Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Доминика Джеймса из лаборатории доктора Кена Хойта за предоставление TRSP-анализа испаряемых нанокапель с фазовым сдвигом.

1. Изготовление липидных пленок
<ol><li>Подготовьте липидные пленки для генерации микропузырьков с использованием 90% DSPC и 10% DSPE-PEG2K путем смешивания липидов в правильном соотношении с использованием следующих направлений:<ol>
<li>Изготавливайте стандартные липиды DSPC и DSPE-PEG2K в хлороформе. Вз?...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

Доступен обширный объем литературы, в которой обсуждается формулировка, физика и потенциальное применение микропузырьков и капель фазового сдвига для визуализации in vivo и терапии. Это обсуждение явно относится к генерации липидных микропузырьков и превращению их в субмикронные капли ...

Ультразвуковые контрастные вещества (UCA) быстро растут в популярности для визуализации и терапии. Микропузырьки, оригинальные UCA, в настоящее время являются основными агентами, используемыми в клинических диагностических приложениях. Микропузырьки представляют собой газонаполненные сферы, обычно диаметром 1-10 мкм, окруженные липидными, белковыми или полимерными оболочками1. Однако их размер и стабильность in vivo могут ограничивать их функциональность во многих приложениях. Нанокапли с фазовым сдвигом, которые содержат перегретое жидкое ядро, могут преодолеть некоторые из этих ограничений из-за их меньшего размера и улучшенного срока службы циркуляции2. При воздействии тепловой или акустической энергии перегретое жидкое ядро испаряется с образованием газового микропузырька2,3,4,5. Поскольку порог испарения непосредственно связан с размером капель5,6, для достижения последовательных пороговых значений активации было бы весьма желательно сформулировать суспензии капель с одинаковым размером. Методы составления рецептур, которые производят однородные размеры капель, часто являются сложными и дорогостоящими, тогда как более экономически эффективные подходы приводят к полидисперсным решениям7. Другим ограничением является способность генерировать стабильные капли фазового сдвига с перфторуглеродными газами с низкой температурой кипения (PFC), что имеет решающее значение для эффективной активации in vivo8. В этой рукописи описан протокол для получения стабильных отфильтрованных капель с фазовым сдвигом с низкой температурой кипения для визуализации in vivo и терапии.
Существует множество методов получения монодисперсных субмикронных фазово-сдвиговых капель7. Одним из наиболее надежных методов контроля размера является использование микрофлюидных устройств. Эти устройства могут быть дорогостоящими, иметь медленные темпы производства капель (~ 104-106 капель / с)7 и требуют обширной подготовки. Микрофлюидные устройства также обычно требуют газов с высокой температурой кипения, чтобы избежать спонтанного испарения и засорения системы7. Однако недавнее исследование de Gracia Lux et al.9 демонстрирует, как охлаждение микрофлюидизатора может быть использовано для получения высоких концентраций субмикронного фазового сдвига (1010-1012/мл) с использованием декафторбутана с низкой температурой кипения (DFB) или октафторпропана (OFP).
В целом, газы с низкой температурой кипения, такие как DFB или OFP, легче обрабатывать с помощью предварительно сформированных пузырьков газа. Испаряемые капли могут быть получены из стабилизированных прекурсорами липидных пузырьков путем конденсации газа с использованием низких температур и повышенного давления5,10. Концентрация капель, полученных с помощью этого метода, зависит от концентрации микропузырьков предшественника и эффективности превращения пузырьков в капли. Сообщалось о концентрированных микропузырьках от ультразвуковой обработки кончика, приближающейся к > 1010 МБ / мл11, в то время как в отдельном исследовании сообщалось о концентрациях капель в диапазоне от ~ 1-3 х1011 капель / мл от конденсированных пузырьков OFP и DFP12. Когда монодисперсные капли не являются проблемой, методы конденсации являются наиболее простыми и недорогими методами получения стабилизированных липидами каплей фазового сдвига с использованием ПФУ с низкой температурой кипения. Методы образования пузырьков однородного размера перед конденсацией могут помочь создать больше монодисперсных популяций капель. Однако создание монодисперсных пузырьков-предшественников также затруднено, что требует более дорогостоящих подходов, таких как микрофлюидика или методы повторного дифференциального центрифугирования11. Недавно