Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

ברצוננו להודות לדומיניק ג'יימס במעבדתו של ד"ר קן הויט על שסיפק ניתוח TRSP של ננו-טיפות פאזה-הסטה בלתי ניתנות לערפדיות

1. ביצוע סרטי שומנים בדם
<ol><li>הכן סרטי שומנים לדור microbubble באמצעות 90% DSPC ו 10% DSPE-PEG2K על ידי ערבוב השומנים ביחס הנכון באמצעות הכיוונים הבאים:<ol>
<li>הפוך שומנים מלאי של DSPC ו DSPE-PEG2K בכלורופורם. שקול 50 מ"ג של כל אבקת שומנים בבקבוקונים נפרדים. הוסף 1 מ"ל של כלורופורם לכל בקבוקון באמצעות מזרק זכוכית 1 מ"ל.<...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

גוף ספרות מקיף זמין הדן בניסוח, בפיזיקה וביישומים פוטנציאליים של מיקרו-יבלות וטיפות פאזה-הסטה להדמיה וטיפול ב- vivo. דיון זה נוגע במפורש ליצירת מיקרו-חלוקי שומנים ולהמרתם לטירות משנה-מיקרון של העברת פאזה באמצעות גז DFB של נקודת רתיחה נמוכה ושחול בלחץ גבוה. השיטה המתוארת כאן נועדה לספק שיטה פש?...

