Name: generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00
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Questo studio è stato supportato dall'American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) sovvenzioni 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Il Dr. Ming-Tao Zhao è stato anche supportato da fondi di avvio dell'Abigail Wexner Research Institute presso il Nationwide Children's Hospital.

I protocolli sperimentali e il consenso informato per i soggetti umani sono stati approvati dall'Institutional Review Board (IRB) presso il Nationwide Children's Hospital.
1. Preparazione di terreni di coltura cellulare, soluzioni e reagenti
<ol><li>Preparare i supporti PBMC<ol>
<li>Mescolare 20 mL di terreno di coltura PBMC basale (1x) e 0,52 mL di integratore. Aggiungere 20 μL di SCF e FLT3 ciascuno (concentrazione di stock: 100 μg/mL), 4 μL di IL3, IL6 ed EPO ciascuno (concentrazione d...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Hinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin+mutations+in+iPS+cells+define+sarcomere+insufficiency+as+a+cause+of+dilated+cardiomyopathy.">Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy.</a> Science. 349 (6251), 982-986 (2015).</li><li>Deacon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+interactions+of+genetic+variants+in+human+cardiomyopathy.">Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).</li><li>Gifford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligogenic+inheritance+of+a+human+heart+disease+involving+a+genetic+modifier.">Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier.</a> Science. 364 (6443), 865-870 (2019).</li><li>Lo Sardo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+role+of+the+most+impactful+cardiovascular+risk+locus+through+haplotype+editing.">Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing.</a> Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+cardiomyocytes+for+precision+medicine:+where+are+we+now.">Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now.</a> Stem Cells. 38, 822-833 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells:+from+developmental+biology+to+therapeutic+applications.">Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Zhao, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+resemblance+of+differentiated+cells+derived+from+isogenic+human+iPSCs+and+SCNT-derived+ESCs.">Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined,+albumin-free+human+cardiomyocyte+generation.">Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation.</a> Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+ipsc-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+develop+from+distinct+mesoderm+populations.">Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+promotes+pacemaker+cell+specification+of+cardiac+mesodermal+cells+derived+from+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt5b+signaling+directs+outlying+Nkx2.5++mesoderm+into+pacemaker+cardiomyocytes.">Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes.</a> Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+atrial+and+ventricular+myocytes+from+human+embryonic+stem+cells+by+alternating+retinoid+signals.">Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals.</a> Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).</li><li>Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banking+human+induced+pluripotent+stem+cells:+lessons+learned+from+embryonic+stem+cells.">Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+notch+signaling+promotes+cardiomyocyte+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+heart+through+Wnt+pathway+antagonism.">Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism.</a> Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).</li><li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+cardiac+growth+and+size.">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).</li><li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes.">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li><li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes.">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li></ol>

Durante la riprogrammazione iPSC, è fondamentale coltivare PBMC per 1 settimana fino a quando non vengono ingranditi con nuclei chiari e citoplasma. Poiché i PBMC non proliferano, un numero di cellule appropriato per la trasduzione virale è importante per una riprogrammazione iPSC di successo. Il numero di cellule pbMC, la molteplicità dell'infezione (MOI) e il titolo del virus devono essere considerati e regolati per raggiungere i risultati di trasduzione ottimali. Per la differenziazione cardiaca, la densità inizi...

