Name: production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Vi vill tacka Dominique James i Dr. Ken Hoyts labb för att ha tillhandahållit TRSP-analys av vaporizable fas-shift nanodroppar

1. Göra lipidfilmer
<ol><li>Förbered lipidfilmer för mikrobubblegenerering med 90% DSPC och 10% DSPE-PEG2K genom att blanda lipiderna i rätt förhållande med följande anvisningar:<ol>
<li>Gör lagerfetter av DSPC och DSPE-PEG2K i kloroform. Väg 50 mg av varje lipidpulver i separata injektionsflaska. Tillsätt 1 ml kloroform till varje flaska med en 1 ml glasspruta.</li>
		<li>Tillsätt 287 μL DSPC-buljong och 113 μL DSPE-PEG2K-buljong (båda 50 mg/ml) i en 20 ml scintillationsflaska med en glasspruta.</li>
		<...

<ol>
	<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+compositions,+properties+and+biomedical+applications.">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy.">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li><li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes.">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li><li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops.">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound.">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li><li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography:+current+progress,+challenges,+and+prospects.">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684 (2014).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography.">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li><li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging.">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li><li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents.">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li><li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles.">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li><li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Wu, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets:+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery.">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).</li><li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents.">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li><li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons.">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li><li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting.">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li><li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions.">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).</li><li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation.">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).</li></ol>

En omfattande mängd litteratur finns tillgänglig som diskuterar formulering, fysik och potentiella tillämpningar av microbubbles och fas-skift droppar för in vivo imaging och terapi. Denna diskussion gäller uttryckligen att generera lipidmikrobubblor och omvandla dem till sub-micron fasförskjutning droppar med hjälp av en låg kokpunkt DFB gas och högtryck extrudering. Metoden som beskrivs här är avsedd att ge en relativt enkel metod för att producera stora mängder lipidmikrobubblor och DFB fasförskjutningsd...