был опубликован альтернативный подход к получению нанокапель DFB и OFB с использованием спонтанного зародыша капель в липосомах13. Этот метод, использующий эффект «узо», является простым способом получения капель PFC с низкой температурой кипения без необходимости конденсации пузырьков. Распределение по размерам капель PFC можно контролировать путем деликатного титрования и смешивания компонентов PFC, липидов и этанола, используемых для инициирования нуклеации капель. Также стоит отметить, что смешивание перфторуглеродов может быть использовано для контроля порогов стабильности и активации нанокапель14,15. Более поздняя работа Shakya et al. демонстрирует, как активация нанокаплей может быть настроена путем эмульгирования ПФУ с высокой температурой кипения в углеводородном эндоскелете для облегчения гетерогенного зарождения в ядре капли16, что является подходом, который можно рассматривать наряду с другими формами фильтрации размера капель.
После образования капли фазового сдвига могут быть экструдированы после образования для создания большего количества монодисперсных популяций. Фактически, протокол, аналогичный описанному здесь методу, был опубликован ранее Kopechek et al.17 с использованием додекофторпентана с высокой температурой кипения (DDFP) в качестве ядра капли. Читатели, стремящиеся использовать капли фазового сдвига с перфторуглеродами с высокой температурой кипения (стабильными при комнатной температуре), должны вместо этого ссылаться на статью выше. Генерация и экструдирование капель с низкой температурой кипения газов, таких как DFB и OFP, является более сложным и лучше всего подходит для конденсации предварительно сформированных пузырьков газа.
В этом протоколе описан распространенный способ генерации предварительно сформированных липидных микропузырьков с газовым ядром DFB с использованием обработки ультразвуком наконечника зонда. Затем коммерческий экструдер используется для конденсации предварительно сформированных микропузырьков в субмикронные нанокапли с фазовым сдвигом (рисунок 1). Полученные капли затем активируются с помощью тепла и ультразвука. Этот метод может производить большие объемы раствора нанокаплей, чем обычные методы конденсации с более узкими размерными распределениями без необходимости использования дорогостоящих микрофлюидных устройств. Производство нанокаплетных растворов с узким распределением размеров, вероятно, может привести к более однородным порогам испарения. Это позволит максимизировать их потенциал для многочисленных применений, таких как визуализация, абляция, доставка лекарств и эмболизация1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема экструзионной установки высокого давления для конденсации предварительно сформированных микропузырьков в нанокапли со сдвигом фазы. Микропузырьковый раствор добавляют и содержат в камере экструдера, а 250 фунтов на квадратный дюйм из азотного резервуара подают через впускной клапан камеры. Газообразный азот будет проталкивать микропузырьковый раствор через фильтр в основании камеры, конденсируя образец до нанокаплей. Раствор окончательно выталкивается из экструдера через пробу на выходе и собирается. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Существует множество методов, которые могут быть использованы для производства испаряемых капель фазового сдвига для визуализации и терапии. Каждый метод использует различные методы и различается по цене, материалам и назначению. Многие из этих методов изготовления приводят к полидисперсным популяциям с неоднородными порогами активации. Кроме того, контроль размеров капель обычно требует стабильных перфторуглеродных жидкостей с высокими порогами активации, которые не являются практичными in vivo. Получение однородных размеров капель с использованием газов с низкой температурой кипения было бы полезно для экспериментов по визуализации in vivo и терапии. В данной статье описан простой и экономичный способ формирования калиброванных по размеру липид-стабилизированных фазово-сдвиговых нанокаплей с низкой температурой кипения декафторбутана (DFB). Описан распространенный способ генерации липидных микропузырьков, в дополнение к новому методу их конденсации с экструзией под высоким давлением за один этап. Этот метод предназначен для экономии времени, максимизации эффективности и создания больших объемов микропузырьковых и нанокаплетных растворов для широкого спектра применений с использованием общего лабораторного оборудования, найденного во многих биологических лабораториях.