La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo ha rivoluzionato la moderna medicina cardiovascolare1,2. Le iPSC umane sono in grado di auto-rinnovarsi e generare tutti i tipi di cellule nel cuore, compresi cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e fibroblasti cardiaci. I cardiomiociti derivati da iPSC del paziente (iPSC-CM) possono servire come risorse indefinite per modellare le malattie cardiovascolari geneticamente ereditabili (CVD) e testare la sicurezza cardiaca per i nuovi farmaci3. In particolare, i pazienti iPSC-CM sono ben pronti a studiare le eziologie genetiche e molecolari delle CVD derivate da difetti nei cardiomiociti, come la sindrome del QT lungo4 e la cardiomiopatia dilatativa (DCM)5. In combinazione con l'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9, i CM iPSC dei pazienti hanno aperto una strada senza precedenti per comprendere le complesse basi genetiche delle CVD, compresi i difetti cardiaci congeniti (CHD)6,7,8. Gli iPSC-CM umani hanno anche mostrato potenziali per servire come fonti cellulari autologhe per reintegrare il miocardio danneggiato durante un infarto9. Negli ultimi anni, è diventato fondamentale generare iPSC-CM umani di alta qualità con sottotipi definiti (atriale, ventricolare e nodale) per la rigenerazione cardiaca e test antidroga10.
La differenziazione cardiaca dalle iPSC umane è stata notevolmente avanzata negli ultimi dieci anni. I metodi di differenziazione sono passati dalla differenziazione spontanea basata sul corpo embrioide (EB) alla differenziazione cardiaca chimicamente definita e diretta11. Le molecole di segnalazione chiave essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale, come Wnt, BMP, Nodal e FGF sono manipolate per migliorare la differenziazione dei cardiomiociti dalle iPSC umane10,12. Progressi significativi includono la modulazione sequenziale della segnalazione Wnt (attivazione seguita da inibizione) per una robusta generazione di cardiomiociti da iPSC umane13,14. Sono state esplorate ricette di differenziazione cardiaca chimicamente definite per facilitare la produzione su larga scala di cardiomiociti battenti15,16, che hanno il potenziale per essere aggiornati alla produzione a livello industriale e clinico. Inoltre, una robusta espansione delle iPSC-CM umane precoci si ottiene mediante l'esposizione all'attivazione costitutiva di Wnt utilizzando una piccola sostanza chimica (CHIR99021)17. Più recentemente, i cardiomiociti specifici del sottotipo sono generati attraverso la manipolazione delle vie di segnalazione dell'acido retinoico (RA) e Wnt in specifiche finestre di differenziazione durante l'impegno del lignaggio dei cardiomiociti dalle iPSC umane18,19,20,21,22.
In questo protocollo, descriviamo in dettaglio una procedura di lavoro per la generazione e la proliferazione robuste di CM umane provenienti da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente. Presentiamo protocolli per 1) riprogrammazione di PBMC umani in iPSC, 2) robusta generazione di cardiomiociti battenti da iPSC umane, 3) rapida espansione dei primi iPSC-CM, 4) caratterizzazione molecolare di iPSC-CM umani e 5) misurazione elettrofisiologica di iPSC-CM umani a livello di singola cellula mediante patch clamp. Questo protocollo copre le procedure sperimentali dettagliate sulla conversione delle cellule del sangue del paziente in cardiomiociti pulsanti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microelectrode Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>362753</td>
			<td>Blood cell separation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Sendai virus reprogramming kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1200B</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050</td>
			<td>RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>E8 media for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Snythesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 7.0</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology data acquisition &#38; analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EPO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FLT3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639011</td>
			<td>PBMC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444964</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217703</td>
			<td>CM dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>iPSC dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells

La generazione di cardiomiociti specifici del paziente da un singolo prelievo di sangue ha attirato un enorme interesse per la medicina di precisione sulle malattie cardiovascolari. La differenziazione cardiaca dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) è modulata da percorsi di segnalazione definiti che sono essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale. Numerosi metodi di differenziazione cardiaca su piattaforme 2D e 3D sono stati sviluppati con varie efficienze e resa cardiomiocitaria. Ciò ha sconcertato gli investigatori al di fuori del campo in quanto la varietà di questi metodi può essere difficile da seguire. Qui presentiamo un protocollo completo che elabora una robusta generazione ed espansione di cardiomiociti specifici del paziente da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Per prima cosa descriviamo un protocollo di riprogrammazione iPSC ad alta efficienza dal campione di sangue di un paziente utilizzando vettori di virus Sendai non integrati. Quindi descriviamo in dettaglio un piccolo metodo di differenziazione monostrato mediato da molecole che può produrre in modo robusto cardiomiociti battenti dalla maggior parte delle linee iPSC umane. Inoltre, viene introdotto un protocollo di espansione dei cardiomiociti scalabile utilizzando una piccola molecola (CHIR99021) che potrebbe espandere rapidamente i cardiomiociti derivati dal paziente per applicazioni di livello industriale e clinico. Alla fine, vengono illustrati protocolli dettagliati per l'identificazione molecolare e la caratterizzazione elettrofisiologica di questi iPSC-CM. Ci aspettiamo che questo protocollo sia pragmatico per i principianti con conoscenze limitate sullo sviluppo cardiovascolare e sulla biologia delle cellule staminali.

Riprogrammazione iPSC umana da PBMC Dopo la pre-coltura con Complete Blood Media per 7 giorni, le PBMC diventano grandi con nuclei visibili e citoplasma (Figura 1B), indicando che sono pronte per la trasfezione del virus. Dopo la trasfezione con i fattori di riprogrammazione del virus Sendai, i PBMC saranno sottoposti a un processo di riprogrammazione epigenetica per un'altra settimana. In genere, otteniamo 30-50 colonie di iPSC dalla tras...

