Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Vi vil takke Dominique James i Dr. Ken Hoyts laboratorium for å gi TRSP-analyse av fordampende faseskift nanodråper

1. Lage lipidfilmer
<ol><li>Forbered lipidfilmer for mikroboblegenerering ved hjelp av 90% DSPC og 10% DSPE-PEG2K ved å blande lipidene i riktig forhold ved hjelp av følgende retninger:<ol>
<li>Lag lager lipider av DSPC og DSPE-PEG2K i kloroform. Vei 50 mg av hvert lipidpulver i separate hetteglass. Tilsett 1 ml kloroform til hvert hetteglass med en 1 ml glasssprøyte.</li>
		<li>Tilsett 287 μL DSPC-lager og 113 μL DSPE-PEG2K-lager (begge 50 mg/ml) i et 20 ml scintillasjonsflaske ved hjelp av en glasssprøyte.</li>...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

En omfattende litteratur er tilgjengelig som diskuterer formulering, fysikk og potensielle anvendelser av mikrobobler og faseskiftdråper for in vivo-avbildning og terapi. Denne diskusjonen gjelder eksplisitt å generere lipidmikrobobler og konvertere dem til submikronfase-skiftdråper ved hjelp av et lavt kokepunkt DFB gass og høytrykksekstrudering. Metoden som er skissert her er ment å gi en relativt enkel metode for å produsere store mengder lipidmikrobobler og DFB faseskiftdråper ved å kombinere tidligere mikrob...

