Name: generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקאית ללב (AHA) קריירה פיתוח פרס 18CDA34110293 (M-T.Z.), מיזמים נוספים AVIF ו- SVRF פרסים (M-T.Z.), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH / NHLBI) מענקים 1R01HL124245, 1R01HL132520 ו R01HL096962 (I.D.). ד"ר מינג-טאו זאו נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ ממכון המחקר אביגיל וקסנר בבית החולים הלאומי לילדים.

הפרוטוקולים הניסיוניים וההסכמה מדעת לנבדקים אנושיים אושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית (IRB) בבית החולים הלאומי לילדים.
1. הכנת מדיה, פתרונות וריאגנטים של תרבות התאים
<ol><li>הכנת מדיית PBMC<ol>
<li>לערבב 20 מ"ל של מדיה תרבות PBMC בזאלי (1x) ו 0.52 מ"ל של תוספת. הוסף 20 μL של SCF ו FLT3 כל אחד (ריכוז מל?...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Hinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin+mutations+in+iPS+cells+define+sarcomere+insufficiency+as+a+cause+of+dilated+cardiomyopathy.">Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy.</a> Science. 349 (6251), 982-986 (2015).</li><li>Deacon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+interactions+of+genetic+variants+in+human+cardiomyopathy.">Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).</li><li>Gifford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligogenic+inheritance+of+a+human+heart+disease+involving+a+genetic+modifier.">Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier.</a> Science. 364 (6443), 865-870 (2019).</li><li>Lo Sardo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+role+of+the+most+impactful+cardiovascular+risk+locus+through+haplotype+editing.">Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing.</a> Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+cardiomyocytes+for+precision+medicine:+where+are+we+now.">Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now.</a> Stem Cells. 38, 822-833 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells:+from+developmental+biology+to+therapeutic+applications.">Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Zhao, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+resemblance+of+differentiated+cells+derived+from+isogenic+human+iPSCs+and+SCNT-derived+ESCs.">Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined,+albumin-free+human+cardiomyocyte+generation.">Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation.</a> Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+ipsc-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+develop+from+distinct+mesoderm+populations.">Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+promotes+pacemaker+cell+specification+of+cardiac+mesodermal+cells+derived+from+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt5b+signaling+directs+outlying+Nkx2.5++mesoderm+into+pacemaker+cardiomyocytes.">Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes.</a> Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+atrial+and+ventricular+myocytes+from+human+embryonic+stem+cells+by+alternating+retinoid+signals.">Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals.</a> Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).</li><li>Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banking+human+induced+pluripotent+stem+cells:+lessons+learned+from+embryonic+stem+cells.">Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+notch+signaling+promotes+cardiomyocyte+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+heart+through+Wnt+pathway+antagonism.">Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism.</a> Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).</li><li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+cardiac+growth+and+size.">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).</li><li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes.">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li><li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes.">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li></ol>

במהלך תכנות מחדש של IPSC, זה קריטי לתרבות PBMCs במשך שבוע אחד עד שהם מוגדלים עם גרעינים ברורים ציטופלסמה. מאחר שמחשבי PBMCs אינם מתרבים, מספר תא מתאים עבור התמרה ויראלית חשוב לתכנות מחדש מוצלח של iPSC. מספר התא של מחשבים אישיים, ריבוי של זיהום (MOI) ו titer של וירוס צריך להיחשב ולהתאים כדי להגיע לתוצאות הת...

