Name: generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF en SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) subsidies 1R01HL124245, 1R01HL132520 en R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao werd ook ondersteund door start-upfondsen van het Abigail Wexner Research Institute in het Nationwide Children's Hospital.

De experimentele protocollen en geïnformeerde toestemming voor menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) in het Nationwide Children's Hospital.
1. Bereiding van celkweekmedia, oplossingen en reagentia
<ol><li>PBMC-media voorbereiden<ol>
<li>Meng 20 ml basale PBMC-cultuurmedia (1x) en 0,52 ml supplement. Voeg elk 20 μL SCF en FLT3 toe (voorraadconcentratie: 100 μg/ml), 4 μL IL3, IL6 en EPO elk (voorraadconcentratie: 100 μg/ml) en 200 μL L-gluta...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Hinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin+mutations+in+iPS+cells+define+sarcomere+insufficiency+as+a+cause+of+dilated+cardiomyopathy.">Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy.</a> Science. 349 (6251), 982-986 (2015).</li><li>Deacon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+interactions+of+genetic+variants+in+human+cardiomyopathy.">Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).</li><li>Gifford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligogenic+inheritance+of+a+human+heart+disease+involving+a+genetic+modifier.">Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier.</a> Science. 364 (6443), 865-870 (2019).</li><li>Lo Sardo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+role+of+the+most+impactful+cardiovascular+risk+locus+through+haplotype+editing.">Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing.</a> Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+cardiomyocytes+for+precision+medicine:+where+are+we+now.">Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now.</a> Stem Cells. 38, 822-833 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells:+from+developmental+biology+to+therapeutic+applications.">Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Zhao, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+resemblance+of+differentiated+cells+derived+from+isogenic+human+iPSCs+and+SCNT-derived+ESCs.">Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined,+albumin-free+human+cardiomyocyte+generation.">Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation.</a> Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+ipsc-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+develop+from+distinct+mesoderm+populations.">Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+promotes+pacemaker+cell+specification+of+cardiac+mesodermal+cells+derived+from+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt5b+signaling+directs+outlying+Nkx2.5++mesoderm+into+pacemaker+cardiomyocytes.">Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes.</a> Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+atrial+and+ventricular+myocytes+from+human+embryonic+stem+cells+by+alternating+retinoid+signals.">Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals.</a> Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).</li><li>Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banking+human+induced+pluripotent+stem+cells:+lessons+learned+from+embryonic+stem+cells.">Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+notch+signaling+promotes+cardiomyocyte+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+heart+through+Wnt+pathway+antagonism.">Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism.</a> Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).</li><li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+cardiac+growth+and+size.">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).</li><li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes.">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li><li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes.">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li></ol>

Tijdens iPSC-herprogrammering is het van cruciaal belang om PBMC's gedurende 1 week te kweken totdat ze zijn vergroot met duidelijke kernen en cytoplasma. Omdat PBMC's zich niet vermenigvuldigen, is een geschikt celnummer voor virale transductie belangrijk voor een succesvolle iPSC-herprogrammering. Het celaantal PBMC's, de multipliciteit van infectie (MOI) en de titer van het virus moeten worden overwogen en aangepast om de optimale transductieresultaten te bereiken. Voor cardiale differentiatie is de initiële zaaidich...