Ultralydkontrastmidler (UCAer) vokser raskt i popularitet for avbildnings- og terapiapplikasjoner. Mikrobobler, de opprinnelige UCAene, er for tiden de vanlige agentene som brukes i kliniske diagnostiske applikasjoner. Mikrobobler er gassfylte sfærer, vanligvis 1-10 μm i diameter, omgitt av lipid-, protein- eller polymerskall1. Imidlertid kan deres størrelse og in vivo-stabilitet begrense funksjonaliteten i mange applikasjoner. Faseskift nanodråper, som inneholder en overopphetet væskekjerne, kan overvinne noen av disse begrensningene på grunn av deres mindre størrelse og forbedret sirkulasjonslevetid2. Når den utsettes for varme eller akustisk energi, fordampes den overopphetde væskekjernen for å danne en gassmikrobubble2,3,4,5. Siden fordampningsterskelen er direkte relatert til dråpestørrelse5,6, vil det være svært ønskelig å formulere dråpesuspensjoner med jevn størrelse for å oppnå konsistente aktiveringsterskler. Formuleringsmetoder som produserer ensartede dråpestørrelser er ofte komplekse og kostbare, mens mer kostnadseffektive tilnærminger resulterer i polydisperse løsninger7. En annen begrensning er evnen til å generere stabile faseskiftdråper med lavkokende perfluorkarbongasser (PFC), noe som er avgjørende for effektiv aktivering i vivo8. I dette manuskriptet er det beskrevet en protokoll for å generere stabile filtrerte lavkokende punkter som fordamper faseskiftdråper for in vivo-avbildning og terapiapplikasjoner.
Det er mange metoder for å produsere monodispersed submikron fase-skift dråper7. En av de mest robuste metodene for å kontrollere størrelsen er bruk av mikrofluidiske enheter. Disse enhetene kan være kostbare, ha langsomme priser på dråpeproduksjon (~ 104-106 dråper / s) 7, og krever omfattende opplæring. Mikrofluidiske enheter krever også generelt høykokende punktgasser for å unngå spontan fordampning og tilstopping av systemet7. En nylig studie av de Gracia Lux et al.9 viser imidlertid hvordan kjøling av en mikrofluidisator kan brukes til å generere høye konsentrasjoner av submikronfaseskift (1010-1012/ml) ved hjelp av lavkokende punkt decafluorobutane (DFB) eller octafluoropropane (OFP).
Generelt er lavkokende punktgasser som DFB eller OFP lettere å håndtere ved hjelp av forhåndsformede gassbobler. Vaporizable dråper kan produseres fra forløper lipidstabiliserte bobler ved å kondensere gassen ved hjelp av lave temperaturer og forhøyet trykk5,10. Konsentrasjonen av dråper produsert ved hjelp av denne metoden avhenger av forløper mikrobubble konsentrasjon og effektivitet av konvertering av bobler til dråper. Konsentrerte mikrobobler er rapportert fra spiss sonikering nærmer seg > 1010 MB / ml11, mens en egen studie har rapportert dråpekonsentrasjoner fra ~ 1-3 x1011 dråper / ml fra kondensert OFP og DFP bobler12. Når monodisperserte dråper ikke er en bekymring, er kondensmetoder de mest enkle og rimeligste metodene for å generere lipidstabiliserte faseskiftdråper ved hjelp av lavkokende punkt PFCer. Metoder for å generere bobler i jevn størrelse før kondens kan bidra til å skape mer monodisperse populasjoner av dråper. Det er imidlertid også vanskelig å generere monodisperse forløperbobler, noe som krever dyrere tilnærminger som mikrofluidikk eller gjentatte differensialsentrifugeringsteknikker11. En alternativ tilnærming til produksjon av DFB og OFB nanodråper har nylig blitt publisert ved hjelp av spontan kjernedannelse av dråper i liposomer13. Denne metoden, ved hjelp av en "Ouzo" -effekt, er en enkel måte å generere lavkokende PFC-dråper uten å måtte kondensere bobler. Størrelsesfordelingen av PFC-dråpene kan styres av delikat titrering og blanding av PFC-, lipid- og etanolkomponenter som brukes til å starte kjernedannelse av dråpene. Det er også verdt å merke seg at blanding av perfluorkarboner kan brukes til å kontrollere stabilitets- og aktiveringsterskler av nanodråper14,15. Nyere arbeid av Shakya et al. demonstrerer hvordan nanodropletaktivering kan stilles inn ved å emulgere høykokende PFCer i et hydrokarbon endoskeleton for å lette heterogen kjernedannelse i dråpekjernen16, som er en tilnærming som kan vurderes sammen med andre former for dråpestørrelsesfiltrering.
Når de er dannet, kan faseskiftdråper ekstruderes etter dannelse for å skape flere monodispersiske populasjoner. Faktisk har en lignende protokoll til metoden beskrevet her blitt publisert tidligere av Kopechek et al.17 ved hjelp av høy kokepunkt dodecofluorpentane (DDFP) som dråpekjerne. Lesere som ønsker å bruke faseskiftdråper med høykokende punktperfluorkarboner (stabile ved romtemperatur) bør referere artikkelen ovenfor i stedet. Generering og ekstrudering av dråper med lave kokepunktgasser, som DFB og OFP, er mer komplisert og nærmer seg best ved å kondensere preformerte gassbobler.
I denne protokollen beskrives en vanlig metode for å generere forhåndsformede lipidmikrobobler med en DFB-gasskjerne ved hjelp av sondespiss sonikering. Deretter brukes en kommersiell ekstruder til å kondensere forhåndsformede mikrobobler til submikronfase-skift nanodråper (figur 1). De resulterende dråpene er da aktivatable av varme og ultralyd. Denne metoden kan produsere større mengder nanodropletløsning enn konvensjonelle kondensmetoder med smalere størrelsesfordelinger uten behov for dyre mikrofluidiske enheter. Produksjon av nanodropletløsninger med smale størrelsesfordelinger kan sannsynligvis generere mer ensartede fordampningsterskler. Dette vil maksimere potensialet for mange applikasjoner som avbildning, ablasjon, legemiddellevering og embolisering1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk for ekstruderingsoppsett med høyt trykk for kondensering av forhåndsformede mikrobobler i nanodråper med faseskift. Mikrobubble-løsningen legges til og finnes i ekstruderkammeret, og 250 psi, fra nitrogentanken, påføres gjennom kammerinntaksventilen. Nitrogengassen vil skyve mikrobubble-løsningen gjennom filteret ved bunnen av kammeret, og kondensere prøven til nanodråper. Løsningen skyves til slutt ut av ekstruderen gjennom prøveuttaksrøret og samles inn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Det er mange metoder som kan brukes til produksjon av fordampende faseskiftdråper for avbildning og terapi. Hver metode bruker forskjellige teknikker og varierer i pris, materialer og formål. Mange av disse fabrikasjonsmetodene resulterer i polydisperse populasjoner med ikke-ensartede aktiveringsterskler. I tillegg krever kontroll av dråpestørrelsene vanligvis stabile perfluorkarbonvæsker med høye aktiveringsterskler som ikke er praktiske in vivo. Å produsere ensartede dråpestørrelser ved hjelp av lavkokende punktgasser vil være gunstig for in vivo-avbildnings- og terapieksperimenter. Denne artikkelen beskriver en enkel og økonomisk metode for dannelsen av størrelsesfiltrerte lipidstabiliserte faseskift nanodråper med lavkokende punkt decafluorobutane (DFB). En vanlig metode for å generere lipidmikrobobler er beskrevet, i tillegg til en ny metode for å kondensere dem med høytrykksekstrudering i et enkelt trinn. Denne metoden er utformet for å spare tid, maksimere effektiviteten og generere større mengder mikrobubble- og nanodropletløsninger for et bredt spekter av applikasjoner ved hjelp av vanlig laboratorieutstyr som finnes i mange biologiske laboratorier.

