Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

We willen Dominique James in het laboratorium van Dr. Ken Hoyt bedanken voor het leveren van TRSP-analyse van verdampbare faseverschuiving nanodruppels

1. Lipidenfilms maken
<ol><li>Bereid lipidefilms voor het genereren van microbubbels met behulp van 90% DSPC en 10% DSPE-PEG2K door de lipiden in de juiste verhouding te mengen met behulp van de volgende richtingen:<ol>
<li>Maak stocklipiden van DSPC en DSPE-PEG2K in chloroform. Weeg 50 mg van elk lipidenpoeder af in afzonderlijke injectieflacons. Voeg 1 ml chloroform toe aan elke injectieflacon met behulp van een glazen spuit van 1 ml.</li>
		<li>Voeg 287 μL DSPC-bouillon en 113 μL DSPE-PEG2K-bouillon (beide 50 mg/m...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

Er is een uitgebreide hoeveelheid literatuur beschikbaar die de formulering, fysica en mogelijke toepassingen van microbubbels en faseverschuivingdruppels voor in vivo beeldvorming en therapie bespreekt. Deze discussie heeft expliciet betrekking op het genereren van lipide microbubbels en deze om te zetten in sub-micron faseverschuivingsdruppels met behulp van een DFB-gas met laag kookpunt en hogedrukextrusie. De hier beschreven methode is bedoeld om een relatief eenvoudige methode te bieden voor het produceren van grote...

