Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
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気化可能な位相シフトナノドロップレットのTRSP分析を提供してくれたケン・ホイト博士の研究室のドミニク・ジェームズに感謝したいと思います。

1. 脂質フィルムの作成
<ol><li>以下の方向を使用して正しい比率で脂質を混合することにより、90%DSPCおよび10%DSPE-PEG2Kを使用してマイクロバブル生成用の脂質膜を調製する:<ol>
<li>クロロホルムでDSPCとDSPE-PEG2Kのストック脂質を作ります.各脂質粉末の50mgを別々のバイアルで秤量する。1 mL ガラスシリンジを使用して、各バイアルにクロロホルム 1 mL を加えます。</li>
		<li>ガラスシリンジを使用?...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

インビボイメージングと治療のためのマイクロバブルと位相シフト液滴の処方、物理学、および潜在的な用途を議論する包括的な文献体が利用可能です。この議論は、脂質マイクロバブルを生成し、低沸点DFBガスと高圧押出を使用してサブミクロン位相シフト液滴に変換することに明示的に関連しています。ここで概説する方法は、従来のマイクロバブル凝縮法と液滴押出法を一回のステッ?...

超音波造影剤(UCA)は、画像および治療用途で急速に人気が高まっています。マイクロバブルは、元のUCAであり、現在臨床診断アプリケーションで使用される主流の薬剤です。マイクロバブルは、ガスで満たされた球体で、通常は直径1~10μmで、脂質、タンパク質、ポリマーシェル1で囲まれています。ただし、そのサイズと生体内での安定性は、多くのアプリケーションで機能を制限することができます。過熱した液体コアを含む位相シフトナノドロップレットは、サイズが小さく、循環寿命が改善されたため、これらの制限のいくつかを克服することができます。熱または音響エネルギーにさらされると、過熱した液体コアが気化して気体マイクロバブル2,3,4,5を形成します。気化閾値は液滴サイズ5,6に直接関係するため、一貫した活性化閾値を達成するために、一様なサイズの液滴懸濁液を処方することが非常に望ましいであろう。均一な液滴サイズを生成する配合方法は、しばしば複雑でコストがかかり、より費用対効果の高いアプローチは多分散溶液7をもたらす。もう一つの制限は、低沸点パーフルオロカーボン(PFC)ガスで安定な位相シフト液滴を生成する能力であり、これはvivo8での効率的な活性化に不可欠です。本稿では、生体内イメージングおよび治療用途のための安定したろ過低沸点気化可能な位相シフト液滴を生成するためのプロトコルが記載されている。
単分散サブミクロン位相シフト液滴7を製造する方法は多い。サイズを制御する最も堅牢な方法の1つは、マイクロ流体デバイスの使用です。これらのデバイスは、コストがかかり、液滴の生産速度が遅く(〜104-106液滴/s)7であり、広範なトレーニングが必要です。マイクロ流体デバイスは、一般に、システム7の自発的な気化や目詰まりを避けるために、高沸点ガスを必要とします。しかし、de Gracia Luxら.9の最近の研究では、マイクロフルダイザーを冷却して、低沸点デカフルオロブタン(DFB)またはオクターフルオロプロパン(OFP)を使用して高濃度のサブミクロン位相シフト(1010-1012/mL)を生成する方法を示しています。
一般に、DFBやOFPなどの低沸点ガスは、あらかじめ形成された気泡を使用して扱いやすくなっています。気化可能な液滴は、低温および上昇圧5,10を用いてガスを凝縮することにより、前駆体脂質安定化気泡から生成することができる。この方法を用いて生成される液滴の濃度は、前駆体マイクロバブル濃度と気泡から液滴への変換の効率に依存する。濃縮されたマイクロバブルは、1010 MB/mL11>近づく先端超音波処理から報告されているが、別の研究では、凝縮されたOFPおよびDFP気泡12から〜1〜3 x1011液滴/mLに及ぶ液滴濃度が報告されている。単分散液滴が懸念されない場合、凝縮方法は、低沸点PFCを使用して脂質安定化位相シフト液滴を生成する最も簡単で最も低コストの方法です。しかし、単分散前駆体気泡の発生も困難であり、マイクロ流体や繰り返し微分遠心分離技術などのより高価なアプローチを必要とする11。DFBおよびOFBナノ液滴を産生するための別のアプローチは、最近、リポソーム13における液滴の自発的核形成を用いて発表された。この方法は、「Ouzo」効果を利用して、気泡を凝縮することなく低沸点PFC液滴を生成する簡単な方法である。PFC液滴のサイズ分布は、液滴の核形成を開始するために使用されるPFC、脂質、およびエタノール成分を繊細な滴定および混合することによって制御することができる。また、パーフルオロカーボンの混合は、ナノ液滴14,15の安定性および活性化閾値を制御するために使用できることも注目に値する。Shakyaらの最近の研究は、炭化水素内の高沸点PFCsを炭化水素内の高沸点PfFCを乳化して、液滴コア16内の異種核形成を容易にすることによってナノドロップレット活性化を調整する方法を示している。
いったん形成されると、位相シフト液滴を形成後に押し出して、より多くの単分散集団を作り出すことができる。実際、ここで説明する方法と同様のプロトコルは、高沸点ドデデオフルオルペンタン(DDFP)を液滴コアとして使用してKopechekら17 によって以前に公開されている。高沸点パーフルオロカーボン(室温で安定)を有する位相シフト液滴を使用しようとする読者は、代わりに上記の記事を参照する必要があります。DFBやOFPなどの低沸点ガスを含む液滴の発生と押出は、より複雑であり、あらかじめ形成された気泡を凝縮させることで最もアプローチが可能です。
このプロトコルでは、プローブ先端超音波処理を用いてDFBガスコアを用いて事前に形成された脂質微小気泡を生成する一般的な方法が記載されている。次に、市販の押出機を使用して、プレフォームされたマイクロバブルをサブミクロン位相シフトナノ液滴に凝縮します(図1)。得られた液滴は、熱と超音波によって活性化可能である。この方法は、高価なマイクロ流体デバイスを必要とせずに、より狭いサイズ分布を有する従来の凝縮法よりも大量のナノ液滴溶液を生成することができる。狭いサイズ分布を持つナノドロップレット溶液の製造は、より均一な気化閾値を生成する可能性が高い。これは、画像処理、アブレーション、薬物送達、塞栓術1、3、4、6などの多数のアプリケーションの可能性を最大限に引き出します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> 図1:予知されたマイクロバブルを位相シフトナノ液滴に凝縮するための高圧押出セットアップの概略図。 マイクロバブル溶液は押出機室に添加され、収容され、250psiは、窒素タンクから、チャンバー入口弁を通して適用される。窒素ガスは、マイクロバブル溶液をチャンバの基部のフィルターを通して押し出し、サンプルをナノ液滴に凝縮させる。溶液は最終的にサンプル出口管を通して押出機から押し出され、収集される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