גילוי תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים על ידי האדם חולל מהפכה ברפואת הלב וכלי הדם המודרנית1,2. IPSCs אנושיים מסוגלים לחדש את עצמם וליצור את כל סוגי התאים בלב, כולל cardiomyocytes, תאי אנדותל, תאי שריר חלקים פיברובלסטים לב. קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC (iPSC-CMs) יכולים לשמש כמשאבים בלתי מוגבלים למידול מחלות לב וכלי דם תורשתיות גנטית (CVDs) ובדיקת בטיחות הלב לתרופות חדשות3. בפרט, iPSC-CMs המטופל צפויים היטב לחקור אטיולוגיות גנטיות ומולקולריות של קורות חיים שמקורם פגמים cardiomyocytes, כגון תסמונת QT ארוכה4 וקרדיומיופתיה המופרדת (DCM)5. בשילוב עם עריכת הגנום בתיווך CRISPR/Cas9, IPSC-CMs המטופל פתחו שדרה חסרת תקדים כדי להבין את הבסיס הגנטי המורכב של תקליטורי CVD כולל מומים מולדים בלב (CHDs)6,7,8. IPSC-CMs אנושיים הציגו גם פוטנציאל לשמש כמקורות תאים אוטולוגיים לחידוש שריר הלב הפגוע במהלך התקף לב9. בשנים האחרונות, זה הפך להיות בעל חשיבות עליונה כדי ליצור iPSC-CMs אנושי באיכות גבוהה עם תת סוגים מוגדרים (פרזדורים, חדרית ונודאל) עבור התחדשות הלב ובדיקות סמים10.
הבחנה לבבית מ- IPSCs אנושית התקדמה מאוד בעשור האחרון. שיטות בידול עברו מהבחנה ספונטנית מבוססת גוף עוברית (EB) לבידול לבבי מוגדר ומכוון כימית11. מולקולות איתות מרכזיות החיוניות להתפתחות הלב העוברי, כגון Wnt, BMP, Nodal ו- FGF מופעלות כדי לשפר את הבידול הקרדיומיוציטים מ- iPSCs אנושי10,12. התקדמות משמעותית כוללת אפנון רציף של איתות Wnt (הפעלה ואחריו עיכוב) עבור דור חזק של cardiomyocytes מ IPSCs אנושי13,14. מתכונים לביולוגיה מוגדרים כימית נחקרו כדי להקל על ייצור בקנה מידה גדול של להכות cardiomyocytes15,16, אשר יש פוטנציאל להיות משודרג לייצור ברמה תעשייתית וקלינית. יתר על כן, הרחבה חזקה של iPSC-CMs אנושי מוקדם מושגת על ידי חשיפה להפעלת Wnt המרכיבה באמצעות כימי קטן (CHIR99021)17. לאחרונה, קרדיומיוציטים ספציפיים תת-סוג נוצרים באמצעות מניפולציה של חומצה רטינואית (RA) ו Wnt איתות מסלולים בחלונות בידול ספציפיים במהלךמחויבות שושלתקרדיומיוציטים מ- iPSCs אנושי 18,19,20,21,22.
בפרוטוקול זה, אנו מפרטים הליך עבודה לייצור חזק והתפשטות של CMs אנושי שמקורו בתאים מונונוקלאריים של דם היקפי של מטופל. אנו מציגים פרוטוקולים עבור 1) תכנות מחדש של מחשבים אישיים אנושיים ל- iPSCs, 2) דור חזק של קרדיומיוציטים מכים מ- iPSCs אנושיים, 3) התרחבות מהירה של IPSC-CMs מוקדמים, 4) אפיון מולקולרי של IPSC-CMs אנושיים, ו -5) מדידה אלקטרופיזיולוגית של iPSC-CMs אנושיים ברמת התא הבודד על ידי מהדק תיקון. פרוטוקול זה מכסה את ההליכים הניסיוניים המפורטים על המרת תאי דם של מטופלים להכות cardiomyocytes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microelectrode Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>362753</td>
			<td>Blood cell separation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Sendai virus reprogramming kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1200B</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050</td>
			<td>RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>E8 media for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Snythesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 7.0</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology data acquisition &#38; analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EPO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FLT3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639011</td>
			<td>PBMC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444964</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217703</td>
			<td>CM dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>iPSC dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells

יצירת קרדיומיוציטים ספציפיים למטופלים מהגרלת דם אחת משכה עניין עצום ברפואה מדויקת על מחלות לב וכלי דם. הבחנה לבבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (iPSCs) מווסתתת על ידי מסלולי איתות מוגדרים החיוניים להתפתחות הלב העוברי. שיטות שונות לבידול לב על פלטפורמות 2-D ו 3-D פותחו עם יעילות שונים ותפוקת cardiomyocyte. זה יש חוקרים תמוהים מחוץ לתחום כמו מגוון של שיטות אלה יכול להיות קשה לעקוב. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף המפרט ייצור חזק והרחבה של קרדיומיוציטים ספציפיים למטופל מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs). ראשית אנו מתארים פרוטוקול תכנות מחדש IPSC יעילות גבוהה מדגימת הדם של המטופל באמצעות וקטורים וירוס סנדאי ללא שילוב. לאחר מכן אנו מפרטים שיטת בידול מונו-שכבתית קטנה בתיווך מולקולה שיכולה לייצר קרדיומיוציטים מכים מרוב קווי ה- iPSC האנושיים. בנוסף, פרוטוקול הרחבת קרדיומיוציטים מדרגי מוצג באמצעות מולקולה קטנה (CHIR99021) שיכולה להרחיב במהירות קרדיומיוציטים שמקורם בחולים עבור יישומים ברמה תעשייתית וקלינית. בסוף, פרוטוקולים מפורטים לזיהוי מולקולרי ואפיון אלקטרופיזיולוגי של iPSC-CMs אלה מתוארים. אנו מצפים פרוטוקול זה להיות פרגמטי למתחילים עם ידע מוגבל על התפתחות הלב וכלי הדם וביולוגיה של תאי גזע.

תכנות מחדש של IPSC אנושי ממחשבים אישיים לאחר טרום-תרבות עם מדיית דם מלאה במשך 7 ימים, מחשבים אישיים הופכים גדולים עם גרעינים גלויים וציטופלסמה (איור 1B), המציין שהם מוכנים להדבקת וירוסים. לאחר טרנספקט עם גורמי תכנות מחדש של וירוס סנדאי, מחשבי PBMCs יעב...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור ולהרחיב בחוזקה קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים.