Ultrasone contrastmiddelen (UCA's) groeien snel in populariteit voor beeldvormings- en therapietoepassingen. Microbubbels, de oorspronkelijke UCA's, zijn momenteel de reguliere middelen die worden gebruikt in klinische diagnostische toepassingen. Microbubbels zijn met gas gevulde bolletjes, meestal 1-10 μm in diameter, omgeven door lipide-, eiwit- of polymeerschillen1. Hun grootte en in vivo stabiliteit kunnen hun functionaliteit in veel toepassingen echter beperken. Faseverschuiving nanodruppels, die een oververhitte vloeibare kern bevatten, kunnen enkele van deze beperkingen overwinnen vanwege hun kleinere formaat en verbeterde levensduur2. Bij blootstelling aan warmte of akoestische energie verdampt de oververhitte vloeibare kern tot een gasmicrobubbel2,3,4,5. Aangezien de verdampingsdrempel direct verband houdt met de druppelgrootte5,6, zou het formuleren van druppelsuspensies met uniforme grootte zeer wenselijk zijn voor het bereiken van consistente activeringsdrempels. Formuleringsmethoden die uniforme druppelgroottes produceren zijn vaak complex en kostbaar, terwijl meer kosteneffectieve benaderingen resulteren in polydisperse-oplossingen7. Een andere beperking is het vermogen om stabiele faseverschuivingsdruppels te genereren met perfluorkoolstofgassen (PFC) met een laag kookpunt, wat van cruciaal belang is voor efficiënte activering in vivo8. In dit manuscript wordt een protocol beschreven voor het genereren van stabiele gefilterde laagkokende verdampingsdruppels met laag kookpunt voor in vivo beeldvormings- en therapietoepassingen.
Er zijn veel methoden om monodispersed submicron faseverschuivingsdruppels7 te produceren. Een van de meest robuuste methoden om de grootte te regelen, is het gebruik van microfluïdische apparaten. Deze apparaten kunnen duur zijn, hebben een trage druppelproductie (~ 104-106 druppels / s)7 en vereisen uitgebreide training. Microfluïdische apparaten vereisen over het algemeen ook gassen met een hoog kookpunt om spontane verdamping en verstopping van het systeem te voorkomen7. Een recente studie van de Gracia Lux et al.9 toont echter aan hoe het koelen van een microfluidizer kan worden gebruikt om hoge concentraties submicron faseverschuiving (1010-1012 / ml) te genereren met behulp van decafluobutaan met laag kookpunt (DFB) of octafluorpropaan (OFP).
Over het algemeen zijn gassen met een laag kookpunt, zoals DFB of OFP, gemakkelijker te hanteren met behulp van voorgevormde gasbellen. Verdampbare druppels kunnen worden geproduceerd uit voorloper lipide-gestabiliseerde bellen door het gas te condenseren met behulp van lage temperaturen en verhoogde druk5,10. De concentratie van druppels die met deze methode worden geproduceerd, hangt af van de concentratie van voorlopermicrobubbels en de efficiëntie van de omzetting van bellen in druppels. Geconcentreerde microbubbels zijn gemeld van tip sonicatie die > 1010 MB / ml11 nadert, terwijl een afzonderlijke studie druppelconcentraties heeft gemeld variërend van ~ 1-3 x1011 druppels / ml van gecondenseerde OFP- en DFP-bubbels12. Wanneer monodispersed druppels geen probleem zijn, zijn condensatiemethoden de meest eenvoudige en goedkoopste methoden voor het genereren van lipide-gestabiliseerde faseverschuivingsdruppels met behulp van PFK's met een laag kookpunt. Methoden voor het genereren van bubbels van uniforme grootte voordat ze condenseren, kunnen helpen bij het creëren van meer monodisperse populaties van druppels. Het genereren van monodisperse precursorbellen is echter ook moeilijk, waardoor duurdere benaderingen zoals microfluïdica of herhaalde differentiële centrifugatietechnieken11 nodig zijn. Een alternatieve benadering voor de productie van DFB- en OFB-nanodruppels is onlangs gepubliceerd met behulp van spontane nucleatie van druppels in liposomen13. Deze methode, met behulp van een "Ouzo" -effect, is een eenvoudige manier om PFC-druppels met een laag kookpunt te genereren zonder bubbels te hoeven condenseren. De grootteverdeling van de PFC-druppels kan worden geregeld door delicate titratie en menging van PFC-, lipide- en ethanolcomponenten die worden gebruikt om de nucleatie van de druppels te initiëren. Het is ook vermeldenswaard dat het mengen van perfluorkoolwaterstoffen kan worden gebruikt om de stabiliteit en activeringsdrempels van nanodruppels14,15 te regelen. Meer recent werk van Shakya et al. toont aan hoe nanodruppelactivering kan worden afgestemd door PFK's met een hoog kookpunt in een koolwaterstof-endoskeleton te emuleren om heterogene nucleatie in de druppelkern16 te vergemakkelijken, wat een benadering is die kan worden overwogen samen met andere vormen van druppelgroottefiltratie.