画像処理および治療のための気化可能な位相シフト液滴の製造に使用できる多くの方法があります。各方法は、さまざまな技術を利用し、価格、材料、目的が異なります。これらの製造方法の多くは、不均一な活性化閾値を有する多分散集団をもたらす。さらに、液滴サイズを制御するには、通常、生体内で実用的ではない高い活性化閾値を有する安定したパーフルオロカーボン液体が必要です。低沸点ガスを用いて均一な液滴サイズを作製することは、インビボイメージングおよび治療実験に有益であろう。本稿では、低沸点デカフルオロブタン(DFB)を用いたサイズフィルター脂質安定化位相シフトナノ液滴の形成のための、簡便で経済的な方法について述べている。脂質マイクロバブルを生成する一般的な方法は、一回のステップで高圧押出でそれらを凝縮する新しい方法に加えて、記載されている。この方法は、多くの生物学的実験室で見られる一般的な実験装置を使用して、時間を節約し、効率を最大化し、マイクロバブルおよびナノドロップレットソリューションの大量を生成するように設計されています。

サイズ分布の代表的な結果は、動的光散乱(DLS)および調整可能な抵抗パルスセンシング(TRSP)分析を用いて含まれる。図5は、押出しの有無にかかわらず、凝縮された気泡溶液のサイズ分布を示しています。押し出しがない場合、プロトコルはステップ 5.3 で終了します。冷たい気泡は、冷たい間に大気圧にサンプルを通すことによって凝縮される。凝縮されたサンプルだ?...

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Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

このプロトコルは、プローブチップ超音波処理を使用して大量の脂質カプセル化デカフルオロブタンマイクロバブルを生成し、その後、高圧押出および機械的濾過を使用してフェーズシフトナノ液滴に凝縮する方法を記述する。

