Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
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Wir danken Dominique James im Labor von Dr. Ken Hoyt für die TRSP-Analyse von verdampfbaren Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen

1. Lipidfilme herstellen
<ol><li>Bereiten Sie Lipidfilme für die Mikrobläschenerzeugung mit 90% DSPC und 10% DSPE-PEG2K vor, indem Sie die Lipide im richtigen Verhältnis unter Verwendung der folgenden Anweisungen mischen:<ol>
<li>Herstellung von Stammlipiden aus DSPC und DSPE-PEG2K in Chloroform. Wiegen Sie 50 mg jedes Lipidpulvers in separaten Fläschchen. Geben Sie 1 ml Chloroform in jede Durchstechflasche mit einer 1 ml Glasspritze.</li>
		<li>Geben Sie 287 μL DSPC-Material und 113 μL DSPE-PEG2K-Material (beide...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

Es steht eine umfassende Literatur zur Verfügung, die die Formulierung, Physik und mögliche Anwendungen von Mikrobläschen und Phasenverschiebungströpfchen für die In-vivo-Bildgebung und -Therapie diskutiert. Diese Diskussion bezieht sich explizit auf die Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen und deren Umwandlung in Submikron-Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung eines DFB-Gases mit niedrigem Siedepunkt und einer Hochdruckextrusion. Die hier beschriebene Methode soll ein relativ einfaches Verfahren zur Herstell...