סוכני ניגודיות אולטראסאונד (UCAs) גדלים במהירות בפופולריות עבור יישומי הדמיה וטיפול. Microbubbles, UCAs המקורי, הם כיום סוכני המיינסטרים המשמשים ביישומי אבחון קליניים. Microbubbles הם כדורים מלאים בגז, בדרך כלל 1-10 מיקרומטר קוטר, מוקף שומנים, חלבון, או קליפות פולימר1. עם זאת, גודלם ויציבותם יכולים להגביל את הפונקציונליות שלהם ביישומים רבים. ננו-טיפות פאזה, המכילות ליבה נוזלית מחוממת במיוחד, יכולות להתגבר על חלק מהמגבלות הללו בשל גודלן הקטן יותר ושיפור מחזור החיים2. כאשר הם נחשפים לחום או לאנרגיה אקוסטית, הליבה הנוזלית החמה מתאדה ויוצרת מיקרו-bble גז2,3,4,5. מכיוון שסף האידוי קשור ישירות לגודל טיפה 5,6, גיבוש מתלים טיפה בגודל אחיד יהיה רצוי מאוד להשגת סף הפעלה עקבי. שיטות ניסוח המייצרות גדלי טיפה אחידים הן לעתים קרובות מורכבות ויקרות, בעוד גישות חסכוניות יותר גורמות לפתרונות פולידיספרסה7. מגבלה נוספת היא היכולת לייצר טיפות יציבות של הסטת פאזה עם גזי פרפלואורוקרבון (PFC) בעלי נקודת רתיחה נמוכה, שהיא קריטית להפעלה יעילה ב-vivo8. בכתב יד זה, פרוטוקול מתואר ליצירת טיפות יציבות של נקודה נמוכה המסוננות ברתיחה נמוכה עבור יישומי הדמיה וטיפול ב- vivo.
ישנן שיטות רבות לייצור טיפות שינוי פאזה מונודיספרסות 7. אחת השיטות החזקות ביותר לשליטה בגודל היא השימוש במכשירים מיקרופלואידיים. מכשירים אלה יכולים להיות יקרים, יש שיעורים איטיים של ייצור טיפות (~ 104-106 טיפות / s)7, ודורשים הכשרה נרחבת. התקנים מיקרופלואידיים דורשים בדרך כלל גזים בנקודת רתיחה גבוהה כדי למנוע אידוי ספונטני וסתימה של המערכת7. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה על ידי דה Gracia Lux et al.9 מדגים כיצד קירור microfluidizer יכול לשמש כדי ליצור ריכוזים גבוהים של שינוי פאזה תת מיקרון (1010-1012/mL) באמצעות decafluorobutane נקודת רתיחה נמוכה (DFB) או octafluoropropane (OFP).
באופן כללי, גזים נקודת רתיחה נמוכה כגון DFB או OFP קל יותר להתמודד באמצעות בועות גז מעוצב מראש. טיפות Vaporizable ניתן לייצר מבועות מיוצבת שומנים מראש על ידי עיבוי הגז באמצעות טמפרטורות נמוכות ולחץ גבוה5,10. ריכוז הטיפות המיוצרות בשיטה זו תלוי בריכוז מיקרו-בועות מבשר ויעילות ההמרה של בועות לט טיפות. מיקרו-בועות מרוכזות דווחו מ- sonication טיפ המתקרב > 1010 MB/mL11, בעוד מחקר נפרד דיווח על ריכוזי טיפות הנעים בין ~ 1-3 x1011 טיפות / מ"ל מבועות OFP ו- DFP מרוכזות12. כאשר טיפות מונודיספרסיות אינן דאגה, שיטות עיבוי הן השיטות הפשוטות ביותר בעלות הנמוכה ביותר ליצירת טיפות הזזת פאזה מיוצבות בשומנים באמצעות PFCs של נקודת רתיחה נמוכה. שיטות ליצירת בועות בגודל אחיד לפני עיבוי יכולות לעזור ליצור אוכלוסיות מונודיספרזה יותר של טיפות. עם זאת, יצירת בועות מבשרי monodisperse היא גם קשה, הדורש גישות יקרות יותר כגון microfluidics או טכניקות צנטריפוגה דיפרנציאלית חוזרת11. גישה חלופית לייצור ננו-טיפות DFB ו- OFB פורסמה לאחרונה באמצעות התגרענות ספונטנית של טיפות בליפוזומים13. שיטה זו, תוך שימוש באפקט "אוזו", היא דרך פשוטה ליצור טיפות PFC בנקודת רתיחה נמוכה ללא צורך לדחוס בועות. התפלגות הגודל של טיפות PFC יכולה להיות נשלטת על ידי titration עדין ערבוב PFC, שומנים, ואתנול רכיבים המשמשים ליזום התגרענות של טיפות. ראוי גם לציין כי ערבוב של perfluorocarbons יכול לשמש כדי לשלוט ביציבות סף הפעלה של nanodroplets14,15. עבודה עדכנית יותר על ידי Shakya ואח 'מדגים כיצד הפעלת nanodroplet ניתן לכוונן על ידי אמולסיה של PFCs נקודת רתיחה גבוהה אמולסיה בתוך אנדוסקלטון פחמימנים כדי להקל על התגרענות הטרוגנית בתוך הליבה טיפה16, שהיא גישה שניתן לשקול יחד עם צורות אחרות של סינון גודל טיפה.
לאחר שנוצר, טיפות פאזה-shift ניתן להבלט לאחר היווצרות כדי ליצור אוכלוסיות monodisperse יותר. למעשה, פרוטוקול דומה לשיטה המתוארת כאן פורסם בעבר על ידי Kopechek et al.17 באמצעות dodecofluorpentane נקודת רתיחה גבוהה (DDFP) כליבה טיפה. קוראים המבקשים להשתמש טיפות פאזה-shift עם perfluorocarbons נקודת רתיחה גבוהה (יציב בטמפרטורת החדר) צריך להתייחס למאמר לעיל במקום. ייצור וחילוק טיפות עם גזים נקודת רתיחה נמוכה, כגון DFB ו- OFP, הוא מסובך יותר והוא ניגש בצורה הטובה ביותר על ידי עיבוי בועות גז מעוצבות מראש.
בפרוטוקול זה, שיטה נפוצה של יצירת microbubbles שומנים מראש עם ליבת גז DFB באמצעות sonication קצה בדיקה מתואר. לאחר מכן, אקסלר מסחרי משמש לדחיסת מיקרו-יבלות מעוצבות מראש לננו-טיפות משנה של הסטת פאזה (איור 1). הטיפות המתקבלות ניתנות להפעלה על ידי חום ואולטרסאונד. שיטה זו יכולה לייצר כמויות גדולות יותר של פתרון nanodroplet מאשר שיטות עיבוי קונבנציונליות עם חלוקת גודל צרה יותר ללא צורך במכשירים מיקרופלואידיים יקרים. ייצור פתרונות ננו-טיפות עם התפלגות גודל צרה יכול ככל הנראה ליצור סף אידוי אחיד יותר. זה ימקסם את הפוטנציאל שלהם עבור יישומים רבים כגון הדמיה, אבלציה, משלוח סמים, תסחיף1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של מערך שחול בלחץ גבוה לעיבוי מיקרו-חלוקים מעוצבים מראש לננו-טיפות פאזה.. פתרון Microbubble מתווסף ומכולם בתא extruder, ו 250 פסאיי, ממיכל החנקן, מוחל דרך שסתום הכניסה של החדר. גז החנקן ידחוף את תמיסת המיקרו-חלוק דרך המסנן שבבסיס התא, וידחוס את הדגימה לננו-טיפות. הפתרון נדחף סוף סוף מתוך extruder דרך צינור שקע מדגם ונאסף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