Репрезентативные результаты распределения по размерам включены с использованием динамического рассеяния света (DLS) и перестраиваемого резистивного импульсного зондирования (TRSP). На рисунке 5 показано распределение по размерам конденсированных пузырьковых растворов ?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Этот протокол описывает способ генерации больших объемов инкапсулированных липидами микропузырьков декафторбутана с использованием ультразвуковой обработки зондовым наконечником и последующей конденсации их в нанокапли с фазовым сдвигом с использованием экструзии высокого давления и механической фильтрации.

Производство мембранно-фильтрованных фазовых декафторбутановых нанокафторбутановых из предварительно сформированных микропузырьков

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Этот протокол является простым методом снижения полидисперсности капель с низкой температурой кипения для использования в биомедицинских приложениях. Этот метод конденсирует предварительно сформированные газовые микропузырьки и фильтрует образующиеся капли жидкости по размеру таким образом, чтобы это было контролируемым, масштабируемым и относительно экономически эффективным. Этот метод может быть применен к различным липидным микропузырькам с различной оболочкой и газовым материалом с использованием различных фильтров для контроля конечного размера капель.Продемонстрировать процедуру будет Дарра Мериллат, исследователь бакалавриата из лаборатории доктора Сирси. Включите выключатель питания для ультразвукового аппарата и установите амплитуду на максимально допустимую с помощью микрозащелки, а также убедитесь, что время обработки ультразвуком установлено равным 10 секундам. Поместите теплый гидратированный липидный раствор в звуковой корпус с микроконфортом прямо под поверхностью.Прикрепите трубку соответствующей длины к горловине флакона, чтобы направить газ из выходного отверстия резервуара DFB в теплый раствор липидов, удерживаемый в корпусе. Медленно открывайте клапан резервуара, пока не будет видно, как газ течет по раствору липидов, вызывая небольшую рябь на поверхности жидкости. Если поток газа слишком высок, раствор будет переполняться во время образования микропузырьков.Запустите ультразвуковой аппарат и запускайте его в течение 10 секунд непрерывно, чтобы генерировать микропузырьки. После окончания обработки ультразвуком немедленно закройте клапан резервуара DFB. Быстро закройте микропузырь и погрузите флакон в ледяную ванну, чтобы охладить образец ниже 55 градусов по Цельсию.Используйте 200-нанометровый керамический фильтр для сборки экструдера высокого давления в соответствии с руководством пользователя и поместите его в центр водонепроницаемого контейнера, чтобы выпускная трубка образца не прижималась к стороне и не обжималась. Подключите экструдер к азотному газовому баллону с помощью адаптера, поставляемого производителем. Поместите конец выходной трубки в сцинтилляционный флакон для сбора экструдированного образца, закрепив трубку на контейнере лентой, чтобы она оставалась внутри флакона.Откройте и закройте выпускной клапан, чтобы убедиться, что в экструдере нет давления. Снимите крышку камеры. И добавьте пять миллилитров PBS в камеру экструдера.Замените крышку, убедившись, что она надежно щелкает обратно на место. Откройте резервуар для азотного газа, чтобы манометр показывал 250 фунтов на квадратный дюйм, убедившись, что клапан регулирования давления находится в закрытом положении. Закройте бензобак и откройте впускной клапан камеры экструдера, в результате чего раствор PBS будет проталкиваться через систему, и вывести трубку на выходе образца в сцинтилляционный флакон.Когда из трубы выходит только газ, откройте выпускной клапан и позвольте давлению упасть до нуля PSI. Затем удалите сцинтилляционный флакон. Откройте и закройте выпускной клапан, чтобы убедиться, что внутри экструдера нет давления, и поместите новый сцинтилляционный флакон на конец выпускной трубки.Наполните стальной контейнер 2-метилбутаном и добавьте сухой лед, чтобы снизить температуру до минус 18 градусов по Цельсию. Вставьте микропузырьковый раствор в охлажденный 2-метилбутан, погружая образец на две минуты. Переместите флакон в течение двух минут, чтобы аккуратно перемешать пузырьки.