De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne cardiovasculaire geneeskunde1,2. Menselijke iPSC's zijn in staat om zichzelf te vernieuwen en alle celtypen in het hart te genereren, inclusief cardiomyocyten, endotheelcellen, gladde spiercellen en hartfibroblasten. Patiënt iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) kunnen dienen als onbepaalde bronnen voor het modelleren van genetisch overerfbare hart- en vaatziekten (CVD's) en het testen van de cardiale veiligheid voor nieuwe geneesmiddelen3. In het bijzonder zijn patiënt iPSC-CMs goed voorbereid om genetische en moleculaire etiologieën van CVD's te onderzoeken die zijn afgeleid van defecten in cardiomyocyten, zoals lang QT-syndroom4 en gedilateerde cardiomyopathie (DCM)5. In combinatie met CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking hebben patiënt-iPSC-CM's een ongekende weg geopend om de complexe genetische basis van CVD's te begrijpen, waaronder aangeboren hartafwijkingen (CHD's)6,7,8. Menselijke iPSC-CM's hebben ook mogelijkheden getoond om te dienen als autologe celbronnen voor het aanvullen van het beschadigde myocard tijdens een hartaanval9. In de afgelopen jaren is het van het grootste belang geworden om hoogwaardige menselijke iPSC-CMs te genereren met gedefinieerde subtypen (atriale, ventriculaire en nodale) voor hartregeneratie en geneesmiddelentests10.
Cardiale differentiatie van menselijke iPSC's is het afgelopen decennium sterk verbeterd. Differentiatiemethoden zijn gegaan van op embryoïde lichamen (EB) gebaseerde spontane differentiatie naar chemisch gedefinieerde en gerichte cardiale differentiatie11. Belangrijke signaalmoleculen die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling, zoals Wnt, BMP, Nodal en FGF, worden gemanipuleerd om de differentiatie van cardiomyocyten van menselijke iPSC's10,12te verbeteren. Belangrijke vooruitgang omvat sequentiële modulatie van Wnt-signalering (activering gevolgd door remming) voor robuuste generatie van cardiomyocyten uit menselijke iPSC's13,14. Chemisch gedefinieerde hartdifferentiatierecepten zijn onderzocht om grootschalige productie van kloppende cardiomyocyten15,16tevergemakkelijken, die het potentieel hebben om te worden opgewaardeerd tot productie op industrieel en klinisch niveau. Bovendien wordt een robuuste uitbreiding van vroege menselijke iPSC-CM's bereikt door blootstelling aan constitutieve Wnt-activering met behulp van een kleine chemische stof (CHIR99021)17. Meest recent worden subtypespecifieke cardiomyocyten gegenereerd door manipulatie van retinoïnezuur (RA) en Wnt-signaalroutes bij specifieke differentiatievensters tijdens cardiomyocytenlijnverbintenis van menselijke iPSC's18,19,20,21,22.
In dit protocol beschrijven we een werkprocedure voor robuuste generatie en proliferatie van menselijke CM's afkomstig van perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten. We presenteren protocollen voor 1) het herprogrammeren van menselijke PBMC's naar iPSC's, 2) robuuste generatie van kloppende cardiomyocyten van menselijke iPSC's, 3) snelle uitbreiding van vroege iPSC-CMs, 4) moleculaire karakterisering van menselijke iPSC-CMs, en 5) elektrofysiologische meting van menselijke iPSC-CMs op het niveau van eencellige door patchklem. Dit protocol omvat de gedetailleerde experimentele procedures voor het omzetten van bloedcellen van patiënten in kloppende cardiomyocyten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microelectrode Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>362753</td>
			<td>Blood cell separation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Sendai virus reprogramming kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1200B</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050</td>
			<td>RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>E8 media for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Snythesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 7.0</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology data acquisition &#38; analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EPO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FLT3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639011</td>
			<td>PBMC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444964</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217703</td>
			<td>CM dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>iPSC dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells

Het genereren van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit een enkele bloedafname heeft enorme belangstelling getrokken voor precisiegeneeskunde bij hart- en vaatziekten. Cardiale differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) wordt gemoduleerd door gedefinieerde signaalroutes die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling. Talrijke cardiale differentiatiemethoden op 2D- en 3D-platforms zijn ontwikkeld met verschillende efficiënties en cardiomyocytenopbrengst. Dit heeft onderzoekers buiten het veld verbaasd, omdat de verscheidenheid van deze methoden moeilijk te volgen kan zijn. Hier presenteren we een uitgebreid protocol dat robuuste generatie en uitbreiding van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uitwerkt. We beschrijven eerst een zeer efficiënt iPSC-herprogrammeringsprotocol van het bloedmonster van een patiënt met behulp van niet-geïntegreerde Sendai-virusvectoren. Vervolgens beschrijven we een kleine molecuul-gemedieerde monolaagdifferentiatiemethode die robuust kloppende cardiomyocyten kan produceren uit de meeste menselijke iPSC-lijnen. Daarnaast wordt een schaalbaar cardiomyocytenuitbreidingsprotocol geïntroduceerd met behulp van een klein molecuul (CHIR99021) dat patiënt-afgeleide cardiomyocyten snel kan uitbreiden voor industriële en klinische toepassingen. Aan het einde worden gedetailleerde protocollen voor moleculaire identificatie en elektrofysiologische karakterisering van deze iPSC-CM's weergegeven. We verwachten dat dit protocol pragmatisch is voor beginners met beperkte kennis over cardiovasculaire ontwikkeling en stamcelbiologie.