ישנן שיטות רבות שניתן להשתמש בהן לייצור טיפות פאזה-shift הניתנות להדמיה וטיפול. כל שיטה משתמשת בטכניקות שונות ומשתנה במחיר, בחומרים ובמטרה. רבות משיטות הייצור הללו גורמות לאוכלוסיות רב-ממדיספרס עם סף הפעלה לא אחיד. בנוסף, שליטה בגדלי הטיפות בדרך כלל דורשת נוזלים יציבים perfluorocarbon עם סף הפעלה גבוה שאינם מעשיים vivo. הפקת גדלי טיפה אחידים באמצעות גזים בנקודת רתיחה נמוכה תועיל לניסויים בהדמיה וטיפול ב- vivo. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית להיווצרות ננו-טיפות הזזת פאזה מיוצבות-שומנים עם נקודת רתיחה נמוכה decafluorobutane (DFB). שיטה נפוצה ליצירת מיקרו-חלוקי שומנים מתוארת, בנוסף לשיטה חדשנית של עיבוי אותם עם שחול בלחץ גבוה בשלב אחד. שיטה זו נועדה לחסוך זמן, למקסם את היעילות ולייצר כמויות גדולות יותר של פתרונות microbubble וננו-טיפות למגוון רחב של יישומים באמצעות ציוד מעבדה משותף שנמצא במעבדות ביולוגיות רבות.

תוצאות מייצגות של התפלגות הגודל כלולות באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) וניתוח חישת פעימות התנגדותית (TRSP). איור 5 מציג את התפלגות הגודל של פתרונות בועות מרוכזים עם ובלי שחול. ללא שחול, הפרוטוקול מסתיים בשלב 5.3. הבועות המצונן מרוכזות על ידי אוורור המדגם ללחץ אטמוספרי בזמן הקור. המד...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת כמויות גדולות של מיקרו-נבלות decafluorobutane משומנים באמצעות sonication קצה בדיקה ולאחר מכן עיבוי אותם לתוך nanodroplets פאזה שינוי באמצעות שחול בלחץ גבוה סינון מכני.

