Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Dominique James nel laboratorio del Dr. Ken Hoyt per aver fornito l'analisi TRSP di nanogoccioline a sfasamento vaporizzabili

1. Fare film lipidici
<ol><li>Preparare i film lipidici per la generazione di microbolle utilizzando il 90% di DSPC e il 10% di DSPE-PEG2K mescolando i lipidi al rapporto corretto utilizzando le seguenti indicazioni:<ol>
<li>Produrre lipidi di riserva di DSPC e DSPE-PEG2K in cloroformio. Pesare 50 mg di ogni polvere lipidica in flaconcini separati. Aggiungere 1 mL di cloroformio a ciascun flaconcino utilizzando una siringa di vetro da 1 mL.</li>
		<li>Aggiungere 287 μL di DSPC stock e 113 μL di DSPE-PEG2K stock (entr...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

È disponibile un corpus completo di letteratura che discute la formulazione, la fisica e le potenziali applicazioni di microbolle e goccioline a sfasamento per l'imaging e la terapia in vivo. Questa discussione riguarda esplicitamente la generazione di microbolle lipidiche e la loro conversione in goccioline a sfasamento sub-micron utilizzando un gas DFB a basso punto di ebollizione ed estrusione ad alta pressione. Il metodo qui delineato ha lo scopo di fornire un metodo relativamente semplice per produrre grandi quanti...

Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni (UCA) stanno rapidamente crescendo in popolarità per le applicazioni di imaging e terapia. Le microbolle, gli UCA originali, sono attualmente gli agenti principali utilizzati nelle applicazioni diagnostiche cliniche. Le microbolle sono sfere piene di gas, tipicamente di 1-10 μm di diametro, circondate da gusci lipidici, proteici o polimerici1. Tuttavia, le loro dimensioni e la stabilità in vivo possono limitare la loro funzionalità in molte applicazioni. Le nanogoccioline a sfasamento, che contengono un nucleo liquido surriscaldato, possono superare alcune di queste limitazioni a causa delle loro dimensioni più ridotte e della migliore durata della circolazione2. Se esposto al calore o all'energia acustica, il nucleo liquido surriscaldato vaporizza per formare una microbolletta di gas2,3,4,5. Poiché la soglia di vaporizzazione è direttamente correlata alla dimensione delle goccioline5,6, la formulazione di sospensioni di goccioline con dimensioni uniformi sarebbe altamente auspicabile per raggiungere soglie di attivazione coerenti. I metodi di formulazione che producono dimensioni uniformi delle goccioline sono spesso complessi e costosi, mentre approcci più convenienti si traducono in soluzioni polidisperse7. Un'altra limitazione è la capacità di generare goccioline stabili a sfasamento con gas perfluorocarburi (PFC) a basso punto di ebollizione, che è fondamentale per un'attivazione efficiente in vivo8. In questo manoscritto, viene descritto un protocollo per la generazione di goccioline a sfasamento vaporizzabili a basso punto di ebollizione filtrate stabili per applicazioni di imaging e terapia in vivo.
Esistono molti metodi per produrre goccioline a sfasamento submicroniche monodisperse7. Uno dei metodi più robusti per controllare le dimensioni è l'uso di dispositivi microfluidici. Questi dispositivi possono essere costosi, avere tassi lenti di produzione di goccioline (~ 104-106 goccioline / s) 7 e richiedono una formazione approfondita. Anche i dispositivi microfluidici richiedono generalmente gas ad alto punto di ebollizione per evitare la vaporizzazione spontanea e l'intasamento del sistema7. Tuttavia, un recente studio di de Gracia Lux et al.9 dimostra come il raffreddamento di un microfluidizzatore possa essere utilizzato per generare alte concentrazioni di sfasamento sub-micron (1010-1012 / mL) utilizzando decafluorobutano a basso punto di ebollizione (DFB) o ottafluoropropano (OFP).
In generale, i gas a basso punto di ebollizione come DFB o OFP sono più facili da gestire utilizzando bolle di gas preformate. Le goccioline vaporizzabili possono essere prodotte da bolle precursori stabilizzate ai lipidi condensando il gas utilizzando basse temperature e pressione elevata5,10. La concentrazione di goccioline prodotte con questo metodo dipende dalla concentrazione di microbolle precursori e dall'efficienza di conversione delle bolle in goccioline. Microbolle concentrate sono state riportate da una sonicazione della punta che si avvicina > 1010 MB / mL11, mentre uno studio separato ha riportato concentrazioni di goccioline che vanno da ~ 1-3 x1011 goccioline / mL da bolle condensate OFP e DFP12. Quando le goccioline monodisperse non sono un problema, i metodi di condensazione sono i metodi più semplici e più economici per generare goccioline a sfasamento stabilizzate con lipidi utilizzando PFC a basso punto di ebollizione. I metodi per generare bolle di dimensioni uniformi prima della condensazione possono aiutare a creare più popolazioni monodisperse di goccioline. Tuttavia, anche la generazione di bolle precursori monodisperse è difficile, richiedendo approcci più costosi come la microfluidica o tecniche di centrifugazione differenziale ripetuta11. Un approccio alternativo alla produzione di nanogoccioline DFB e OFB è stato recentemente pubblicato utilizzando la nucleazione spontanea di goccioline nei liposomi13. Questo metodo, che utilizza un effetto "Ouzo", è un modo semplice per generare goccioline PFC a basso punto di ebollizione senza dover condensare bolle. La distribuzione dimensionale delle goccioline PFC può essere controllata mediante una delicata titolazione e miscelazione di componenti PFC, lipidi ed etanolo utilizzati per avviare la nucleazione delle goccioline. Vale anche la pena notare che la miscelazione di perfluorocarburi può essere utilizzata per controllare la stabilità e le soglie di attivazione delle nanogoccioline14,15. Un lavoro più recente di Shakya et al. dimostra come l'attivazione delle nanogoccioline possa essere sintonizzata emulsionando PFC ad alto punto di ebollizione all'interno di un endoscheletro di idrocarburi per facilitare la nucleazione eterogenea all'interno del nucleo di goccioline16, che è un approccio che può essere considerato insieme ad altre forme di filtrazione delle dimensioni delle goccioline.
Una volta formate, le goccioline a sfasamento possono essere estruse dopo la formazione per creare più popolazioni monodisperse. In effetti, un protocollo simile al metodo qui descritto è stato pubblicato in precedenza da Kopechek et al.17 utilizzando il dodecofluorpentano ad alto punto di ebollizione (DDFP) come nucleo di goccioline. I lettori che cercano di utilizzare goccioline a sfasamento con perfluorocarburi ad alto punto di ebollizione (stabili a temperatura ambiente) dovrebbero invece fare riferimento all'articolo sopra. Generare ed estrudere goccioline con gas a basso punto di ebollizione, come DFB e OFP, è più complicato e si avvicina meglio condensando bolle di gas preformate.
In questo protocollo, viene descritto un metodo comune per generare microbolle lipidiche preformate con un nucleo di gas DFB utilizzando la sonicazione della punta della sonda. Successivamente, un estrusore commerciale viene utilizzato per condensare microbolle preformate in nanogoccioline a sfasamento submicroniche (Figura 1). Le goccioline risultanti sono quindi attivabili dal calore e dagli ultrasuoni. Questo metodo può produrre volumi maggiori di soluzione di nanogoccioline rispetto ai metodi di condensazione convenzionali con distribuzioni dimensionali più strette senza la necessità di costosi dispositivi microfluidici. La produzione di soluzioni di nanogoccioline con distribuzioni di dimensioni ridotte può probabilmente generare soglie di vaporizzazione più uniformi. Ciò massimizzerà il loro potenziale per numerose applicazioni come l'imaging, l'ablazione, la somministrazione di farmaci e l'embolizzazione1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Figura 1: Schema di configurazione dell'estrusione ad alta pressione per condensare microbolle preformate in nanogoccioline a sfasamento. La soluzione di microbolle viene aggiunta e contenuta nella camera dell'estrusore e 250 psi, dal serbatoio dell'azoto, vengono applicati attraverso la valvola di ingresso della camera. Il gas azoto spingerà la soluzione di microbolle attraverso il filtro alla base della camera, condensando il campione in nanogoccioline. La soluzione viene infine spinta fuori dall'estrusore attraverso il tubo di uscita del campione e raccolta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Esistono molti metodi che possono essere utilizzati per la produzione di goccioline a sfasamento vaporizzabili per l'imaging e la terapia. Ogni metodo utilizza tecniche diverse e varia nel prezzo, nei materiali e nello scopo. Molti di questi metodi di fabbricazione si traducono in popolazioni polidisperse con soglie di attivazione non uniformi. Inoltre, il controllo delle dimensioni delle goccioline richiede in genere liquidi perfluorocarburi stabili con soglie di attivazione elevate che non sono pratiche in vivo. Produrre goccioline di dimensioni uniformi utilizzando gas a basso punto di ebollizione sarebbe utile per gli esperimenti di imaging e terapia in vivo. Questo articolo descrive un metodo semplice ed economico per la formazione di nanogoccioline a sfasamento stabilizzate con lipidi filtrati con defluorobutano a basso punto di ebollizione (DFB). Viene descritto un metodo comune per generare microbolle lipidiche, oltre a un nuovo metodo per condensarle con estrusione ad alta pressione in un unico passaggio. Questo metodo è progettato per risparmiare tempo, massimizzare l'efficienza e generare volumi maggiori di soluzioni di microbolle e nanogoccioline per un'ampia varietà di applicazioni utilizzando apparecchiature di laboratorio comuni presenti in molti laboratori biologici.