ייצור והרחבה של קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

זהו מתקני פרוטוקול מקיפים, ייצור מגביר גלם, ולהשתמש בהסתערות של מטופל ספציפי, תרבויות מתאי דם מונונוקלאריים היקפיים. טקטיקות אלה ניתנות לשחזור וקל לעקוב אחריהן, במיוחד למתחילים. ואל תדרוש, מומחיות מיוחדת בבלדות תאי גזע, או רפואת לב וכלי דם.הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי ליצור קרדיומיוציטים ספציפיים למטופלים מתוך בדיקת דם אחת שניתן להשתמש בהן למידול מחלות לב וכלי דם ובדיקת רעילות הלב של תרופות חדשניות. פרוטוקול זה דורש מחויבות ארוכת שנים לתכנות מחדש של תאי גזע לתחזוקה ובידול מכוון. עם זאת, אתה באמת מעריך את המאמצים שלך.כאשר אתה רואה להכות קרדיומיוציטים בצלחת. כאשר מושבות IPSC האנושיות מגיעות ליותר מ-90% השפעה, יש לשטוף כל אחת מהבאר בשלושה מיליליטר של DPBS לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של 0.5 מילימטר EDTA ב- DPBS לבאר ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש עד שמונה דקות, להוסיף מיליליטר אחד של iPSC עובר מדיום לכל באר באופן ידני להסיר את התאים.העבר 600 עד 900 מיקרוליטרים של התאים לבארות בודדות יש קרום מרתף מצופה שש צלחת באר עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ואז לרענן את התרבויות עם שני מיליליטר של מדיום E8 מלא כל יום במשך שלושה עד ארבעה ימים. כאשר התרבות הגיעה למפגש, החליפו את המדיום בשני מיליליטרים של מדיום בידול קרדיומיוצייט, שניים לבאר.ביום השני, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני אחד. ביום השלישי, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני שלוש. ביום החמישי.החלף את supernatant עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני אחד. ביום השביעי עד העשירי, החלף את הסופר-נט בשני מיליליטר של בידול קרדיומיוצייט בינוני ארבע. בימים 11 ו-13.כאשר תאים מתכווצים נצפים, להחליף את supernatant עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני חמש. בימים 15, 17, 19 ו-21. החלף את supernatant עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני ארבע.לאחר טרום-תרבות עם מדיום דם מלא לשבעה ימים, PBMC של להיות גדול עם גרעינים גלויים ציטופלסמה המציין כי הם מוכנים transfection עם וירוס סנדאי תכנות גורמים תכנות מחדש. עם היכרות עם מדיום E8 מלא. התאים המתוכנתים מחדש לחלוטין יתחברו ויתחילו ליצור מושבות.לאחר ארבעה עד חמישה מעברים, מושבות IPSC טהורות מאוד ייווצרו מהתאים המתוכנתים מחדש עם מעט מאוד תאים מובחנים שנצפו. בשלב זה, רוב התאים הם OCT4 ו NANOG חיובי מעיד על pluripoteny שלהם. להכות קרדיומיוציטים נצפים בדרך כלל לאחר 12 ימים של בידול.לאחר רעב גלוקוז, ותערוכות iPSC cardiomyocytes תערוכות, מכות ספונטניות, ומבנה סרקומר מיושר עם טרופונין לב משולב T וביטוי אלפא אקטינין. המושבות שומרות על טוהרן כפי שמעיד ביטוי טרופונין טי שלהן. למרות iPSC cardiomyocytes הם יחסית לא בוגרים בהשוואה cardiomyocytes למבוגרים.הם מדגימים פוטנציאל פעולה חדרית ואירוזים כפי שהם נמדדים על ידי תיקון סיטונאי, מהדק. קרדיומיוציטים חדריים מבטאים שרשרת אור מיוסין 2, ואילו קרדיומיוציטים iPSC מפרזדורים מסומנים על ידי ביטוי NR2F2. הפעלת Wnt מעוררת חלוקת תאים ומקדמת את הביטוי של רגולטורים של מחזור התא.מעניין, הפעלת Wnt גם מעוררת את ההתפשטות החזקה של cardiomyocytes iPSC מוקדם עבור שני קטעים לעומת פקדים, אם כי יכולת שגשוג זה פוחתת עם הזמן. ודא כי PBMS מוגדלים עם גרעין ברור ציטופלסמה לפני וקטורים תכנות iPSC מוצגים כמו המצב של PBMs הוא קריטי עבור תכנות מחדש IPSC. קרדיומיוציטים ספציפיים למטופל הם בעלי ערך למידול מחלות לב וכלי דם במבחנה ולספק המון תאים תורמים לטיפול בתאי גזע לבביים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...