Ultraschall-Kontrastmittel (UCAs) werden für Bildgebungs- und Therapieanwendungen immer beliebter. Mikroblasen, die ursprünglichen UCAs, sind derzeit die Mainstream-Wirkstoffe, die in klinischen diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Mikrobläschen sind gasgefüllte Kugeln mit einem Durchmesser von typischerweise 1-10 μm, die von Lipid-, Protein- oder Polymerhüllen umgeben sind1. Ihre Größe und In-vivo-Stabilität können jedoch ihre Funktionalität in vielen Anwendungen einschränken. Phasenverschobene Nanotröpfchen, die einen überhitzten flüssigen Kern enthalten, können einige dieser Einschränkungen aufgrund ihrer geringeren Größe und verbesserten Kreislauflebensdauer überwinden2. Wenn er Hitze oder akustischer Energie ausgesetzt wird, verdampft der überhitzte flüssige Kern zu einer Gasmikrobläsche2,3,4,5. Da die Verdampfungsschwelle in direktem Zusammenhang mit der Tröpfchengröße5,6 steht, wäre die Formulierung von Tröpfchensuspensionen mit einheitlicher Größe sehr wünschenswert, um konsistente Aktivierungsschwellen zu erreichen. Formulierungsverfahren, die einheitliche Tröpfchengrößen erzeugen, sind oft komplex und kostspielig, während kostengünstigere Ansätze zu polydispersen Lösungen führen7. Eine weitere Einschränkung ist die Fähigkeit, stabile Phasenverschiebungströpfchen mit perfluorierten (PFC)-Gasen mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen, was für eine effiziente Aktivierung in vivo8 entscheidend ist. In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur Erzeugung stabiler, gefilterter, verdampfbarer Phasenverschiebungströpfchen mit niedrigem Siedepunkt für In-vivo-Bildgebungs- und Therapieanwendungen beschrieben.
Es gibt viele Methoden zur Herstellung monodispersierter Submikron-Phasenverschiebungströpfchen7. Eine der robustesten Methoden zur Kontrolle der Größe ist die Verwendung von mikrofluidischen Geräten. Diese Geräte können teuer sein, eine langsame Tröpfchenproduktion aufweisen (~ 104-106 Tröpfchen / s) 7 und erfordern ein umfangreiches Training. Mikrofluidische Geräte benötigen im Allgemeinen auch Gase mit hohem Siedepunkt, um eine spontane Verdampfung und Verstopfung des Systems zu vermeiden7. Eine aktuelle Studie von de Gracia Lux et al.9 zeigt jedoch, wie die Kühlung eines Mikrofluididizers verwendet werden kann, um hohe Konzentrationen von Submikron-Phasenverschiebung (1010-1012 / ml) unter Verwendung von Decafluorbutan (DFB) oder Octafluorpropan (OFP) mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen.
Im Allgemeinen sind Niedrigsiedepunktgase wie DFB oder OFP mit vorgeformten Gasblasen einfacher zu handhaben. Verdampfbare Tröpfchen können aus lipidstabilisierten Vorläuferblasen hergestellt werden, indem das Gas bei niedrigen Temperaturen und erhöhtem Druck kondensiert wird5,10. Die Konzentration der mit dieser Methode hergestellten Tröpfchen hängt von der Mikroblasenkonzentration der Vorstufe und der Effizienz der Umwandlung von Blasen in Tröpfchen ab. Konzentrierte Mikrobläschen wurden von der Spitzenbeschallung berichtet, die sich > 1010 MB / ml11 nähert, während eine separate Studie Tröpfchenkonzentrationen von ~ 1-3 x1011 Tröpfchen / ml aus kondensierten OFP- und DFP-Blasen12 gemeldet hat. Wenn monodispersierte Tröpfchen kein Problem darstellen, sind Kondensationsmethoden die einfachsten und kostengünstigsten Methoden zur Erzeugung von lipidstabilisierten Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung von PFCs mit niedrigem Siedepunkt. Methoden zur Erzeugung von Blasen gleichmäßiger Größe vor der Kondensation können dazu beitragen, mehr monodisperse Tröpfchenpopulationen zu erzeugen. Die Erzeugung monodisperser Vorläuferblasen ist jedoch ebenfalls schwierig, was kostspieligere Ansätze wie Mikrofluidik oder wiederholte differentielle Zentrifugationstechniken erfordert11. Ein alternativer Ansatz zur Herstellung von DFB- und OFB-Nanotröpfchen wurde kürzlich unter Verwendung der spontanen Keimbildung von Tröpfchen in Liposomen veröffentlicht13. Diese Methode, die einen "Ouzo" -Effekt verwendet, ist eine einfache Möglichkeit, PFC-Tröpfchen mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen, ohne Blasen kondensieren zu müssen. Die Größenverteilung der PFC-Tröpfchen kann durch delikate Titration und Mischen von PFC-, Lipid- und