Representative resultater av størrelsesfordelingen er inkludert ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) og justerbar resistiv pulssensoranalyse (TRSP). Figur 5 viser størrelsesfordelingen av kondenserte bobleløsninger med og uten ekstrudering. Uten ekstrudering avsluttes protokollen i trinn 5.3. De avkjølte boblene kondenseres ved å ventilere prøven til atmosfærisk trykk mens de er kalde. Den kondenserte eneste prøven har en mye bredere fordeling sentrert nær 400 nm. Den ekstrudert...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Denne protokollen beskriver en metode for å generere store mengder lipid innkapslede decafluorobutane mikrobubbles ved hjelp av sondespiss sonikering og deretter kondensere dem til fase-skift nanodroplets ved hjelp av høytrykk ekstrudering og mekanisk filtrering.

Produksjon av membranfiltrert faseforskyvning Decafluorobutane Nanodroplets fra preformede mikrobobler

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Denne protokollen er en enkel metode for å redusere polydispersitet av lave kokepunkt fordampende dråper for bruk i biomedisinske applikasjoner. Denne teknikken kondenserer forhåndsformede gassmikrobobler og filtrerer de resulterende væskedråpene etter størrelse på en måte som er kontrollerbar, skalerbar og relativt kostnadseffektiv. Denne metoden kan brukes på en rekke lipidmikrobobler med forskjellig skall- og gassmateriale ved hjelp av forskjellige filtre for å kontrollere endelig dråpestørrelse.Å demonstrere prosedyren vil være Darrah Merillat, en bachelorforsker fra Dr.Sirsis laboratorium. Slå på strømbryteren for lydskriveren, og sett amplituden til maksimalt tillatt bruk av mikrotip-tilbehøret, og sørg for sonikeringstid satt til 10 sekunder. Plasser den varme hydrerte lipidløsningen i lydkabinettet med mikrotipset like under overflaten.Fest en passende lengde på slangen til halsen på hetteglasset for å lede gassen fra DFB-tankutløpet inn i den varme lipidløsningen som holdes i kabinettet. Åpne tankventilen sakte til gassen kan ses strømme over lipidoppløsningen, noe som forårsaker små krusninger på overflaten av væsken. Hvis gassstrømmen er for høy, vil løsningen overløpe under mikrobobledannelse.Start sonikeren, og kjør den i 10 sekunder kontinuerlig for å generere mikrobobler. Etter at sonikeringen er over, lukker du umiddelbart DFB-tankventilen. Kapp raskt mikrobubble-løsningen, og senk hetteglasset i et isbad for å avkjøle prøven under 55 grader Celsius.Bruk et keramisk filter på 200 nanometer til å montere høytrykksekstruderen i henhold til brukerhåndboken, og plasser den i midten av en vanntett beholder, slik at prøveuttaksrøret ikke presses mot siden eller krympes. Koble ekstruderen til nitrogengasstanken ved hjelp av adapteren som leveres av produsenten. Plasser enden av utløpsrøret i et scintillation hetteglass for å samle den ekstruderte prøven, og fest røret til beholderen med tape for å holde seg innenfor hetteglasset.Åpne og lukk utløserventilen for å sikre at det ikke er noe trykk i ekstruderen. Fjern kammerlokket. Og legg til fem milliliter PBS til ekstruderkammeret.Sett på lokket igjen, og pass på at det klikker godt på plass igjen. Åpne nitrogengasstanken, slik at trykkmåleren leser 250 PSI, og sørg for at trykkreguleringsventilen er i lukket posisjon. Lukk gasstanken, og åpne ekstruderkammerets innløpsventil, slik at PBS-løsningen skyves gjennom systemet og ut av prøveutløpsrøret inn i hetteglasset med scintillasjon.Når bare gass går ut av slangen, åpner du utløserventilen og lar trykket falle til null PSI. Fjern deretter hetteglasset med scintillasjon. Åpne og lukk utløserventilen for å sikre at det ikke er noe trykk i ekstruderen, og plasser et nytt scintillation hetteglass på enden av utløpsrøret.Fyll en stålbeholder med 2-metylbutane, og tilsett tørris for å bringe temperaturen ned til minus 18 grader Celsius. Sett mikrobubble-løsningen inn i den avkjølte 2-metylbutane, senk prøven i to minutter. Beveg hetteglasset med scintillasjon gjennom de to minuttene for å blande boblene forsiktig.Tilsett tørris etter behov for å opprettholde temperaturen mellom minus 15 og minus 18 grader Celsius. Etter to minutter, fjern mikroboblene fra den avkjølte 2-metylbutane. Virvle hetteglasset forsiktig for å blande mikroboblene, og overfør bobler til en kjølt 10 milliliter sprøyte.Fjern ekstruderkammerlokket, og tilsett mikrobubble-løsningen i kammeret ved å skyve stempelet langsomt på sprøyten. Sett på plass ekstruderhetten, og pass på at den klikker godt på plass. Kontroller at trykkreguleringsventilen og ekstruderens utløserventil er i lukket stilling.