Ultraljud kontrastmedel (UCAs) växer snabbt i popularitet för imaging och terapi applikationer. Microbubbles, de ursprungliga UCAs, är för närvarande de vanliga agenterna som används i kliniska diagnostiska applikationer. Mikrobubblor är gasfyllda sfärer, vanligtvis 1-10 μm i diameter, omgivna av lipid-, protein- eller polymerskal1. Deras storlek och in vivo-stabilitet kan dock begränsa deras funktionalitet i många applikationer. Fasförskjutningsnanodroppar, som innehåller en överhettad vätskekärna, kan övervinna några av dessa begränsningar på grund av deras mindre storlek och förbättrade cirkulationslivslängd2. När den överhettade vätskekärnan utsätts för värme eller akustisk energi förångas den till en gasmikrobubble2,3,4,5. Eftersom förångningströskeln är direkt relaterad till droppstorlek5,6, skulle det vara mycket önskvärt att formulera droppfjädringar med enhetlig storlek för att uppnå konsekventa aktiveringströsklar. Formuleringsmetoder som producerar enhetliga droppstorlekar är ofta komplexa och kostsamma, medan mer kostnadseffektiva metoder resulterar i polydisperselösningar7. En annan begränsning är förmågan att generera stabila fasförskjutningsdroppar med PFC-gaser (Low-boiling Point perfluorocarbon), vilket är avgörande för effektiv aktivering in vivo8. I detta manuskript beskrivs ett protokoll för att generera stabila filtrerade låg kokpunkt vaporizable fas-shift droppar för in vivo imaging och terapi applikationer.
Det finns många metoder för att producera monodispersed submicron fasförskjutning droppar7. En av de mest robusta metoderna för att kontrollera storleken är användningen av mikrofluidiska enheter. Dessa enheter kan vara kostsamma, ha långsam produktion av droppar (~ 104-106 droppar / s) 7 och kräver omfattande utbildning. Mikrofluidiska enheter kräver också i allmänhet gaser med hög kokpunkt för att undvika spontan förångning och igensättning av systemet7. En ny studie av de Gracia Lux et al.9 visar dock hur kylning av en mikrofluidizer kan användas för att generera höga koncentrationer av submikrinfasförskjutning (1010-1012/ml) med låg kokpunkt dekafluorbutan (DFB) eller octafluorpropan (OFP).
I allmänhet är gaser med låg kokpunkt som DFB eller OFP lättare att hantera med förformade gasbubblor. Vaporizable droppar kan produceras från föregångare lipid-stabiliserade bubblor genom att kondensera gasen med låga temperaturer och förhöjt tryck5,10. Koncentrationen av droppar som produceras med denna metod beror på prekursormikrobubblekoncentration och effektiviteten av omvandling av bubblor till droppar. Koncentrerade mikrobubblor har rapporterats från tips ultraljudsbehandling närmar sig > 1010 MB/mL11, medan en separat studie har rapporterat droppkoncentrationer som sträcker sig från ~1-3 x1011 droppar/mL från kondenserade OFP och DFP bubblor12. När monodispersed droppar inte är ett problem, kondensation metoder är de enklaste och lägsta kostnadsmetoderna för att generera lipidstabiliserade fasförskjutning droppar med låg kokpunkt PFC. Metoder för att generera enhetliga storlek bubblor innan kondensering kan bidra till att skapa mer monodisperse populationer av droppar. Att generera monodisperse prekursorbubblor är dock också svårt, vilket kräver dyrare metoder som mikrofluidik eller upprepade differentialcentrifugeringstekniker11. Ett alternativt tillvägagångssätt för att producera DFB och OFB nanodroppar har nyligen publicerats med hjälp av spontana nukleering av droppar i liposomer13. Denna metod, med hjälp av en "Ouzo" -effekt, är ett enkelt sätt att generera PFC-droppar med låg kokpunkt utan att behöva kondensera bubblor. Storleksfördelningen av PFC droppar kan styras genom delikat titrering och blandning av PFC, lipid och etanol komponenter som används för att initiera nukleation av dropparna. Det är också värt att notera att blandning av perfluorkarboner kan användas för att kontrollera stabilitets- och aktiveringströsklar för nanodroppar14,15. Nyare arbete av Shakya et al. visar hur nanodropletaktivering kan justeras genom att emulgera höga kokpunkts-PFC inom ett kolväteendoskelett för att underlätta heterogen nukleation inom droppkärnan16, vilket är ett tillvägagångssätt som kan övervägas tillsammans med andra former av filtrering av droppstorlek.
När de har bildats kan fasförskjutningsdroppar extruderas efter bildandet för att skapa fler monodisperse populationer. Faktum är att ett liknande protokoll som den metod som beskrivs här har publicerats tidigare av Kopechek et al.17 med hjälp av hög kokpunkt dodecofluorpentane (DDFP) som droppkärna. Läsare som försöker använda fasförskjutningsdroppar med hög kokpunkt perfluorkarboner (stabila vid rumstemperatur) bör hänvisa till artikeln ovan istället. Att generera och extrudera droppar med låg kokpunktsgaser, såsom DFB och OFP, är mer komplicerat och kontaktas bäst genom att kondensera förformade gasbubblor.
I detta protokoll beskrivs en vanlig metod för att generera förformade lipid microbubbles med en DFB gas kärna med hjälp av sond tips ultraljudsbehandling. Därefter används en kommersiell extruder för att kondensera förformade mikrobubblor till submicronfasförskjutningsnanodroppar (figur 1). De resulterande dropparna aktiveras sedan med värme och ultraljud. Denna metod kan producera större volymer nanodropletlösning än konventionella kondensationsmetoder med smalare storleksfördelningar utan behov av dyra mikrofluidiska enheter. Produktion av nanodropletlösningar med smala storleksfördelningar kan sannolikt generera mer enhetliga förångningströsklar. Detta kommer att maximera deras potential för många applikationer såsom avbildning, ablation, läkemedelsleverans och embolization1,3,4,6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk högtrycksprofilering för kondensering av förformade mikrobubblor till fasförskjutningsnanodroppar. Mikrobubblelösning tillsätts till och finns i extruderkammaren, och 250 psi, från kvävetanken, appliceras genom kammarens inloppsventil. Kvävegasen kommer att driva mikrobubblelösningen genom filtret vid kammarens botten och kondensera provet till nanodroppar. Lösningen trycks slutligen ut ur extrudern genom provutloppsröret och samlas in. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting and centrifuging droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110606</td>
			<td>Extruder filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>03551-4</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-prong clamps X2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-217-002</td>
			<td>Holding scintilation vials in place for probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-198R</td>
			<td>Used to generate lipid microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337402</td>
			<td>Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-4</td>
			<td>Used to make lipid film for microbubble preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas</td>
			<td>FluoroMed L.P.</td>
			<td>1 kg</td>
			<td>generating microbubbles via probe tip sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>COATSOME MC-8080</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td>
			<td>Component of lipid film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Thermometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81139</td>
			<td>Used to mix lipids in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>Heating lipid films and vaporizing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipex 10 mL Extruder</td>
			<td>Evonik</td>
			<td></td>
			<td>Commercial high-pressure extrusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Used to remove excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Tank</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to operate extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Hydrate lipid films and washing droplets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Drain Disk</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Provides support for polycarbonate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>298417</td>
			<td>Used for solution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P355-1</td>
			<td>Reduces freezing temperature of PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintiliation Vials</td>
			<td>DWK Life Sciences Wheaton</td>
			<td>986532</td>
			<td>Used for lipid films and microbubble generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small hammer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to break apart dry ice for cooling methylbutane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Microtip Attachment</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101148070</td>
			<td>Used to generate microbubbles from lipid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Container</td>
			<td>Medegen</td>
			<td>79310</td>
			<td>Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuume Dessicator</td>
			<td>Bel-Art SP Scienceware</td>
			<td>08-648-100</td>
			<td>Removes excess chloroform from lipid films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02682004</td>
			<td>Used for concentrating nanodroplets </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of membrane-filtered phase-shift decafluorobutane nanodroplets from preformed microbubbles