Ethanolkomponenten gesteuert werden, die zur Einleitung der Keimbildung der Tröpfchen verwendet werden. Es ist auch erwähnenswert, dass das Mischen von perfluorierten Kohlenwasserstoffen verwendet werden kann, um die Stabilität und die Aktivierungsschwellen von Nanotröpfchen zu kontrollieren14,15. Neuere Arbeiten von Shakya et al. zeigen, wie die Nanotröpfchenaktivierung durch Emulgieren von PFCs mit hohem Siedepunkt in einem Kohlenwasserstoff-Endoskelett abgestimmt werden kann, um die heterogene Keimbildung innerhalb des Tröpfchenkerns zu erleichtern16, was ein Ansatz ist, der zusammen mit anderen Formen der Tröpfchengrößenfiltration in Betracht gezogen werden kann.
Einmal gebildet, können Phasenverschiebungströpfchen nach der Bildung extrudiert werden, um mehr monodisperse Populationen zu erzeugen. Tatsächlich wurde ein ähnliches Protokoll wie die hier beschriebene Methode zuvor von Kopechek et al.17 unter Verwendung von Dodecofluorpentan (DDFP) mit hohem Siedepunkt als Tröpfchenkern veröffentlicht. Leser, die Phasenverschiebungströpfchen mit perfluorierten Kohlenwasserstoffen mit hohem Siedepunkt (stabil bei Raumtemperatur) verwenden möchten, sollten stattdessen auf den obigen Artikel verweisen. Das Erzeugen und Extrudieren von Tröpfchen mit Gasen mit niedrigem Siedepunkt wie DFB und OFP ist komplizierter und wird am besten durch Kondensieren von vorgeformten Gasblasen angegangen.
In diesem Protokoll wird eine gängige Methode zur Erzeugung von vorgeformten Lipid-Mikrobläschen mit einem DFB-Gaskern mittels Sondenspitzen-Beschallung beschrieben. Als nächstes wird ein kommerzieller Extruder verwendet, um vorgeformte Mikrobläschen zu Submikron-Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen zu kondensieren (Abbildung 1). Die entstehenden Tröpfchen sind dann durch Hitze und Ultraschall aktierbar. Diese Methode kann größere Mengen an Nanotröpfchenlösung erzeugen als herkömmliche Kondensationsmethoden mit engeren Größenverteilungen, ohne dass teure mikrofluidische Geräte erforderlich sind. Die Herstellung von Nanotröpfchenlösungen mit engen Größenverteilungen kann wahrscheinlich gleichmäßigere Verdampfungsschwellen erzeugen. Dies wird ihr Potenzial für zahlreiche Anwendungen wie Bildgebung, Ablation, Arzneimittelabgabe und Embolisation maximieren1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hochdruck-Extrusionsaufbaus zur Kondensation von vorgeformten Mikrobläschen zu phasenverschobenen Nanotröpfchen. Mikrobläschenlösung wird in die Extruderkammer gegeben und in ihr enthalten, und 250 psi aus dem Stickstofftank werden durch das Kammereinlassventil aufgetragen. Das Stickstoffgas drückt die Mikrobläschenlösung durch den Filter an der Basis der Kammer und kondensiert die Probe zu Nanotröpfchen. Die Lösung wird schließlich durch das Probenauslassrohr aus dem Extruder geschoben und gesammelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Es gibt viele Methoden, die zur Herstellung von verdampfbaren Phasenverschiebungströpfchen für die Bildgebung und Therapie verwendet werden können. Jede Methode verwendet unterschiedliche Techniken und variiert in Preis, Material und Zweck. Viele dieser Herstellungsmethoden führen zu polydispersen Populationen mit ungleichmäßigen Aktivierungsschwellen. Darüber hinaus erfordert die Kontrolle der Tröpfchengrößen typischerweise stabile Perfluorcarbonflüssigkeiten mit hohen Aktivierungsschwellen, die in vivo nicht praktikabel sind. Die Herstellung einheitlicher Tröpfchengrößen unter Verwendung von Gasen mit niedrigem Siedepunkt wäre für In-vivo-Bildgebungs- und Therapieexperimente von Vorteil. Dieser Artikel beschreibt eine einfache und wirtschaftliche Methode zur Bildung von größengefilterten lipidstabilisierten Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen mit niedrig siedendem Decafluorbutan (DFB). Eine gängige Methode zur Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen wird beschrieben, zusätzlich zu einer neuartigen Methode, sie mit Hochdruckextrusion in einem einzigen Schritt zu kondensieren. Diese Methode wurde entwickelt, um Zeit zu sparen, die Effizienz zu maximieren und größere Mengen an Mikroblasen- und Nanotröpfchenlösungen für eine Vielzahl von Anwendungen mit gängigen Laborgeräten zu erzeugen, die in vielen biologischen Labors zu finden sind.