Добавьте сухой лед по мере необходимости, чтобы поддерживать температуру между минус 15 и минус 18 градусами по Цельсию. Через две минуты удалите микропузырьки из охлажденного 2-метилбутана. Аккуратно закрутите флакон, чтобы перемешать микропузырьки, и переложите пузырьки в охлажденный 10-миллилитровый шприц.Снимите крышку камеры экструдера и добавьте микропузырьковый раствор в камеру, медленно нажимая плунжер на шприц. Замените крышку экструдера, убедившись, что она надежно щелкает на месте. Убедитесь, что клапан регулирования давления и выпускной клапан экструдера находятся в закрытом положении.Откройте резервуар для азотного газа до тех пор, пока манометр не покажет 250 фунтов на квадратный дюйм. Закройте бензобак и поверните клапан регулирования давления в открытое положение. Когда раствор заполнит сцинтилляционный флакон на выходе из трубки и из трубки выйдет только газ, медленно откройте клапан сброса давления и дайте давлению упасть до нуля PSI.Переложите 10 миллилитров экструдированного капельного раствора в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте экструдированный образец в 1 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант и самопроизвольно испарившиеся капли, появляющиеся в верхней части раствора.Повторно суспендировать гранулу, содержащую нанокапли DFP в 10 миллилитрах PBS с 20% глицерина и 20% пропиленгликоля. Распределение по размерам конденсированных пузырьковых растворов с экструзией и без нее показывает, что конденсированный только образец имеет гораздо более широкое распределение, центрированное около 400 нанометров, тогда как экструдированный образец имеет более узкое распределение, центрированное на 200 нанометрах. Перестраиваемый импульсно-чувствительный анализ сопротивления, используемый для анализа капель фазового сдвига, поскольку они были промыты центрифугированием для удаления избыточных липосом, показывает, что размеры капель составляют около 200 нанометров.Данные микроскопии испарения нанокаплей при нагревании показывают, что некоторые спонтанно испарившиеся микропузырьки проявляются в поле зрения перед нагревом, а после нагрева наблюдается большее количество газовых микропузырьков. Здесь показаны микроскопические изображения нанокапель, вставленных в экструдер непосредственно без предварительного охлаждения, конденсированных при нуле градусов Цельсия и при минус 18 градусах Цельсия. Репрезентативные изображения конденсированных капель октафторпропана до и после испарения также показывают большее количество газовых микропузырьков после нагревания, аналогичных каплям DFB.Самое главное, что нужно помнить во время этой процедуры, это то, что выход капель сильно зависит от температуры и давления во время конденсации, и небольшие изменения повлияют на результаты. После получения испаряемых капель они могут быть использованы для оптимизации визуализации in vivo и доставки лекарств с использованием ультразвука, а также других приложений in vivo и ex vivo. После разработки этого метода было изучено влияние размера нанокаплета и содержания газового ядра на пороги испарения in vivo с использованием небольших модификаций этого протокола.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Производство и таргетинг одновалентных квантовых точек

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Производство химических веществ<em&gt; Флейм</em&gt; Использование бамбукового гидролизата в качестве исходного сырья

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Производство волокон внеклеточного матрикса через жертвенную полые волокна мембраны клеточной культуры

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Микрофлюидическое производство лизолипид-содержащих температурно-чувствительных липосом

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

Магнитные, акустические и оптические тройные микропузырьки для магнитной гипертермии и пототермической комбинированной терапии рака

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Изображение и количественная оценка области быстро движущихся микропузырей с помощью высокоскоростной камеры и анализа изображений

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Эффективный метод производства аденовируса

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Многовременные методы микроскопии для характеристики флуоресцентно меченых микропузырьков для ультразвукового высвобождения лекарственных средств

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...