I risultati rappresentativi della distribuzione dimensionale sono inclusi utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) e l'analisi TRSP (Tunable Resistive Pulse Sensing). La Figura 5 mostra la distribuzione dimensionale delle soluzioni a bolle condensate con e senza estrusione. Senza estrusione, il protocollo termina al passaggio 5.3. Le bolle refrigerate vengono condensate sfogando il campione alla pressione atmosferica mentre è freddo. Il campione condensato ha una distribuzione mo...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Questo protocollo descrive un metodo per generare grandi volumi di microbolle di decafluorobutano incapsulate lipidiche utilizzando la sonicazione a punta di sonda e successivamente condensarle in nanogoccioline a sfasamento utilizzando l'estrusione ad alta pressione e la filtrazione meccanica.

Produzione di nanogoccia di decafluorobutano a spostamento di fase filtrate a membrana da microbolle preformate

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Questo protocollo è un metodo semplice per ridurre la polidispersità di goccioline vaporizzabili a basso punto di ebollizione per l'uso in applicazioni biomediche. Questa tecnica condensa microbolle di gas preformate e filtra le goccioline liquide risultanti per dimensione in modo controllabile, scalabile e relativamente conveniente. Questo metodo può essere applicato a una varietà di microbolle lipidiche con diverso guscio e materiale gassoso utilizzando diversi filtri per controllare la dimensione finale delle goccioline.A dimostrare la procedura sarà Darrah Merillat, ricercatrice universitaria del laboratorio del Dr.Sirsi. Accendere l'interruttore di alimentazione per il sonicatore e impostare l'ampiezza sul massimo consentito utilizzando l'attacco microtip e garantire che il tempo di sonicazione sia impostato su 10 secondi. Posizionare la soluzione lipidica idratata calda nell'involucro sonoro con il microtip appena sotto la superficie.Fissare una lunghezza appropriata del tubo al collo del flaconcino per guidare il gas dall'uscita del serbatoio DFB alla soluzione lipidica calda contenuta nell'involucro. Aprire lentamente la valvola del serbatoio fino a quando il gas può essere visto scorrere sopra la soluzione lipidica, causando lievi increspature sulla superficie del liquido. Se il flusso di gas è troppo alto, la soluzione traboccherà durante la formazione di microbolle.Avviare il sonicatore ed eseguirlo per 10 secondi ininterrottamente per generare microbolle. Al termine della sonicazione, chiudere immediatamente la valvola del serbatoio DFB. Chiudere rapidamente la soluzione di microbolle e immergere il flaconcino in un bagno di ghiaccio per raffreddare il campione al di sotto dei 55 gradi Celsius.Utilizzare un filtro ceramico a 200 nanometri per assemblare l'estrusore ad alta pressione secondo il manuale dell'utente e posizionarlo al centro di un contenitore a tenuta stagna, in modo che il tubo di uscita del campione non venga premuto contro il lato o crimpato. Accoppiare l'estrusore al serbatoio del gas azoto utilizzando l'adattatore fornito dal produttore. Posizionare l'estremità del tubo di uscita in un flaconcino a scintillazione per raccogliere il campione estruso, fissando il tubo al contenitore con del nastro adesivo per rimanere all'interno del flaconcino.Aprire e chiudere la valvola di rilascio per assicurarsi che non vi sia alcuna pressione all'interno dell'estrusore. Rimuovere il coperchio della camera. E aggiungi cinque millilitri di PBS alla camera dell'estrusore.Sostituisci il coperchio, assicurandoti che torni saldamente in posizione. Aprire il serbatoio del gas azoto, in modo che il manometro legga 250 PSI, assicurandosi che la valvola di controllo della pressione sia in posizione chiusa. Chiudere il serbatoio del gas e aprire la valvola di ingresso della camera dell'estrusore, facendo sì che la soluzione PBS venga spinta attraverso il sistema e fuoriesca il tubo di uscita del campione nel flaconcino di scintillazione.Quando solo il gas esce dal tubo, aprire la valvola di rilascio e lasciare che la pressione scenda a zero PSI. Quindi rimuovere il flaconcino di scintillazione. Aprire e chiudere la valvola di rilascio per assicurarsi che non vi sia alcuna pressione all'interno dell'estrusore e posizionare un nuovo flaconcino di scintillazione all'estremità del tubo di uscita.Riempire un contenitore di acciaio con 2-metilbutano e aggiungere ghiaccio secco per portare la temperatura a meno 18 gradi Celsius. Inserire la soluzione di microbolle nel 2-metilbutano refrigerato, immergendo il campione per due minuti. Spostare il flaconcino di scintillazione per tutti i due minuti