Repräsentative Ergebnisse der Größenverteilung sind unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung (DLS) und der abstimmbaren resistiven Pulserfassung (TRSP) enthalten. Abbildung 5 zeigt die Größenverteilung von kondensierten Blasenlösungen mit und ohne Extrusion. Ohne Extrusion endet das Protokoll bei Schritt 5.3. Die gekühlten Blasen werden kondensiert, indem die Probe kalt auf Atmosphärendruck entlüftet wird. Die kondensierte einzige Probe hat eine viel breitere Verteilung in der...

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Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen lipidverkapselter Decafluorbutan-Mikrobläschen mittels Sondenspitzen-Beschallung und anschließender Kondensation zu phasenverschobenen Nanotröpfchen mittels Hochdruckextrusion und mechanischer Filtration.

Herstellung von membrangefilterten Phase-Shift-Decafluorbutan-Nanotröpfchen aus vorgeformten Mikrobläschen

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Dieses Protokoll ist eine einfache Methode zur Verringerung der Polydispersität von verdampfbaren Tröpfchen mit niedrigem Siedepunkt für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Diese Technik kondensiert vorgeformte Gasmikrobläschen und filtert die resultierenden Flüssigkeitströpfchen nach Größe auf eine Weise, die kontrollierbar, skalierbar und relativ kostengünstig ist. Diese Methode kann auf eine Vielzahl von Lipid-Mikrobläschen mit unterschiedlichem Schalen- und Gasmaterial angewendet werden, wobei verschiedene Filter verwendet werden, um die endgültige Tröpfchengröße zu kontrollieren.Darrah Merillat, ein Undergraduate-Forscher aus Dr. Sirsis Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Schalten Sie den Netzschalter für den Ultraschallgerät ein und stellen Sie die Amplitude mit dem Mikrospitzenaufsatz auf das maximal zulässige Maß ein, und stellen Sie sicher, dass die Beschallungszeit auf 10 Sekunden eingestellt ist. Legen Sie die warme hydratisierte Lipidlösung mit der Mikrospitze direkt unter der Oberfläche in das Schallgehäuse.Befestigen Sie eine geeignete Schlauchlänge am Hals der Durchstechflasche, um das Gas aus dem DFB-Tankauslass in die warme Lipidlösung im Gehäuse zu leiten. Öffnen Sie das Tankventil langsam, bis das Gas über die Lipidlösung fließt und leichte Wellen auf der Oberfläche der Flüssigkeit verursacht. Wenn der Gasfluss zu hoch ist, läuft die Lösung während der Bildung von Mikroblasen über.Starten Sie den Ultraschallgerät und lassen Sie ihn 10 Sekunden lang kontinuierlich laufen, um Mikroblasen zu erzeugen. Nachdem die Beschallung beendet ist, schließen Sie sofort das DFB-Tankventil. Schließen Sie die Mikrobläschenlösung schnell ab und tauchen Sie die Durchstechflasche in ein Eisbad, um die Probe unter 55 Grad Celsius abzukühlen.Verwenden Sie einen 200-Nanometer-Keramikfilter, um den Hochdruckextruder gemäß der Bedienungsanleitung zusammenzubauen, und legen Sie ihn in die Mitte eines wasserdichten Behälters, so dass das Probenauslassrohr nicht an die Seite gedrückt oder gekräuselt wird. Koppeln Sie den Extruder mit dem vom Hersteller gelieferten Adapter an den Stickstoffgastank. Legen Sie das Ende des Auslassrohrs in eine Szintillationsflasche, um die extrudierte Probe zu sammeln, und befestigen Sie das Röhrchen mit Klebeband am Behälter, um in der Durchstechflasche zu bleiben.Öffnen und schließen Sie das Entriegelungsventil, um sicherzustellen, dass kein Druck im Extruder vorhanden ist. Entfernen Sie den Kammerdeckel. Und geben Sie fünf Milliliter PBS in die Extruderkammer.Setzen Sie den Deckel wieder ein und stellen Sie sicher, dass er wieder sicher einrastet. Öffnen Sie den Stickstoffgastank, so dass das Manometer 250 PSI anzeigt, und stellen Sie sicher, dass sich das Druckregelventil in der geschlossenen Position befindet. Schließen Sie den Gastank und öffnen Sie das Einlassventil der Extruderkammer, wodurch die PBS-Lösung durch das System gedrückt und das Probenauslassrohr in die Szintillationsflasche herausgeschoben wird.Wenn nur Gas aus dem Schlauch austritt, öffnen Sie das Freigabeventil und lassen Sie den Druck auf Null PSI fallen. Entfernen Sie dann die Szintillationsfläschchen. Öffnen und schließen Sie das Ablassventil, um