Eenmaal gevormd, kunnen faseverschuivingdruppels na vorming worden geëxtrudeerd om meer monodisperse populaties te creëren. In feite is een soortgelijk protocol met de hier beschreven methode eerder gepubliceerd door Kopechek et al.17 met behulp van dodecofluorpentane (DDFP) met hoog kookpunt als druppelkern. Lezers die faseverschuivingsdruppels met perfluorkoolwaterstoffen met hoog kookpunt (stabiel bij kamertemperatuur) willen gebruiken, moeten in plaats daarvan het bovenstaande artikel raadplegen. Het genereren en extruderen van druppels met gassen met een laag kookpunt, zoals DFB en OFP, is ingewikkelder en kan het beste worden benaderd door voorgevormde gasbellen te condenseren.
In dit protocol wordt een veelgebruikte methode beschreven voor het genereren van voorgevormde lipidemicrobubbels met een DFB-gaskern met behulp van sondetipsoonapparaat. Vervolgens wordt een commerciële extruder gebruikt om voorgevormde microbubbels te condenseren tot submicron faseverschuiving nanodruppeltjes (figuur 1). De resulterende druppels zijn dan te activeren door warmte en echografie. Deze methode kan grotere volumes nanodruppeloplossing produceren dan conventionele condensatiemethoden met smallere grootteverdelingen zonder de noodzaak van dure microfluïdische apparaten. De productie van nanodruppeloplossingen met smalle grootteverdelingen kan waarschijnlijk meer uniforme verdampingsdrempels genereren. Dit zal hun potentieel maximaliseren voor tal van toepassingen zoals beeldvorming, ablatie, medicijnafgifte en embolisatie1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van hogedrukextrusie-opstelling voor het condenseren van voorgevormde microbubbels in faseverschuivingsnanodruppels. Microbubbeloplossing wordt toegevoegd aan en opgenomen in de extruderkamer en 250 psi, uit de stikstoftank, wordt aangebracht door de kamerinlaatklep. Het stikstofgas duwt de microbubbeloplossing door het filter aan de basis van de kamer en condenseert het monster tot nanodruppels. De oplossing wordt uiteindelijk door de monsteruitlaatbuis uit de extruder geduwd en verzameld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Er zijn veel methoden die kunnen worden gebruikt voor de productie van verdampbare faseverschuivingsdruppels voor beeldvorming en therapie. Elke methode maakt gebruik van verschillende technieken en varieert in prijs, materialen en doel. Veel van deze fabricagemethoden resulteren in polydisperse populaties met niet-uniforme activeringsdrempels. Bovendien vereist het regelen van de druppelgroottes doorgaans stabiele perfluorkoolstofvloeistoffen met hoge activeringsdrempels die in vivo niet praktisch zijn. Het produceren van uniforme druppelgroottes met behulp van gassen met een laag kookpunt zou gunstig zijn voor in vivo beeldvormings- en therapie-experimenten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en economische methode voor de vorming van grootte-gefilterde lipide-gestabiliseerde faseverschuiving nanodruppels met laag kookpunt decafluorbutaan (DFB). Een veelgebruikte methode voor het genereren van lipide microbubbels wordt beschreven, naast een nieuwe methode om ze in één stap te condenseren met hogedrukextrusie. Deze methode is ontworpen om tijd te besparen, de efficiëntie te maximaliseren en grotere volumes microbubbel- en nanodruppeloplossingen te genereren voor een breed scala aan toepassingen met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur die in veel biologische laboratoria wordt aangetroffen.