Menselijke iPSC-herprogrammering van PBMC's Na prekweek met Complete Blood Media gedurende 7 dagen worden PBMC's groot met zichtbare kernen en cytoplasma(figuur 1B),wat aangeeft dat ze klaar zijn voor virustransfectie. Na transfectie met de sendai virus herprogrammeringsfactoren, zullen PBMC's nog een week een epigenetisch herprogrammeringsproces ondergaan. Meestal krijgen we 30-50 iPSC-kolonies van de transfectie van 1 x 105 PB...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Dit zijn uitgebreide protocolfaciliteiten, ruwe stimuleert de generatie en het gebruik van pouncing van patiëntspecifieke culturen uit perifere mononucleaire bloedcellen. Deze tactiek is reproduceerbaar en gemakkelijk te volgen, speciaal voor beginners. En niet nodig, speciaal expertiseren in stamcel ballads, of cardiovasculaire geneeskunde.Ons protocol kan worden gebruikt om patiëntspecifieke cardiomyocyten te genereren uit een enkele bloedafname die kan worden gebruikt voor het modelleren van hart- en vaatziekten en het testen van de cardiale toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Dit protocol vereist een lange tijd inzet voor het behoud van stamcelherprogrammering en gerichte differentiatie. Je waardeert je inspanningen echter echt.Wanneer je kloppende cardiomyocyten in het gerecht ziet. Wanneer de menselijke iPSC-kolonies meer dan 90% confluentie bereiken, spoelt u elke put met drie milliliter DPBS voordat u de cellen behandelt met één milliliter van 0,5 millimolaire EDTA in DPBS per put bij 37 graden Celsius. Voeg na vijf tot acht minuten een milliliter iPSC-passageermedium toe aan elke put en maak de cellen handmatig los.Breng 600 tot 900 microliter van de cellen over naar individuele Putten hebben een keldermembraan gecoat met zes putplaten voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verfris vervolgens de culturen met twee milliliter compleet E8-medium elke dag gedurende drie tot vier dagen. Wanneer de cultuur samenvloeiing heeft bereikt, vervangt u het medium door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatiemedium, twee per put.Vervang op dag twee de supernatanten door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium één. Vervang op dag drie de supernatanten door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatiemedium drie. Op dag vijf.Vervang het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium één. Vervang op dag zeven tot en met 10 het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium vier. Op dag 11 en 13.Wanneer samentrekkende cellen worden waargenomen, vervangt u het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatiemedium vijf. Op dag 15, 17, 19 en 21. Vervang het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium vier.Na prekweek met volledig bloedmedium per zeven dagen worden PBMC's groot met zichtbare kernen en cytoplasma die aangeven dat ze klaar zijn voor transfectie met Sendai Virus herprogrammeringsfactoren. Bij introductie tot complete E8 medium. De volledig geherprogrammeerde cellen zullen zich hechten en kolonies gaan vormen.Na vier tot vijf passages zullen zeer zuivere iPSC-kolonies zich vormen uit de geherprogrammeerde cellen met zeer weinig gedifferentieerde cellen waargenomen. In dit stadium zijn de meeste cellen OCT4- en NANOG-positief indicatief voor hun pluripotentie. Kloppende cardiomyocyten worden meestal waargenomen na 12 dagen differentiatie.Na glucose-uithongering en het afstoten van iPSC vertonen cardiomyocyten, spontane slagen en een uitgelijnde sarcomeerstructuur met geïncaleerde cardiale troponine T- en alfa-actinine-expressie. De kolonies behouden hun zuiverheid zoals blijkt uit hun Troponin T-expressie. Hoewel iPSC-cardiomyocyten relatief onvolgroeid zijn in vergelijking met volwassen cardiomyocyten.Ze demonstreren ventriculaire en atriale achtige actiepotentialen zoals gemeten door groothandel patch, klem. Ventriculaire cardiomyocyten drukken myosine lichte keten twee uit, terwijl atriale iPSC-cardiomyocyten worden gekenmerkt door NR2F2-expressie. Wnt-activering stimuleert de celdeling en bevordert de expressie van celcyclusregulatoren.Interessant is dat Wnt-activering ook de robuuste proliferatie van vroege iPSC-cardiomyocyten induceert voor twee passages in vergelijking met controles, hoewel dit proliferatieve vermogen in de loop van de tijd afneemt. Zorg ervoor dat de PBMS worden vergroot met het heldere nucleaire en cytoplasma voordat de iPSC-herprogrammeringsvectoren worden geïntroduceerd, aangezien de toestand van de PBM's van cruciaal belang is voor iPSC-herprogrammering. Patiëntspecifieke cardiomyocyten zijn waardevol voor het modelleren van hart- en vaatziekten in vitro en voor het leveren van een heleboel donorcellen voor hartstamceltherapie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...