Det finns många metoder som kan användas för produktion av vaporizable fas-shift droppar för avbildning och terapi. Varje metod använder olika tekniker och varierar i pris, material och syfte. Många av dessa tillverkningsmetoder resulterar i polydisperspopulationer med icke-enhetliga aktiveringströsklar. Dessutom kräver styrning av droppstorlekarna vanligtvis stabila perfluorkarbonvätskor med höga aktiveringströsklar som inte är praktiska in vivo. Att producera enhetliga droppar storlekar med låg kokpunkt gaser skulle vara fördelaktigt för in vivo imaging och terapi experiment. Denna artikel beskriver en enkel och ekonomisk metod för bildandet av storlek-filtrerade lipid-stabiliserade fas-skift nanodroppar med låg kokpunkt decafluorobutane (DFB). En vanlig metod för att generera lipidmikrobubblor beskrivs, förutom en ny metod för att kondensera dem med högtrycksprofilering i ett enda steg. Denna metod är utformad för att spara tid, maximera effektiviteten och generera större volymer av mikrobubble- och nanodropletlösningar för en mängd olika tillämpningar med hjälp av vanlig laboratorieutrustning som finns i många biologiska laboratorier.

Representativa resultat av storleksfördelningen ingår med hjälp av analys av dynamisk ljusspridning (DLS) och tunable resistiv pulsavkänning (TRSP). Figur 5 visar storleksfördelningen för kondenserade bubbellösningar med och utan extrudering. Utan extrudering slutar protokollet vid steg 5.3. De kylda bubblorna kondenseras genom att provet ventileras till atmosfärstryck medan det är kallt. Det kondenserade endast provet har en mycket bredare fördelning centrerad nära 400 nm. Det ex...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles at JoVE.com

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Detta protokoll beskriver en metod för att generera stora volymer av lipid inkapslade decafluorobutane microbubbles med hjälp av sond-tips ultraljudsbehandling och därefter kondensera dem till fas-skift nanodroplets med högtryck extrudering och mekanisk filtrering.

Produktion av membranfiltrerade fasförskjutningsdekafluorbutannanodroppar från förformade mikrobubblor

