Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Dominique James en el laboratorio del Dr. Ken Hoyt por proporcionar análisis TRSP de nanogotas vaporizables de cambio de fase

1. Hacer películas lipídicas
<ol><li>Prepare películas lipídicas para la generación de microburbujas utilizando 90% DSPC y 10% DSPE-PEG2K mezclando los lípidos en la proporción correcta utilizando las siguientes instrucciones:<ol>
<li>Hacer lípidos de stock de DSPC y DSPE-PEG2K en cloroformo. Pesar 50 mg de cada polvo lipídico en viales separados. Añadir 1 ml de cloroformo a cada vial con una jeringa de vidrio de 1 ml.</li>
		<li>Añadir 287 μL de material DSPC y 113 μL de DSPE-PEG2K (ambos 50 mg/ml) en un ...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

Hay disponible un cuerpo completo de literatura que analiza la formulación, la física y las aplicaciones potenciales de las microburbujas y las gotas de cambio de fase para imágenes y terapia in vivo. Esta discusión se refiere explícitamente a la generación de microburbujas lipídicas y su conversión en gotas de cambio de fase submicrométricas utilizando un gas DFB de bajo punto de ebullición y extrusión a alta presión. El método descrito aquí está destinado a proporcionar un método relativamente simple de...

Los agentes de contraste por ultrasonido (UCA) están creciendo rápidamente en popularidad para aplicaciones de imágenes y terapia. Las microburbujas, los UCA originales, son actualmente los agentes principales utilizados en aplicaciones de diagnóstico clínico. Las microburbujas son esferas llenas de gas, típicamente de 1-10 μm de diámetro, rodeadas de capas de lípidos, proteínas o polímeros1. Sin embargo, su tamaño y estabilidad in vivo pueden limitar su funcionalidad en muchas aplicaciones. Las nanogotas de cambio de fase, que contienen un núcleo líquido sobrecalentado, pueden superar algunas de estas limitaciones debido a su tamaño más pequeño y a la mejora de la vida útil de la circulación2. Cuando se expone al calor o a la energía acústica, el núcleo líquido sobrecalentado se vaporiza para formar una microburbuja de gas2,3,4,5. Dado que el umbral de vaporización está directamente relacionado con el tamaño de las gotas5,6, la formulación de suspensiones de gotas con un tamaño uniforme sería muy deseable para lograr umbrales de activación consistentes. Los métodos de formulación que producen tamaños de gotas uniformes son a menudo complejos y costosos, mientras que los enfoques más rentables dan como resultado soluciones de polidisperso7. Otra limitación es la capacidad de generar gotas estables de cambio de fase con gases perfluorocarbonos (PFC) de bajo punto de ebullición, lo cual es crítico para una activación eficiente in vivo8. En este manuscrito, se describe un protocolo para generar gotas de desplazamiento de fase vaporizables filtradas estables de bajo punto de ebullición para aplicaciones de imágenes y terapia in vivo.
Existen muchos métodos para producir gotas monodispersadas submicrónicas de desplazamiento de fase7. Uno de los métodos más robustos para controlar el tamaño es el uso de dispositivos microfluídicos. Estos dispositivos pueden ser costosos, tener tasas lentas de producción de gotas (~ 104-106 gotas / s)7 y requieren una capacitación extensa. Los dispositivos microfluídicos también requieren generalmente gases de alto punto de ebullición para evitar la vaporización espontánea y la obstrucción del sistema7. Sin embargo, un estudio reciente de gracia Lux et al.9 demuestra cómo el enfriamiento de un microfluidizador puede ser utilizado para generar altas concentraciones de cambio de fase submicrométrico (1010-1012/mL) utilizando decafluorobutano de bajo punto de ebullición (DFB) u octafluoropropano (OFP).
En general, los gases de bajo punto de ebullición como DFB u OFP son más fáciles de manejar utilizando burbujas de gas preformadas. Las gotas vaporizables se pueden producir a partir de burbujas precursoras estabilizadas con lípidos condensando el gas utilizando bajas temperaturas y presión elevada5,10. La concentración de gotas producidas utilizando este método depende de la concentración de microburbujas precursoras y la eficiencia de la conversión de burbujas en gotas. Se han reportado microburbujas concentradas a partir de sonicación de puntas que se acercan a > 1010 MB/mL11, mientras que un estudio separado ha reportado concentraciones de gotas que van desde ~1-3 x1011 gotas/ml de burbujas condensadas de OFP y DFP12. Cuando las gotas monodispersadas no son una preocupación, los métodos de condensación son los métodos más sencillos y de menor costo para generar gotas de cambio de fase estabilizadas con lípidos utilizando PFC de bajo punto de ebullición. Los métodos para generar burbujas de tamaño uniforme antes de la condensación