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Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.

Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Si tratta di strutture di protocollo complete, generazione di boost grezzi e utilizzo di colture specifiche per il paziente da cellule mononucleate del sangue periferico. Queste tattiche sono riproducibili e facili da seguire, specialmente per i principianti. E non richiedere, esperti speciali in ballate di cellule staminali o medicina cardiovascolare.Il nostro protocollo può essere utilizzato per generare cardiomiociti specifici del paziente da un singolo prelievo di sangue che può essere utilizzato per modellare le malattie cardiovascolari e testare la tossicità cardiaca di nuovi farmaci. Questo protocollo richiede un impegno a lungo termine per la riprogrammazione delle cellule staminali e la differenziazione diretta. Tuttavia, apprezzi davvero i tuoi sforzi.Quando vedi battere i cardiomiociti nel piatto. Quando le colonie umane di iPSC raggiungono oltre il 90% di confluenza, sciacquare ogni pozzetto con tre millilitri di DPBS prima di trattare le cellule con un millilitro di 0,5 millimolari EDTA in DPBS per pozzetto a 37 gradi Celsius. Dopo cinque-otto minuti, aggiungere un millilitro di mezzo di passaggio iPSC a ciascun pozzetto e rimuovere manualmente le cellule.Trasferire da 600 a 900 microlitri delle cellule ai singoli pozzi hanno una membrana basale rivestita con una piastra a sei pozzi per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi rinfrescare le colture con due millilitri di E8 medio completo ogni giorno per tre o quattro giorni. Quando la coltura ha raggiunto la confluenza, sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti, due per pozzetto.Il secondo giorno, sostituire i supernatanti con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti uno. Il terzo giorno, sostituire i supernatanti con due millilitri di differenziazione dei cardiomiociti mezzo tre. Il quinto giorno.Sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti uno. Dal settimo al 10° giorno, sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti quattro. Nei giorni 11 e 13.Quando si osservano cellule contraenti, sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti cinque. Nei giorni 15, 17, 19 e 21. Sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti quattro.Dopo la pre-coltura con mezzo sanguigno completo per sette giorni, i PBMC diventano grandi con nuclei visibili e citoplasma che indicano che sono pronti per la trasfezione con fattori di riprogrammazione del virus Sendai. All'introduzione per completare il mezzo E8. Le cellule completamente riprogrammate si attaccheranno e inizieranno a formare colonie.Dopo quattro o cinque passaggi, colonie di iPSC altamente pure si formeranno dalle cellule riprogrammate con pochissime cellule differenziate osservate. In questa fase, la maggior parte delle cellule sono OCT4 e NANOG positive indicative della loro pluripotenia. Battere i cardiomiociti sono di solito osservati dopo 12 giorni di differenziazione.Dopo la fame di glucosio e la ripabulizzazione dei cardiomiociti iPSC mostrano, battito spontaneo e una struttura sarcomere allineata con troponina cardiaca intercalata T e espressione alfa actinina. Le colonie mantengono la loro purezza, come dimostra la loro espressione di troponina T. Sebbene i cardiomiociti iPSC siano relativamente immaturi rispetto ai cardiomiociti adulti.Dimostrano potenziali d'azione ventricolari e atriali misurati da cerotto all'ingrosso, morsetto. I cardiomiociti ventricolari esprimono la catena leggera di miosina due, mentre i cardiomiociti iPSC atriali sono marcati dall'espressione di NR2F2. L'attivazione di Wnt stimola la divisione cellulare e promuove l'espressione dei regolatori del ciclo cellulare.È interessante notare che l'attivazione di Wnt induce anche la robusta proliferazione dei cardiomiociti iPSC precoci per due passaggi rispetto ai controlli, sebbene questa capacità proliferativa diminuisca nel tempo. Assicurarsi che i PBMS siano ingranditi con il nucleare chiaro e il citoplasma prima che vengano introdotti i vettori di riprogrammazione iPSC poiché la condizione dei PBM è fondamentale per la riprogrammazione iPSC. I cardiomiociti specifici del paziente sono preziosi per modellare le malattie cardiovascolari in vitro e per fornire una tonnellata di cellule donatrici per la terapia con cellule staminali cardiache.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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