ייצור של ננו-טיפות דקפלואורובוטן מסוננות פאמברנה ממיקרו-טבלים מעוצבים מראש

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

פרוטוקול זה הוא שיטה קלה להפחתת polydispersity של טיפות vaporizable נקודת רתיחה נמוכה לשימוש ביישומים ביו-רפואיים. טכניקה זו מעיבה מיקרו-חלוקי גז מעוצבים ומסננת את הטיפות הנוזליות המתקבלות לפי גודלן באופן שניתן לשלוט בהן, מדרגיות וחסכוני יחסית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של microbubbles שומנים עם פגז שונים וחומר גז באמצעות מסננים שונים כדי לשלוט בגודל טיפה סופית.מי שתדגים את ההליך תהיה דארה מרילאט, חוקרת לתואר ראשון במעבדתו של ד"ר סירסי. הפעל את מתג ההפעלה עבור sonicator, והגדר את המשרעת למקסימום המותר באמצעות הקובץ המצורף microtip, ולהבטיח זמן sonication מוגדר ל 10 שניות. מניחים את תמיסת השומנים החם במתחם הקול עם המיקרו-קצה ממש מתחת לפני השטח.חבר אורך מתאים של צינורות לצוואר של הקרבון כדי להנחות את הגז משקע טנק DFB לתוך תמיסה שומנים חמים המוחזק במתחם. פתח את שסתום המיכל לאט עד שניתן לראות את הגז זורם מעל תמיסה השומנים, גרימת גלים קלים על פני השטח של הנוזל. אם זרימת הגז גבוהה מדי, הפתרון יעלה על גדותיו במהלך היווצרות חלוקי מיקרו.הפעל את sonicator, ולהפעיל אותו במשך 10 שניות ברציפות כדי ליצור microbubbles. לאחר sonication נגמר, מיד לסגור את שסתום טנק DFB. מכסים במהירות את תמיסת המיקרו-חלוק, ומטביעים את הנקניקיון באמבט קרח כדי לקרר את המדגם מתחת ל-55 מעלות צלזיוס.השתמש מסנן קרמיקה 200 ננומטר כדי להרכיב את מכבש בלחץ גבוה על פי המדריך של המשתמש, ומניח אותו במרכז מיכל אטום למים, כך צינור שקע מדגם לא נלחץ נגד הצד, או קמט. צמד את המהלל למיכל גז חנקן באמצעות המתאם שסופק על ידי היצרן. מניחים את קצה צינור השקע בלוויינית נוצצת כדי לאסוף את הדגימה המובלטת, ומאבטחים את הצינור למיכל עם סרט הדבקה כדי להישאר בתוך הוויאל.פתח וסגור את שסתום השחרור כדי להבטיח שאין לחץ בתוך המהלל. הסר את מכסה התא. ולהוסיף חמישה מיליליטר של PBS לתא המהלל.החלף את המכסה, ודא שהוא לוחץ בבטחה בחזרה למקומו. פתח את מיכל הגז חנקן, כך מד הלחץ קורא 250 PSI, מוודא שסתום בקרת הלחץ הוא במצב סגור. סגור את מיכל הדלק, ופתח את שסתום הכניסה של תא ההצצה, מה שגורם לתמיסת PBS להידחף דרך המערכת, ולהוציא את צינור שקע הדגימה לתוך מטען הניצוצות.כאשר רק גז יוצא הצינורות, לפתוח את שסתום השחרור, ולאפשר ללחץ ליפול לאפס PSI. ואז להסיר את מבחן הניצוץ. פתח וסגור את שסתום השחרור כדי לוודא שאין לחץ בתוך המהלוך, ולהניח מקטורן נוצץ חדש בקצה צינור השקע.מלא מיכל פלדה עם 2-מתילבוטן, ולהוסיף קרח יבש כדי להוריד את הטמפרטורה למינוס 18 מעלות צלזיוס. הכנס את פתרון microbubble לתוך 2-מתילבוטן צונן, שקוע המדגם במשך שתי דקות. הזז את מילון הניקוד לאורך שתי הדקות כדי לערבב בעדינות את הבועות.מוסיפים קרח יבש לפי הצורך כדי לשמור על הטמפרטורה בין מינוס 15 למינוס 18 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות, להסיר את microbubbles מן 2-מתילבוטן צונן. מערבבים בעדינות את המיקרו-בועות ומעבירים בועות למזרק צונן של 10 מיליליטר.