sicherzustellen, dass sich kein Druck im Extruder befindet, und legen Sie eine neue Szintillationsflasche am Ende des Auslassrohrs.Füllen Sie einen Stahlbehälter mit 2-Methylbutan und fügen Sie Trockeneis hinzu, um die Temperatur auf minus 18 Grad Celsius zu senken. Geben Sie die Mikrobläschenlösung in das gekühlte 2-Methylbutan und tauchen Sie die Probe für zwei Minuten unter. Bewegen Sie die Szintillationsfläschchen während der zwei Minuten, um die Blasen vorsichtig zu mischen.Fügen Sie nach Bedarf Trockeneis hinzu, um die Temperatur zwischen minus 15 und minus 18 Grad Celsius zu halten. Nach zwei Minuten entfernen Sie die Mikrobläschen aus dem gekühlten 2-Methylbutan. Schwenken Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Mikrobläschen zu mischen, und übertragen Sie die Blasen in eine gekühlte 10-Milliliter-Spritze.Entfernen Sie den Deckel der Extruderkammer und geben Sie die Mikrobläschenlösung in die Kammer, indem Sie den Kolben langsam auf die Spritze drücken. Setzen Sie die Extruderkappe wieder ein, und stellen Sie sicher, dass sie sicher einrastet. Stellen Sie sicher, dass sich das Druckregelventil und das Ablassventil des Extruders in der geschlossenen Position befinden.Öffnen Sie den Stickstoffgastank, bis das Manometer 250 PSI anzeigt. Schließen Sie den Gastank und drehen Sie das Druckregelventil in die geöffnete Position. Wenn die Lösung das Szintillationsfläschchen am Ausgangsschlauch gefüllt hat und nur Gas aus dem Rohr austritt, öffnen Sie langsam das Druckentlastungsventil und lassen Sie den Druck auf Null PSI fallen.10 Milliliter der extrudierten Tröpfchenlösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Zentrifugieren Sie die extrudierte Probe bei 1.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und die spontan verdampften Tröpfchen, die an der Oberseite der Lösung erscheinen.Resuspendierung des Pellets, das DFP-Nanotröpfchen in 10 Milliliter PBS mit 20% Glycerin und 20% Propylenglykol enthält. Die Größenverteilung von kondensierten Blasenlösungen mit und ohne Extrusion zeigt, dass die kondensierte einzige Probe eine viel breitere Verteilung in der Nähe von 400 Nanometern hat, während die extrudierte Probe eine engere Verteilung bei 200 Nanometern hat. Eine abstimmbare Widerstandspulssensoranalyse, die zur Analyse von Phasenverschiebungströpfchen verwendet wird, wenn sie durch Zentrifugation gewaschen wurden, um überschüssige Liposomen zu entfernen, zeigt, dass die Tröpfchengrößen in der Nähe von 200 Nanometern liegen.Die Mikroskopiedaten der Nanotröpfchenverdampfung beim Erhitzen zeigen, dass einige spontan verdampfte Mikroblasen vor dem Erhitzen im Sichtfeld sichtbar sind und eine größere Anzahl von Gasmikroblasen nach dem Erhitzen beobachtet wird. Hier werden die Mikroskopiebilder von Nanotröpfchen gezeigt, die direkt ohne Vorkühlung in den Extruder eingeführt, bei null Grad Celsius und bei minus 18 Grad Celsius kondensiert werden. Repräsentative Bilder von kondensierten Octafluorpropantröpfchen vor und nach der Verdampfung zeigen auch eine größere Anzahl von Gasmikrobläschen nach dem Erhitzen, ähnlich den DFB-Tröpfchen.Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, dass die Tröpfchenausbeute während der Kondensation stark von der Temperatur und dem Druck abhängt und leichte Schwankungen die Ergebnisse beeinflussen. Nach der Erzeugung verdampfbarer Tröpfchen können sie verwendet werden, um die In-vivo-Bildgebung und die Arzneimittelabgabe mittels Ultraschall sowie andere In-vivo- und Ex-vivo-Anwendungen zu optimieren. Nach der Entwicklung dieser Technik wurden die Auswirkungen der Nanotröpfchengröße und des Gaskerngehalts auf die In-vivo-Verdampfungsschwellen durch leichte Modifikationen dieses Protokolls untersucht.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Forschung

Biotechnik

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Herstellung von Chemikalien durch<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bambushydrolysat als Ausgangsmaterial verwenden

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

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Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

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