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

このプロトコルは、生物医学の用途で使用するための低沸点気化可能な液滴の多分散性を低減する容易な方法である。この技術は、事前に形成された気体マイクロバブルを凝縮し、制御可能でスケーラブルで比較的費用対効果の高い方法で、得られた液体液滴をサイズ別にフィルタリングします。この方法は、異なるフィルターを使用して異なるシェルおよびガス材料を持つ様々な脂質マイクロバブルに適用して、最終的な液滴サイズを制御することができます。この手順を実証することは、Dr.Sirsiの研究室の学部研究者であるダラ・メリラットです。超音波装置の電源スイッチをオンにし、マイクロチップアタッチメントを使用して最大許容に振幅を設定し、超音波処理時間を10秒に設定します。温和化した脂質溶液を、表面のすぐ下にマイクロチップを付けたサウンドエンクロージャに入れます。DFBタンク出口からエンクロージャに保持されている暖かい脂質溶液にガスを導くために、バイアルの首にチューブの適切な長さを取り付けます。液体の表面にわずかな波紋を引き起こし、ガスが脂質溶液の上を流れるのが見えるまで、タンクバルブをゆっくりと開きます。ガスの流れが高すぎると、マイクロバブル形成時に溶液が溢れます。超音波処理器を起動し、マイクロバブルを生成するために連続して10秒間実行します。超音波処理が終わったら、すぐにDFBタンクバルブを閉じます。マイクロバブル溶液を素早くキャップし、バイアルを氷浴に沈め、サンプルを摂氏55度以下に冷却します。200ナノメートルのセラミックフィルターを使用して、ユーザーズマニュアルに従って高圧押出機を組み立て、水密容器の中央に置き、サンプル出口管が側面に押し付けられたり、圧着したりしないようにします。メーカーから供給されたアダプターを使用して、押出機を窒素ガスタンクに結合します。出口管の端部をシンチレーションバイアルに入れて押出されたサンプルを集め、チューブをテープで容器に固定してバイアル内に留まる。押出機内に圧力がないことを確認するために、リリースバルブを開閉します。チャンバーの蓋を取り外します。そして、押出機室にPBSの5ミリリットルを追加します。蓋を取り替え、しっかりとクリックして元の場所に戻します。窒素ガスタンクを開き、圧力計が250 PSIを読み取るようにして、圧力制御弁が閉じた位置に位置していることを確認します。ガスタンクを閉じ、押出機室の入口バルブを開き、PBS溶液をシステムに押し込み、サンプル出口チューブをシンチレーションバイアルに出します。ガスだけがチューブから出るとき、解放弁を開き、圧力がゼロPSIに落ちるようにしなさい。その後、シンチレーションバイアルを除去します。リリースバルブを開閉して押出機内に圧力がないことを確認し、出口管の端に新しいシンチレーションバイアルを配置します。鋼容器に2-メチルブタンを充填し、ドライアイスを加え、温度をマイナス18度まで下げます。冷却された2-メチルブタンにマイクロバブル溶液を挿入し、サンプルを2分間水没させます。2分間にわたってシンチレーションバイアルを動かして、気泡を軽く混ぜます。必要に応じてドライアイスを加え、マイナス15度からマイナス18度の温度を維持します。2分後、冷やした2-メチルブタンからマイクロバブルを取り出します。バイアルをそっと渦巻いてマイクロバブルを混ぜ、冷やした10ミリリットルのシリンジに泡を移します。押出機室の蓋を取り外し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押してマイクロバブル溶液をチャンバーに加えます。押出機のキャップを交換し、しっかりとクリックします。押出機の圧力制御弁と解放弁が閉じた位置にあるか確認します。圧力計が250 PSIを読み取るまで窒素ガスタンクを開きます。ガスタンクを閉じ、圧力制御バルブを開いた位置に回します。溶液が出口管でシンチレーションバイアルを満たし、ガスだけがチューブを出るとき、圧力解放弁をゆっくりと開き、圧力がゼロPSIに落ちるようにする。押し出された液滴溶液の10ミリリットルを15ミリリットルの遠心分離管に移す。押し出されたサンプルを摂氏4度で10分間1,500倍Gで遠心する。溶液の上部に現れる上清と自然気化した液滴を捨てます。DFPナノドロップレットを含むペレットを20%グリセロールと20%プロピレングリコールを用いたPBSの10ミリリットルで再懸濁する。押出しの有無にかかわらず凝縮された気泡溶液のサイズ分布は、凝縮されたサンプルが400ナノメートル付近を中心としたはるかに広い分布を有するのに対し、押し出されたサンプルは200ナノメートルを中心としたより狭い分布を有することを示している。過剰なリポソームを除去するために遠心分離によって洗浄された位相シフト液滴を分析するために使用される調整可能な抵抗パルスセンシング分析は、液滴サイズが200ナノメートル近くであることを示しています。加熱するとナノドロップレット気化の顕微鏡データは、加熱前の視野で自然に気化した微小気泡が見え、加熱後に多くの気体マイクロバブルが観測されることを示しています。事前冷却せずに押出機に直接挿入されたナノ液滴の顕微鏡画像を、摂氏ゼロ度で、マイナス18°Cで凝縮して示しています。気化前後の凝縮されたオクタフルオロプロパン液滴の代表的な画像は、DFB液滴と同様に、加熱後のガスマイクロバブルの数も多いことを示しています。この手順で覚えておくべきことは、液滴の収率が結露時の温度と圧力に大きく依存し、わずかな変動が結果に影響を与えるということです。気化可能な液滴を生成した後、それらは超音波だけでなく、他のin vivoおよびex vivoアプリケーションを使用して生体内イメージングおよび薬物送達を最適化するために使用することができる。この技術を開発した後、ナノドロップレットサイズとガスコア含有量が生体内気化閾値に及ぼす影響は、このプロトコルにわずかな変更を用いて検討されてきた。

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A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

いけにえの中空糸膜細胞培養による細胞外マトリックス繊維の生産

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

磁気温熱療法とポト温熱併用がん治療のための磁気、音響、光三重応答性マイクロバブル

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

高速カメラによる高速マイクロバブルのイメージングと定量化

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

アデノウイルス産生のための効率的な方法

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...