הסר את מכסה תא extruder, ולהוסיף את פתרון microbubble לתא על ידי לחיצה איטית על הבוכנה על המזרק. החלף את מכסה ההפרש, ודא שהוא לוחץ בצורה מאובטחת במקום. ודא כי שסתום בקרת הלחץ ואת שסתום השחרור של extruder נמצאים במצב סגור.פתח את מיכל הדלק של החנקן עד שמד הלחץ יקרא 250 PSI. סגור את מיכל הדלק, ולהפוך את שסתום בקרת הלחץ למיקום הפתוח. כאשר הפתרון מילא את מקטורן הניצוצים בצינורות היציאה ורק גז יוצא מהצינור, פתח לאט את שסתום שחרור הלחץ, ואפשר ללחץ ליפול לאפס PSI.העבר 10 מיליליטר של פתרון טיפה שחול לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה הדגימה המובלטת ב 1, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את supernatant ואת טיפות התאדו באופן ספונטני המופיעים בחלק העליון של הפתרון.להשעות מחדש את הכדור הכולל ננו-טיפות DFP ב 10 מיליליטר של PBS עם 20%גליצלול ו 20%פרופילן גליקול. התפלגות הגודל של פתרונות בועה מרוכזת עם ובלי שחול מראה כי המדגם המרוכז בלבד יש התפלגות רחבה בהרבה מרוכזת ליד 400 ננומטר, בעוד המדגם המובלט יש התפלגות צרה יותר מרוכזת ב 200 ננומטר. ניתוח חישת דופק התנגדות טונה המשמש לניתוח טיפות הזזת פאזה כפי שהם נשטפו על ידי צנטריפוגה כדי להסיר ליפוזומים עודפים מראה כי גדלי טיפה הם קרובים 200 ננומטר.נתוני המיקרוסקופיה של אידוי ננו-טיפות כאשר מחומם מראים כי כמה microbubbles התאדו באופן ספונטני ניכרים בשדה הראייה לפני החימום, ומספר גדול יותר של microbubbles גז נצפים לאחר חימום. תמונות המיקרוסקופיה של ננו-טיפות מוכנסות למחשוף ישירות ללא קירור מראש, מרוכזות באפס מעלות צלזיוס, ובמינוס 18 מעלות צלזיוס מוצגות כאן. תמונות מייצגות של טיפות אוקטפלואורורופפן מרוכזות לפני ואחרי אידוי מראות גם מספר גדול יותר של מיקרו-חלוקי גז לאחר החימום, בדומה לטפתיות DFB.הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי תפוקת טיפה תלויה מאוד בטמפרטורה והלחץ במהלך עיבוי, וריאציות קלות ישפיעו על התוצאות. לאחר יצירת טיפות vaporizable, הם יכולים לשמש כדי לייעל הדמיה vivo ומשלוח סמים באמצעות אולטרסאונד, כמו גם אחרים in vivo ו ex vivo יישומים. לאחר פיתוח טכניקה זו, ההשפעות של גודל nanodroplet ותכולת ליבת הגז על סף אידוי ויואו נחקרו באמצעות שינויים קלים לפרוטוקול זה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

ייצור ומיקוד של חד-אנרגיה קוונטית נקודות

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

ייצור כימיקלים לפי<em&gt; קלבסילה דלקת ריאות</em&gt; באמצעות הידרוליזה במבוק כמו זינה

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

הפקת מיקרופלואידים של Lysolipid המכילים טמפרטורה רגישה ליפוזומים

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

מיקרו-גיבלים מגנטיים, אקוסטיים ואופטיים-משולשים-רספונסיביים לטיפול בסרטן משולב של פוטוטותרמיה

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

הדמיה וכמות של האזור של מיקרו-bubbles הנע במהירות באמצעות מצלמה במהירות גבוהה וניתוח תמונה

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

שיטות מיקרוסקופיה מרובות זמן לאפיון של Microbubbles פלואורסצנטרית שכותרתו לשחרור תרופות מופעלות אולטרסאונד

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...