pueden ayudar a crear poblaciones de gotas más monodispersas. Sin embargo, la generación de burbujas precursoras monodispersas también es difícil, ya que requiere enfoques más costosos como la microfluídica o las técnicas de centrifugación diferencial repetida11. Recientemente se ha publicado un enfoque alternativo para la producción de nanogotas DFB y OFB utilizando la nucleación espontánea de gotitas en liposomas13. Este método, que utiliza un efecto "Ouzo", es una forma sencilla de generar gotas de PFC de bajo punto de ebullición sin necesidad de condensar burbujas. La distribución del tamaño de las gotas de PFC se puede controlar mediante la delicada titulación y mezcla de componentes de PFC, lípidos y etanol utilizados para iniciar la nucleación de las gotas. También vale la pena señalar que la mezcla de perfluorocarbonos se puede utilizar para controlar los umbrales de estabilidad y activación de las nanogotas14,15. Un trabajo más reciente de Shakya et al. demuestra cómo la activación de nanogotas se puede ajustar emulsionando PFC de alto punto de ebullición dentro de un endoesqueleto de hidrocarburos para facilitar la nucleación heterogénea dentro del núcleo de gotas16, que es un enfoque que se puede considerar junto con otras formas de filtración de tamaño de gotas.
Una vez formadas, las gotas de cambio de fase se pueden extruir después de la formación para crear poblaciones más monodispersas. De hecho, un protocolo similar al método aquí descrito ha sido publicado previamente por Kopechek et al.17 utilizando dodecofluorpentano de alto punto de ebullición (DDFP) como núcleo de gotas. Los lectores que buscan usar gotas de cambio de fase con perfluorocarbonos de alto punto de ebullición (estables a temperatura ambiente) deben consultar el artículo anterior en su lugar. Generar y extruir gotas con gases de bajo punto de ebullición, como DFB y OFP, es más complicado y se aborda mejor condensando burbujas de gas preformadas.
En este protocolo, se describe un método común para generar microburbujas lipídicas preformadas con un núcleo de gas DFB utilizando la sonicación de la punta de la sonda. A continuación, se utiliza una extrusora comercial para condensar microburbujas preformadas en nanogotas de desplazamiento de fase submicrónicas (Figura 1). Las gotas resultantes son activables por calor y ultrasonido. Este método puede producir mayores volúmenes de solución de nanogotas que los métodos de condensación convencionales con distribuciones de tamaño más estrechas sin la necesidad de costosos dispositivos microfluídicos. La producción de soluciones de nanogotas con distribuciones de tamaño estrechas probablemente puede generar umbrales de vaporización más uniformes. Esto maximizará su potencial para numerosas aplicaciones, como imágenes, ablación, administración de fármacos y embolización1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de configuración de extrusión de alta presión para condensar microburbujas preformadas en nanogotas de cambio de fase. La solución de microburbuja se agrega y está contenida en la cámara extrusora, y se aplican 250 psi, del tanque de nitrógeno, a través de la válvula de entrada de la cámara. El gas nitrógeno empujará la solución de microburbuja a través del filtro en la base de la cámara, condensando la muestra en nanogotas. La solución finalmente se empuja fuera del extrusor a través del tubo de salida de la muestra y se recoge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Hay muchos métodos que se pueden utilizar para la producción de gotas vaporizables de cambio de fase para imágenes y terapia. Cada método utiliza diferentes técnicas y varía en precio, materiales y propósito. Muchos de estos métodos de fabricación dan como resultado poblaciones polidispersas con umbrales de activación no uniformes. Además, el control de los tamaños de las gotas generalmente requiere líquidos de perfluorocarbono estables con altos umbrales de activación que no son prácticos in vivo. Producir tamaños de gotas uniformes utilizando gases de bajo punto de ebullición sería beneficioso para los experimentos de imagen y terapia in vivo. Este artículo describe un método simple y económico para la formación de nanogotas de cambio de fase estabilizadas por lípidos filtradas por tamaño con decafluorobutano (DFB) de bajo punto de ebullición. Se describe un método común para generar microburbujas lipídicas, además de un nuevo método para condensarlas con extrusión a alta presión en un solo paso. Este método está diseñado para ahorrar tiempo, maximizar la eficiencia y generar mayores volúmenes de soluciones de microburbujas y nanogotas para una amplia variedad de aplicaciones utilizando equipos de laboratorio comunes que se encuentran en muchos laboratorios biológicos.