Åpne nitrogengasstanken til trykkmåleren viser 250 PSI. Lukk gasstanken, og vri trykkreguleringsventilen til åpen stilling. Når oppløsningen har fylt hetteglasset ved utgangsslangen og bare gass går ut av røret, åpner du trykkavlastningsventilen langsomt og lar trykket falle til null PSI.Overfør 10 milliliter av den ekstruderte dråpeløsningen til et sentrifugerør på 15 milliliter. Sentrifuger den ekstruderte prøven ved 1500 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten og de spontant fordampede dråpene som vises på toppen av løsningen.Re-suspendere pellet bestående av DFP nanodråper i 10 milliliter PBS med 20% glyserol og 20% propylenglykol. Størrelsesfordelingen av kondenserte bobleløsninger med og uten ekstrudering viser at den kondenserte eneste prøven har en mye bredere fordeling sentrert nær 400 nanometer, mens den ekstruderte prøven har en smalere fordeling sentrert ved 200 nanometer. Justerbar motstand puls sensing analyse som brukes til å analysere fase skift dråper som de har blitt vasket av sentrifugering for å fjerne overflødig liposomer viser at dråpestørrelsene er nær 200 nanometer.Mikroskopidataene for nanodropletdampisering ved oppvarming viser at noen spontant fordampede mikrobobler er tydelige innen synsfeltet før oppvarming, og et større antall gassmikrobobler observeres etter oppvarming. Mikroskopibildene av nanodråper satt inn i ekstruderen direkte uten forkjøling, kondensert ved null grader Celsius, og ved minus 18 grader celsius vises her. Representative bilder av kondenserte oktafluoropropandråper før og etter fordampning viser også et større antall gassmikrobobler etter oppvarming, som ligner på DFB-dråpene.Det viktigste å huske under denne prosedyren er at dråpeutbyttet er svært avhengig av temperatur og trykk under kondens, og små variasjoner vil påvirke resultatene. Etter å ha generert fordampelige dråper, kan de brukes til å optimalisere in vivo-avbildning og legemiddellevering ved hjelp av ultralyd, samt andre in vivo- og ex vivo-applikasjoner. Etter å ha utviklet denne teknikken, har effekten av nanodropletstørrelse og gasskjerneinnhold på in vivo-fordampningsterskler blitt utforsket ved hjelp av små modifikasjoner på denne protokollen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produksjon og målretting av Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produksjon av kjemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bruke bambushydrolysat som råstoff

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokoll for optimalisering av Heterologous Protein produksjonen ved hjelp av automatisert Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Produksjon av ekstracellulær Matrix fiber via oppofrende hul Fiber membran cellekultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Mikrofluidisk produksjon av lysolipidholdige temperaturfølsomme liposomer

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

Magnetiske, akustiske og optisk-trippel-responsive mikrobobler for magnetisk hypertermi og pothototermisk kombinasjonskreftterapi

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Bildebehandling og kvantifisering av området av hurtiggående mikrobobler ved hjelp av et høyhastighetskamera og bildeanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

En effektiv metode for Adenovirusproduksjon

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Multi-tidsskala mikroskopi metoder for karakterisering av fluorescerende merket mikrobobler for ultralyd-utløst legemiddel frigjøring

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...