsom billeddannelse, ablation, lægemiddellevering, og embolisering1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk af højtryksekstruderingsopsætning til kondenserende præformede mikrobubbles i faseskift nanodråber. Mikrobobbleopløsning tilsættes og er indeholdt i ekstruderkammeret, og 250 psi fra nitrogentanken påføres gennem kammerets indløbsventil. Nitrogengassen vil skubbe mikrobobbleopløsningen gennem filteret i bunden af kammeret og kondensere prøven til nanodråber. Opløsningen skubbes til sidst ud af ekstruder gennem prøveudtagrøret og opsamles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Der er mange metoder, der kan bruges til produktion af vaporizable fase-shift dråber til billeddannelse og terapi. Hver metode bruger forskellige teknikker og varierer i pris, materialer og formål. Mange af disse fremstillingsmetoder resulterer i polydispersepopulationer med ikke-ensartede aktiveringstærskler. Derudover kræver styring af dråbestørrelserne typisk stabile perfluorcarbonvæsker med høje aktiveringstærskler, der ikke er praktiske in vivo. Produktion af ensartede dråbestørrelser ved hjælp af lavkogende punktgasser ville være gavnligt for in vivo imaging og terapi eksperimenter. I denne artikel beskrives en enkel og økonomisk metode til dannelse af størrelsesfiltrerede lipid-stabiliserede faseskift nanodråber med lavkogende punktdecafluorobutan (DFB). En fælles metode til fremstilling af lipidmikrobubbles er beskrevet, ud over en ny metode til at kondensere dem med højtryksekstrudering i et enkelt trin. Denne metode er designet til at spare tid, maksimere effektiviteten og generere større mængder mikrobubble- og nanodråbeløsninger til en lang række applikationer ved hjælp af almindeligt laboratorieudstyr, der findes i mange biologiske laboratorier.

Repræsentative resultater af størrelsesfordelingen er inkluderet ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) og tunable resistiv pulsmåling (TRSP) analyse. Figur 5 viser størrelsesfordelingen af kondenserede bobleopløsninger med og uden ekstrudering. Uden ekstrudering slutter protokollen ved trin 5.3. De afkølede bobler kondenseres ved at udlufte prøven til atmosfærisk tryk, mens det er koldt. Den kondenserede eneste prøve har en meget bredere fordeling centreret nær 400 nm. Den ekst...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Denne protokol beskriver en metode til at generere store mængder lipid indkapslede decafluorobutane mikrobubbles ved hjælp af sonde-tip sonikering og efterfølgende kondensere dem i fase-shift nanodroplets ved hjælp af højtryk ekstrudering og mekanisk filtrering.