per mescolare delicatamente le bolle.Aggiungere ghiaccio secco secondo necessità per mantenere la temperatura tra meno 15 e meno 18 gradi Celsius. Dopo due minuti, rimuovere le microbolle dal 2-metilbutano refrigerato. Ruotare delicatamente il flaconcino per mescolare le microbolle e trasferire le bolle in una siringa refrigerata da 10 millilitri.Rimuovere il coperchio della camera dell'estrusore e aggiungere la soluzione di microbolle alla camera spingendo lentamente lo stantuffo sulla siringa. Sostituire il cappuccio dell'estrusore, assicurandosi che faccia clic in modo sicuro in posizione. Verificare che la valvola di controllo della pressione e la valvola di rilascio dell'estrusore siano in posizione chiusa.Aprire il serbatoio del gas azoto fino a quando il manometro legge 250 PSI. Chiudere il serbatoio del gas e ruotare la valvola di controllo della pressione in posizione aperta. Quando la soluzione ha riempito il flaconcino di scintillazione nel tubo di uscita e solo il gas esce dal tubo, aprire lentamente la valvola di rilascio della pressione e lasciare che la pressione scenda a zero PSI.Trasferire 10 millilitri della soluzione di goccioline estruse in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Centrifugare il campione estruso a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e le goccioline vaporizzate spontaneamente che appaiono nella parte superiore della soluzione.Sospendere nuovamente il pellet composto da nanogoccioline DFP in 10 millilitri di PBS con il 20% di glicerolo e il 20% di glicole propilenico. La distribuzione dimensionale delle soluzioni a bolle condensate con e senza estrusione mostra che il campione condensato solo ha una distribuzione molto più ampia centrata vicino a 400 nanometri, mentre il campione estruso ha una distribuzione più stretta centrata a 200 nanometri. L'analisi di rilevamento degli impulsi di resistenza sintonizzabile utilizzata per analizzare le goccioline a sfasamento mentre sono state lavate mediante centrifugazione per rimuovere i liposomi in eccesso mostra che le dimensioni delle goccioline sono vicine a 200 nanometri.I dati al microscopio della vaporizzazione delle nanogoccioline quando riscaldate mostrano che alcune microbolle vaporizzate spontaneamente sono evidenti nel campo visivo prima del riscaldamento e un numero maggiore di microbolle di gas si osservano dopo il riscaldamento. Le immagini al microscopio di nanogoccioline inserite nell'estrusore direttamente senza pre-raffreddamento, condensate a zero gradi Celsius e a meno 18 gradi Celsius sono mostrate qui. Immagini rappresentative di goccioline di ottafluoropropano condensato prima e dopo la vaporizzazione mostrano anche un numero maggiore di microbolle di gas dopo il riscaldamento, simili alle goccioline DFB.La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che la resa delle gocce dipende fortemente dalla temperatura e dalla pressione durante la condensazione e lievi variazioni influenzeranno i risultati. Dopo aver generato goccioline vaporizzabili, possono essere utilizzate per ottimizzare l'imaging in vivo e la somministrazione di farmaci utilizzando gli ultrasuoni, nonché altre applicazioni in vivo ed ex vivo. Dopo aver sviluppato questa tecnica, gli effetti della dimensione delle nanogoccioline e del contenuto del nucleo di gas sulle soglie di vaporizzazione in vivo sono stati esplorati utilizzando lievi modifiche a questo protocollo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produzione e Targeting di monovalente Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Ricerca

Bioingegneria

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produzione di sostanze chimiche da parte di<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Uso di idrolizzato di bambù come alimentazione

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Produzione microfluidica di liposomi sensibili alla temperatura contengono lysolipid

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

Microbolle magnetiche, acustiche e ottiche a tripla risposta per ipertermia magnetica e terapia del cancro combinata pototermica

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Imaging e quantificazione dell'area delle microbolle in rapido movimento utilizzando una fotocamera ad alta velocità e l'analisi delle immagini

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Un metodo efficiente per la produzione di adenovirus

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Metodi di microscopia multi-timescale per la caratterizzazione di microbolle marcate fluorescenti per il rilascio di farmaci attivati da ultrasuoni

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...