Los resultados representativos de la distribución de tamaño se incluyen mediante el análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) y detección de pulso resistivo sintonizable (TRSP). La Figura 5 muestra la distribución de tamaño de las soluciones de burbujas condensadas con y sin extrusión. Sin extrusión, el protocolo termina en el paso 5.3. Las burbujas refrigeradas se condensan ventilando la muestra a presión atmosférica mientras está fría. La única muestra condensada tiene un...

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Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Este protocolo describe un método para generar grandes volúmenes de microburbujas de decafluorobutano encapsuladas en lípidos utilizando sonicación de punta de sonda y posteriormente condensarlos en nanogotas de cambio de fase utilizando extrusión de alta presión y filtración mecánica.

Producción de nanogotas de decafluorobutano de cambio de fase filtradas por membrana a partir de microburbujas preformadas

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Este protocolo es un método fácil de reducir la polidispersidad de gotas vaporizables de bajo punto de ebullición para su uso en aplicaciones biomédicas. Esta técnica condensa microburbujas de gas preformadas y filtra las gotas líquidas resultantes por tamaño de una manera que es controlable, escalable y relativamente rentable. Este método se puede aplicar a una variedad de microburbujas lipídicas con diferentes carcasas y materiales de gas utilizando diferentes filtros para controlar el tamaño final de la gota.Demostrando el procedimiento estará Darrah Merillat, una investigadora de pregrado del laboratorio del Dr. Sirsi. Encienda el interruptor de encendido del sonicador y ajuste la amplitud al máximo permitido utilizando el accesorio de micropunta, y asegure el tiempo de sonicación establecido en 10 segundos. Coloque la solución lipídica hidratada caliente en el recinto de sonido con la micropunta justo debajo de la superficie.Conecte una longitud adecuada de tubo al cuello del vial para guiar el gas desde la salida del tanque DFB hacia la solución lipídica tibia que se encuentra en el recinto. Abra la válvula del tanque lentamente hasta que se pueda ver que el gas fluye sobre la solución lipídica, causando ligeras ondulaciones en la superficie del líquido. Si el flujo de gas es demasiado alto, la solución se desbordará durante la formación de microburbujas.Inicie el sonicador y ejecútelo durante 10 segundos continuamente para generar microburbujas. Una vez finalizada la sonicación, cierre inmediatamente la válvula del tanque DFB. Cubra rápidamente la solución de microburbuja y sumerja el vial en un baño de hielo para enfriar la muestra por debajo de 55 grados centígrados.Use un filtro cerámico de 200 nanómetros para ensamblar la extrusora de alta presión de acuerdo con el manual del usuario, y colóquela en el centro de un recipiente estanco, de modo que el tubo de salida de la muestra no se presione contra el costado ni se engarce. Acople la extrusora al tanque de gas nitrógeno utilizando el adaptador suministrado por el fabricante. Coloque el extremo del tubo de salida en un vial de centelleo para recoger la muestra extruida, asegurando el tubo al recipiente con cinta adhesiva para que permanezca dentro del vial.Abra y cierre la válvula de liberación para asegurarse de que no haya presión dentro del extrusor. Retire la tapa de la cámara. Y agregue cinco mililitros de PBS a la cámara del extrusor.Reemplace la tapa, asegurándose de que vuelva a su lugar de forma segura. Abra el tanque de gas nitrógeno, de modo que el manómetro lea 250 PSI, asegurándose de que la válvula de control de presión esté en la posición cerrada. Cierre el tanque de gas y abra la válvula de entrada de la cámara del extrusor, lo que hace que la solución de PBS se empuje a través del sistema y salga del tubo de salida de la muestra hacia el vial de centelleo.Cuando solo salga gas del tubo, abra la válvula de liberación y permita que la presión caiga a cero PSI. A continuación, retire el vial de centelleo. Abra y cierre la válvula de liberación para asegurarse de que no haya presión dentro de la extrusora y coloque un nuevo vial de centelleo al final del tubo de salida.Llene un recipiente de acero con 2-metilbutano y agregue hielo seco para bajar la temperatura a menos 18 grados centígrados. Inserte la solución de microburbujas en el 2-metilbutano refrigerado, sumergiendo la muestra durante dos minutos. Mueva el vial de centelleo durante los dos minutos para mezclar suavemente las burbujas.Agregue hielo seco según sea necesario para mantener la temperatura entre menos 15 y