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Detta protokoll är en enkel metod för att minska polydispersiteten hos låg kokpunkts vaporizable droppar för användning i biomedicinska applikationer. Denna teknik kondenserar förformade gasmikrobubblor och filtrerar de resulterande vätskedropparna efter storlek på ett sätt som är kontrollerbart, skalbart och relativt kostnadseffektivt. Denna metod kan tillämpas på en mängd olika lipidmikrobubblor med olika skal- och gasmaterial med olika filter för att kontrollera den slutliga droppstorleken.Darrah Merillat, en grundforskare från Dr.Sirsis laboratorium, demonstrerar proceduren. Slå på strömbrytaren för ultraljudsbehandlingen och ställ in amplituden till det högsta tillåtna med hjälp av microtip-tillbehöret och se till att ultraljudsbehandlingstiden är inställd på 10 sekunder. Placera den varma hydratiserade lipidlösningen i ljudhöljet med mikrotoppen precis under ytan.Fäst en lämplig slanglängd på injektionsflaskans hals för att styra gasen från DFB-tankens utlopp i den varma lipidlösningen som hålls i höljet. Öppna tankventilen långsamt tills gasen kan ses flöda över lipidlösningen, vilket orsakar små krusningar på vätskans yta. Om gasflödet är för högt kommer lösningen att flöda över under mikrobubblebildningen.Starta ljudatorn och kör den i 10 sekunder kontinuerligt för att generera mikrobubblor. När ultraljudsbehandlingen är över, stäng omedelbart DFB tankventilen. Kapa snabbt mikrobubblelösningen och sänk ner injektionsflaskan i ett isbad för att kyla provet under 55 grader Celsius.Använd ett 200-nanometer keramiskt filter för att montera högtrycks extrudern enligt användarhandboken och placera den i mitten av en vattentät behållare, så att provutloppsröret inte pressas mot sidan eller pressas. Koppla extrudern till kvävegastanken med hjälp av den adapter som levereras av tillverkaren. Placera utloppsrörets ände i en scintillationsflaska för att samla upp det extruderade provet och säkra röret till behållaren med tejp för att hålla sig inom injektionsflaskan.Öppna och stäng frigöringsventilen för att säkerställa att det inte finns något tryck i extrudern. Ta bort kammarlocket. Och tillsätt fem milliliter PBS till extruderkammaren.Byt ut locket och se till att det klickar säkert tillbaka på plats. Öppna kvävegastanken så att tryckmätaren avläser 250 PSI och se till att tryckregleringsventilen är i stängt läge. Stäng gastanken och öppna extruderkammarens inloppsventil, vilket gör att PBS-lösningen trycks genom systemet och ut provutloppsröret i scintillationsflaskan.När endast gasen lämnar slangen öppnar du frigöringsventilen och låter trycket falla till noll PSI. Ta sedan bort scintillationsflaskan. Öppna och stäng frigöringsventilen för att säkerställa att det inte finns något tryck i extrudern och placera en ny scintillationsflaska i slutet av utloppsröret.Fyll en stålbehållare med 2-metylbutan och tillsätt torr is för att få ner temperaturen till minus 18 grader Celsius. För in mikrobubblelösningen i den kylda 2-metylbutan och sänk ner provet i två minuter. Flytta scintillationsflaskan under de två minuterna för att försiktigt blanda bubblorna.Tillsätt torris efter behov för att hålla temperaturen mellan minus 15 och minus 18 grader Celsius. Efter två minuter, ta bort mikrobubblorna från den kylda 2-metylbutan. Virvla försiktigt injektionsflaskan för att blanda mikrobubblorna och överför bubblor till en kyld 10-milliliter spruta.Ta bort extruderkammarlocket och tillsätt mikrobubblelösningen i kammaren genom att långsamt trycka kolven på sprutan. Byt ut extruderlocket och se till att det klickar säkert på plats. Kontrollera att tryckregleringsventilen och extruderns frigöringsventil är i stängt läge.Öppna kvävegastanken tills tryckmätaren avläser 250 PSI. Stäng gastanken och vrid tryckregleringsventilen till öppet läge. När lösningen har fyllt scintillationsflaskan vid utgångsslangen och endast gasen lämnar röret, öppna långsamt tryckavlastningsventilen och låt trycket falla till noll PSI.Överför 10 milliliter av den extruderade dropplösningen till ett 15-milliliter centrifugrör. Centrifugera det extruderade provet vid 1 500 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och de spontant förångade dropparna som visas högst upp i lösningen.Suspendera pelleten som består av DFP nanodroppar i 10 milliliter PBS med 20% glycerol och 20%propylenglykol. Storleksfördelningen av kondenserade bubbellösningar med och utan extrudering visar att det kondenserade provet har en mycket bredare fördelning centrerad nära 400 nanometer, medan det extruderade provet har en smalare fördelning centrerad vid 200 nanometer. Tunable resistenspulsavkänningsanalys som används för att analysera fasförskjutningsdroppar eftersom de har tvättats av centrifugering för att avlägsna överskott av liposomer visar att droppstorlekarna är nära 200 nanometer.Mikroskopidata för nanodropletförångning vid uppvärmning visar att vissa spontant förångade mikrobubblor är uppenbara inom synfältet före uppvärmning, och ett större antal gasmikrobubblor observeras efter uppvärmning. Mikroskopibilderna av nanodroppar som sätts in i extrudern direkt utan förkylning, kondenserade vid noll grader Celsius och vid minus 18 grader Celsius visas här. Representativa bilder av kondenserade octafluoropropane droppar före och efter förångning visar också ett större antal gas mikrobubblor efter uppvärmning, liknande DFB droppar.Det viktigaste att komma ihåg under denna procedur är att dropputbytet är mycket beroende av temperatur och tryck under kondensation, och små variationer kommer att påverka resultaten. Efter att ha genererat vaporizable droppar, de kan användas för att optimera in vivo imaging och drug delivery med ultraljud, liksom andra in vivo och ex vivo applikationer. Efter att ha utvecklat denna teknik har effekterna av nanodroplet storlek och gaskärninnehåll på in vivo förångning tröskelvärden utforskats med hjälp av små ändringar av detta protokoll.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion och inriktning av Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion av kemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Användning av bambuhydrolysat som råvara

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Produktion av extracellulärmatrix fibrer via uppoffrande ihålig Fiber membran cellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Mikrofluidisk produktion av lysolipidhaltiga temperaturkänsliga liposomer

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

Magnetiska, akustiska och optiska trippelresponsiva mikrobubblor för magnetisk hypertermi och pothotothermal kombinationscancerbehandling

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Avbildning och kvantifiering av området snabbrörliga mikrobubblor Med hjälp av en höghastighetskamera och bildanalys

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

En effektiv metod för Adenovirusproduktion

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Multi-timescale Mikroskopimetoder för karakterisering av fluorescerande märkta mikrobubblor för ultraljud-utlöst läkemedelsfrisättning

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...