Representatieve resultaten van de grootteverdeling zijn opgenomen met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) en afstembare resistieve pulsdetectie (TRSP) analyse. Figuur 5 toont de grootteverdeling van gecondenseerde bellenoplossingen met en zonder extrusie. Zonder extrusie eindigt het protocol bij stap 5.3. De gekoelde bubbels worden gecondenseerd door het monster te ventileren tot atmosferische druk terwijl het koud is. Het gecondenseerde monster heeft een veel bredere distributie g...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Dit protocol beschrijft een methode om grote hoeveelheden lipide ingekapselde decafluorbutaan microbubbels te genereren met behulp van sonde-tip sonicatie en ze vervolgens te condenseren tot faseverschuiving nanodruppels met behulp van hogedruk extrusie en mechanische filtratie.

Productie van membraangefilterde faseverschuivingsdecafluorbutaan nanodruppels uit voorgevormde microbubbels

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Dit protocol is een eenvoudige methode om polydispersiteit van verdampbare druppels met een laag kookpunt te verminderen voor gebruik in biomedische toepassingen. Deze techniek condenseert voorgevormde gasmicrobubbels en filtert de resulterende vloeistofdruppels op grootte op een manier die controleerbaar, schaalbaar en relatief kosteneffectief is. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan lipide microbubbels met verschillende schaal- en gasmateriaal met behulp van verschillende filters om de uiteindelijke druppelgrootte te regelen.De procedure wordt gedemonstreerd door Darrah Merillat, een niet-gegradueerde onderzoeker uit het laboratorium van Dr. Sirsi. Schakel de aan/uit-schakelaar voor de sonicator in en stel de amplitude in op het maximaal toegestane met behulp van de microtipbevestiging en zorg ervoor dat de ultrasoonapparaattijd is ingesteld op 10 seconden. Plaats de warme gehydrateerde lipide-oplossing in de geluidsbehuizing met de microtip net onder het oppervlak.Bevestig een geschikte lengte van de slang aan de hals van de injectieflacon om het gas uit de DFB-tankuitlaat naar de warme lipide-oplossing in de behuizing te leiden. Open de tankklep langzaam totdat het gas over de lipide-oplossing kan stromen, waardoor lichte rimpelingen op het oppervlak van de vloeistof ontstaan. Als de gasstroom te hoog is, zal de oplossing overlopen tijdens de vorming van microbubbels.Start de sonicator en laat deze 10 seconden continu draaien om microbubbels te genereren. Nadat de ultrasoonapparaat is voltooid, sluit u onmiddellijk de DFB-tankklep. Sluit de microbubbeloplossing snel af en dompel de injectieflacon onder in een ijsbad om het monster af te koelen tot onder de 55 graden Celsius.Gebruik een keramisch filter van 200 nanometer om de hogedrukextruder volgens de gebruikershandleiding te monteren en plaats deze in het midden van een waterdichte container, zodat de uitlaatbuis van het monster niet tegen de zijkant wordt gedrukt of gekrompen. Koppel de extruder aan de stikstofgastank met behulp van de adapter die door de fabrikant is geleverd. Plaats het uiteinde van de uitlaatbuis in een scintillatieflacon om het geëxtrudeerde monster te verzamelen en bevestig de buis met tape aan de container om in de injectieflacon te blijven.Open en sluit de uitlaatklep om ervoor te zorgen dat er geen druk in de extruder is. Verwijder het deksel van de kamer. En voeg vijf milliliter PBS toe aan de extruderkamer.Plaats het deksel terug en zorg ervoor dat het goed terug op zijn plaats klikt. Open de stikstofgastank, zodat de manometer 250 PSI aangeeft en zorg ervoor dat de drukregelklep in de gesloten stand staat. Sluit de gastank en open de inlaatklep van de extruderkamer, waardoor de PBS-oplossing door het systeem wordt geduwd en de monsteruitlaatbuis in de scintillatieflacon wordt geduwd.Wanneer alleen gas de slang verlaat, opent u de uitlaatklep en laat u de druk dalen tot nul PSI. Verwijder vervolgens de injectieflacon met scintillatie. Open en sluit de uitlaatklep om er zeker van te zijn dat er geen druk in de extruder is en plaats een nieuwe scintillatieflacon aan het einde van de uitlaatbuis.Vul een stalen container met 2-methylbutaan en voeg droogijs toe om de temperatuur terug te brengen tot min 18 graden Celsius. Breng de microbubbeloplossing in het gekoelde 2-methylbutaan en dompel het monster gedurende twee minuten onder. Beweeg de scintillatieflacon gedurende de twee minuten om de bubbels voorzichtig te mengen.Voeg indien nodig droogijs toe om de temperatuur tussen min 15 en min 18 graden Celsius te houden. Verwijder na twee minuten de microbubbels uit het gekoelde 2-methylbutaan. Draai de injectieflacon voorzichtig om de microbubbels te mengen en breng de bubbels over in een gekoelde spuit van 10 milliliter.Verwijder het deksel van de extruderkamer en voeg de microbubbeloplossing toe aan de kamer door de zuiger langzaam op de spuit te duwen. Vervang de extruderdop en zorg ervoor dat deze goed op zijn plaats klikt. Controleer of de drukregelklep en de uitlaatklep van de extruder zich in de gesloten stand bevinden.Open de stikstofgastank totdat de manometer 250 PSI aangeeft. Sluit de gastank en draai de drukregelklep in de open stand. Wanneer de oplossing de scintillatieflacon bij de uitgangsslang heeft gevuld en alleen gas de buis verlaat, opent u langzaam de drukafsluiter en laat u de druk dalen tot nul PSI.Breng 10 milliliter van de geëxtrudeerde druppeloplossing over in een centrifugebuis van 15 milliliter. Centrifugeer het geëxtrudeerde monster op 1,500 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het bovennatuurlijke en de spontaan verdampte druppels die aan de bovenkant van de oplossing verschijnen weg.Suspensie van de pellet bestaande uit DFP-nanodruppels in 10 milliliter PBS met 20% glycerol en 20% propyleenglycol. De grootteverdeling van gecondenseerde bellenoplossingen met en zonder extrusie laat zien dat het gecondenseerde monster een veel bredere distributie heeft gecentreerd in de buurt van 400 nanometer, terwijl het geëxtrudeerde monster een smallere distributie heeft gecentreerd op 200 nanometer. Afstembare weerstandspulsdetectieanalyse die wordt gebruikt om faseverschuivingsdruppels te analyseren terwijl ze zijn gewassen door centrifugatie om overtollige liposomen te verwijderen, toont aan dat de druppelgroottes in de buurt van 200 nanometer liggen.De microscopiegegevens van nanodruppelverdamping bij verhitting laten zien dat sommige spontaan verdampte microbubbels zichtbaar zijn in het gezichtsveld vóór verwarming, en een groter aantal gasmicrobubbels worden waargenomen na verwarming. De microscopiebeelden van nanodruppels die direct zonder voorkoeling in de extruder zijn ingebracht, gecondenseerd bij nul graden Celsius en bij min 18 graden Celsius worden hier weergegeven. Representatieve beelden van gecondenseerde octafluorpropaandruppels voor en na verdamping tonen ook een groter aantal gasmicrobubbels na verhitting, vergelijkbaar met de DFB-druppels.Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat de druppelopbrengst sterk afhankelijk is van de temperatuur en druk tijdens condensatie, en kleine variaties zullen de resultaten beïnvloeden. Na het genereren van verdampbare druppels, kunnen ze worden gebruikt om in vivo beeldvorming en medicijnafgifte te optimaliseren met behulp van echografie, evenals andere in vivo en ex vivo toepassingen. Na de ontwikkeling van deze techniek zijn de effecten van nanodruppelgrootte en gaskerninhoud op in vivo verdampingsdrempels onderzocht met behulp van kleine wijzigingen in dit protocol.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Productie en Targeting van Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Productie van Chemicaliën door<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bamboohydrolysaat gebruiken als voedingsstof

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

Magnetische,akoestische en optisch-drievoudig-responsieve microbubbels voor magnetische hyperthermie en pothotothermale combinatie kankertherapie

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Beeldvorming en kwantificering van het gebied van snel bewegende microbellen met behulp van een high-speed camera en beeldanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Multi-timescale microscopiemethoden voor de karakterisering van fluorescerend gelabelde microbubbels voor echografie-getriggerde medicijnafgifte

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...