menos 18 grados centígrados. Después de dos minutos, retire las microburbujas del 2-metilbutano refrigerado. Agite suavemente el vial para mezclar las microburbujas y transfiera las burbujas a una jeringa refrigerada de 10 mililitros.Retire la tapa de la cámara del extrusor y agregue la solución de microburbujas a la cámara empujando lentamente el émbolo sobre la jeringa. Reemplace la tapa de la extrusora, asegurándose de que haga clic de forma segura en su lugar. Verifique que la válvula de control de presión y la válvula de liberación del extrusor estén en la posición cerrada.Abra el tanque de gas nitrógeno hasta que el manómetro lea 250 PSI. Cierre el tanque de gasolina y gire la válvula de control de presión a la posición abierta. Cuando la solución haya llenado el vial de centelleo en el tubo de salida y solo salga gas del tubo, abra lentamente la válvula de liberación de presión y permita que la presión caiga a cero PSI.Transfiera 10 mililitros de la solución de gotas extruidas a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar la muestra extruida a 1.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y las gotas vaporizadas espontáneamente que aparecen en la parte superior de la solución.Vuelva a suspender el pellet que comprende nanogotas DFP en 10 mililitros de PBS con 20% de glicerol y 20% de propilenglicol. La distribución de tamaño de las soluciones de burbujas condensadas con y sin extrusión muestra que la única muestra condensada tiene una distribución mucho más amplia centrada cerca de 400 nanómetros, mientras que la muestra extruida tiene una distribución más estrecha centrada en 200 nanómetros. El análisis de detección de pulso de resistencia sintonizable utilizado para analizar las gotas de cambio de fase a medida que se han lavado por centrifugación para eliminar el exceso de liposomas muestra que los tamaños de las gotas están cerca de los 200 nanómetros.Los datos de microscopía de la vaporización de nanogotas cuando se calientan muestran que algunas microburbujas vaporizadas espontáneamente son evidentes en el campo de visión antes del calentamiento, y se observa un mayor número de microburbujas de gas después del calentamiento. Las imágenes de microscopía de nanogotas insertadas en el extrusor directamente sin preenfriamiento, condensadas a cero grados Celsius y a menos 18 grados Celsius se muestran aquí. Las imágenes representativas de gotas condensadas de octafluoropropano antes y después de la vaporización también muestran un mayor número de microburbujas de gas después del calentamiento, similar a las gotas de DFB.Lo más importante a recordar durante este procedimiento es que el rendimiento de las gotas depende en gran medida de la temperatura y la presión durante la condensación, y las ligeras variaciones afectarán los resultados. Después de generar gotas vaporizables, se pueden utilizar para optimizar las imágenes in vivo y la administración de fármacos mediante ultrasonido, así como otras aplicaciones in vivo y ex vivo. Después de desarrollar esta técnica, se han explorado los efectos del tamaño de las nanogotas y el contenido del núcleo de gas en los umbrales de vaporización in vivo utilizando ligeras modificaciones a este protocolo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Producción y focalización de monovalente Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Investigación

Bioingeniería

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Producción de productos químicos por<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Usando hidrolizado de bambú como materia prima

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Producción de fibras de la matriz extracelular mediante cultivo de células de membrana de fibra hueca sacrificio

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Producción microfluídica de liposomas sensibles a la temperatura que contienen lysolipido

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

Microburbujas magnéticas, acústicas y ópticas de triple respuesta para la hipertermia magnética y la terapia combinada de cáncer potototérmico

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Imágenes y cuantificación del área de microburbujas de movimiento rápido mediante una cámara de alta velocidad y análisis de imágenes

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Un método eficiente para la producción de adenovirus

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Métodos de microscopía a escala de tiempo múltiple para la caracterización de microburbujas marcadas con fluorescencia para la liberación de fármacos desencadenada por ultrasonido

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...