Produktion af membranfiltrerede faseskiftdecafluorobutan nanodråber fra præformede mikrobubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Denne protokol er en nem metode til at reducere polydispersitet af lavt kogepunkt vaporizable dråber til brug i biomedicinske applikationer. Denne teknik kondenserer præformede gasmikrobubbles og filtrerer de resulterende flydende dråber efter størrelse på en måde, der er kontrollerbar, skalerbar og relativt omkostningseffektiv. Denne metode kan anvendes på en række lipid mikrobubbles med forskellige shell og gas materiale ved hjælp af forskellige filtre til at kontrollere den endelige dråbe størrelse.Demonstrere proceduren vil være Darrah Merillat, en bachelor forsker fra Dr.Sirsi's laboratorium. Tænd for afbryderen til sonikeren, og indstil amplituden til det maksimalt tilladte ved hjælp af mikrotiptilbehøret, og sørg for, at sonikeringstiden er indstillet til 10 sekunder. Placer den varme hydrerede lipidopløsning i lydkabinettet med mikrotippet lige under overfladen.Fastgør en passende slangelængde til hætteglassets hals for at lede gassen fra DFB-tankens udløb ind i den varme lipidopløsning, der holdes i kabinettet. Åbn tankventilen langsomt, indtil gassen kan ses flyde over lipidopløsningen, hvilket forårsager små krusninger på væskens overflade. Hvis gasstrømmen er for høj, vil opløsningen flyde over under mikrobubbledannelse.Start sonikeren, og kør den i 10 sekunder kontinuerligt for at generere mikrobobler. Når sonikering er overstået, skal du straks lukke DFB-tankventilen. Overdæk hurtigt mikrobobbleopløsningen, og dyk hætteglasset ned i et isbad for at afkøle prøven under 55 grader Celsius.Brug et 200-nanometer keramisk filter til at samle højtryksekstruderen i henhold til brugervejledningen, og placer det i midten af en vandtæt beholder, så prøveudtagrøret ikke presses mod siden eller presses. Sæt ekstruderen til nitrogengastanken ved hjælp af adapteren, der leveres af producenten. Sæt enden af udløbsrøret i et scintillationsglas for at opsamle den ekstruderede prøve, og røret fastgøres til beholderen med tape for at holde sig inden for hætteglasset.Åbn og luk udløsningsventilen for at sikre, at der ikke er noget tryk i ekstruderen. Tag kammerlåget af. Og tilsæt fem milliliter PBS til ekstruderkammeret.Udskift låget, og sørg for, at det klikker sikkert tilbage på plads. Åbn nitrogengastanken, så trykmåleren aflæser 250 PSI, og sørg for, at trykreguleringsventilen er i lukket position. Luk gastanken, og åbn ekstruderkammerets indløbsventil, hvilket får PBS-opløsningen til at blive skubbet gennem systemet og ud af prøveudtagrøret ind i scintillationsglasset.Når kun gas er at forlade slangen, åbne frigivelse ventil, og lad trykket til at falde til nul PSI. Fjern derefter scintillationsglaset. Åbn og luk udløsningsventilen for at sikre, at der ikke er tryk i ekstruderen, og placer et nyt scintillationsglas i enden af udløbsrøret.Fyld en stålbeholder med 2-methylbutan, og tilsæt tøris for at bringe temperaturen ned til minus 18 grader Celsius. Sæt mikrobubbleopløsningen i den afkølede 2-methylbutan og nedsænkning af prøven i to minutter. Flyt scintillation hætteglasset i løbet af de to minutter til forsigtigt at blande boblerne.Tilsæt tøris efter behov for at opretholde temperaturen mellem minus 15 og minus 18 grader Celsius. Efter to minutter fjernes mikroboblerne fra den afkølede 2-methylbutan. Hvirvl forsigtigt hætteglasset for at blande mikroboblerne, og overfør bobler til en kølet 10-milliliter sprøjte.Fjern ekstruderkammerlåget, og tilsæt mikrobubbleopløsningen til kammeret ved langsomt at skubbe stemplet på sprøjten. Udskift ekstruderhætten, og sørg for, at den klikker sikkert på plads. Kontroller, at trykreguleringsventilen og ekstruderens udløsningsventil er i lukket position.Åbn nitrogengastanken, indtil trykmåleren lyder på 250 PSI. Luk gastanken, og drej trykreguleringsventilen til den åbne position. Når opløsningen har fyldt scintillationsglasset ved udgangsslangen, og kun gassen forlader røret, skal trykudløsningsventilen langsomt åbnes, og trykket falder til nul PSI.Overfør 10 milliliter af den ekstruderede dråbeopløsning til et 15-milliliter centrifugerør. Centrifuge ekstruderet prøve ved 1.500 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten og de spontant fordampede dråber, der vises øverst på opløsningen.Suspendere pelleten, der omfatter DFP nanodroplets, i 10 milliliter PBS med 20 % glycerol og 20 % propylenglycol. Størrelsesfordelingen af kondenserede bobleopløsninger med og uden ekstrudering viser, at den kondenserede kun-prøve har en meget bredere fordeling centreret nær 400 nanometer, mens den ekstruderede prøve har en smallere fordeling centreret ved 200 nanometer. Tunable modstand puls sensing analyse bruges til at analysere fase skift dråber, som de er blevet vasket ved centrifugering at fjerne overskydende liposomer viser, at dråbe størrelser er i nærheden af 200 nanometer.Mikroskopidata af nanodråbe fordampning, når de opvarmes viser, at nogle spontant fordampede mikrobobler er synlige i synsfeltet før opvarmning, og et større antal gasmikrobubbles observeres efter opvarmning. Mikroskopibillederne af nanodråber indsat i ekstruderen direkte uden forkøling, kondenseret ved nul grader Celsius og ved minus 18 grader Celsius vises her. Repræsentative billeder af kondenserede octafluoropropane dråber før og efter fordampning viser også et større antal gasmikrobubbles efter opvarmning, svarende til DFB-dråberne.Det vigtigste at huske under denne procedure er, at dråbeudbyttet er meget afhængig af temperatur og tryk under kondens, og små variationer vil påvirke resultaterne. Efter at have genereret vaporizable dråber, de kan bruges til at optimere in vivo billeddannelse og lægemiddellevering ved hjælp af ultralyd, samt andre in vivo og ex vivo applikationer. Efter at have udviklet denne teknik er virkningerne af nanodråbestørrelse og gaskerneindhold på in vivo-fordampningstærskler blevet undersøgt ved hjælp af små ændringer af denne protokol.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion og Målretning af Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion af kemikalier af<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Brug af bambushydrolysat som fødevare

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Produktion af ekstracellulære Matrix fibre via hellige hule Fiber membran cellekultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Mikrofluidic Produktion af Lysolipid-Holdige Temperatur-Følsomme Liposomer

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

Magnetiske, akustiske og optisk-triple-responsive mikrobubbles til magnetisk hypertermi og pothotothermal kombinationskræftbehandling

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Billeddannelse og kvantificering af området for hurtige mikrobobler ved hjælp af et højhastighedskamera og billedanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

En effektiv metode til produktion af Adenovirus

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Multi-timescale mikroskopi metoder til karakterisering af fluorescerende-mærket Microbubbles for Ultralyd-udløst Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...