Name: generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

이 연구는 미국 심장 협회 (AHA) 경력 개발 상 18CDA34110293 (M-T.Z.), 추가 벤처 AVIF 및 SVRF 상 (M-T.Z.), 국립 보건원 (NIH /NHLBI) 보조금 1R01HL1HL13225 (1R01HL132520)에 의해 지원되었다. 밍타오 자오 박사는 전국 아동 병원의 아비가일 벡스너 연구소의 스타트업 기금으로도 지원받았습니다.

인간 과목에 대한 실험 프로토콜 및 정보에 입각한 동의는 전국 아동 병원의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.
1. 세포 배양 매체, 솔루션 및 시약 의 준비
<ol><li>PBMC 미디어 준비<ol>
<li>기초 PBMC 문화 매체 (1 x)와 0.52 mL의 기초 PBMC 문화 매체의 20 mL을 혼합하십시오. 각각 20μL의 SCF및 FLT3(스톡 농도: 100 μg/mL), IL3, IL6 및 EPO4 μL(재고 농도: 100 μg/mL) 및 L-글루타민 대안(1...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Hinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin+mutations+in+iPS+cells+define+sarcomere+insufficiency+as+a+cause+of+dilated+cardiomyopathy.">Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy.</a> Science. 349 (6251), 982-986 (2015).</li><li>Deacon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+interactions+of+genetic+variants+in+human+cardiomyopathy.">Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).</li><li>Gifford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligogenic+inheritance+of+a+human+heart+disease+involving+a+genetic+modifier.">Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier.</a> Science. 364 (6443), 865-870 (2019).</li><li>Lo Sardo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+role+of+the+most+impactful+cardiovascular+risk+locus+through+haplotype+editing.">Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing.</a> Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+cardiomyocytes+for+precision+medicine:+where+are+we+now.">Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now.</a> Stem Cells. 38, 822-833 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells:+from+developmental+biology+to+therapeutic+applications.">Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Zhao, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+resemblance+of+differentiated+cells+derived+from+isogenic+human+iPSCs+and+SCNT-derived+ESCs.">Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined,+albumin-free+human+cardiomyocyte+generation.">Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation.</a> Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+ipsc-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+develop+from+distinct+mesoderm+populations.">Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+promotes+pacemaker+cell+specification+of+cardiac+mesodermal+cells+derived+from+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt5b+signaling+directs+outlying+Nkx2.5++mesoderm+into+pacemaker+cardiomyocytes.">Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes.</a> Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+atrial+and+ventricular+myocytes+from+human+embryonic+stem+cells+by+alternating+retinoid+signals.">Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals.</a> Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).</li><li>Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banking+human+induced+pluripotent+stem+cells:+lessons+learned+from+embryonic+stem+cells.">Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+notch+signaling+promotes+cardiomyocyte+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+heart+through+Wnt+pathway+antagonism.">Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism.</a> Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).</li><li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+cardiac+growth+and+size.">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).</li><li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes.">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li><li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes.">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li></ol>

iPSC 재프로그래밍 하는 동안, 그들은 명확한 핵과 세포질로 확대 될 때까지 1 주일 동안 PBMC를 배양하는 것이 중요합니다. PBMC가 증식하지 않기 때문에 바이러스 성 트랜스듀션에 적합한 세포 수는 성공적인 iPSC 재프로그래밍에 중요합니다. PBMC의 세포 수, 감염의 복합성 (MOI) 및 바이러스의 titer는 최적의 트랜스유도 결과에 도달하기 위하여 고려되고 조정되어야 합니다. 심장 분화의 경우 초기 시?...

인간 유도 만능 줄기 세포의 발견은 현대 심장 혈관 의학1,2에혁명을 일으켰습니다. 인간 iPSCs는 심근세포, 내피 세포, 매끄러운 근육 세포 및 심장 섬유아세포를 포함하여 심장에 있는 모든 세포 모형을 자기 갱신하고 생성할 수 있습니다. 환자 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)는 유전적으로 상속가능한 심혈관 질환(CVDs)을 모델링하고 신약에 대한 심장 안전성 검사를 위한 무기한 자원역할을 할 수있다. 특히, 환자 iPSC-CM은 긴 QT 증후군4 및 확장된 심근병증(DCM)5와같은 심근세포의 결함에서 파생된 CVD의 유전적 및 분자 병각을 잘 조사할 태세입니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집과 결합된 환자 iPSC-CM은 선천성 심장 결함(CHDs)6,7,8을포함한 CVD의 복잡한 유전적 기초를 이해하는 전례 없는 길을 열었습니다. 인간 iPSC-CM은 또한 심장 마비 도중 손상된 심근을 보충하기 위한 자가 세포 근원역할을 하는 잠재력을 전시했습니다9. 최근에는 심장 재생 및 약물 검사를 위한 정의된 하위 형(심방, 심실 및 노달)을 가진 고품질 인간 iPSC-CM을 생성하는 것이 가장중요해졌습니다.
인간 iPSC에서 심장 분화는 지난 10 년 동안 크게 진보되었습니다. 분화 방법은 배아 체(EB)기반의 자발적 분화에서 화학적으로 정의되고 지시된 심장분화(11)로갔다. Wnt, BMP, Nodal 및 FGF와 같은 배아 심장 발달에 필수적인 주요 신호 분자는 인간 iPSC10,12로부터심근구 분화를 향상시키기 위해 조작된다. 중요한 진보는 인간 iPSCs13,14에서심근세포의 견고한 생성을 위한 Wnt 신호 (억제 에 선행된 활성화)의 순차적변조를포함한다. 화학적으로 정의된 심장 분화 레시피는 산업 및 임상 수준의 생산으로 업그레이드될 가능성이 있는 심근세포15,16을치는 대규모 생산을 용이하게 하기 위해 탐구되었습니다. 더욱이, 초기 인간 iPSC-CM의 강력한 확장은 작은 화학물질(CHIR99021)17을이용하여 구성적인 Wnt 활성화에 노출함으로써 달성된다. 가장 최근에는, 아류형 특이적 심근세포는 인간 iPSC18,19,20,21,22의심근세포 계보 약정 동안 특정 분화 창에서 망막산(RA) 및 Wnt 신호 경로의 조작을 통해 생성된다.
이 프로토콜에서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 유래하는 인간 적인 CM의 견고한 생성 그리고 증식을 위한 작동 절차를 상세히 설명합니다. 우리는 1) 인간 PBMC를 iPSC로 재프로그래밍하는 프로토콜, 2) 인간 iPSC에서 심근세포를 치고, 3) 초기 iPSC-CM의 급속한 확장, 4) 인간 iPSC-CM의 분자 특성화, 및 5) 단일 세포 수준에서 인간 iPSC-CM의 전기 생리학적 측정을 패치 에 의해 제시한다. 이 프로토콜은 환자 혈액 세포를 심장 구균세포를 구타로 변환하는 방법에 대한 상세한 실험 절차를 다룹니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microelectrode Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>362753</td>
			<td>Blood cell separation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Sendai virus reprogramming kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1200B</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050</td>
			<td>RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>E8 media for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Snythesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 7.0</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology data acquisition &#38; analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EPO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FLT3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639011</td>
			<td>PBMC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444964</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217703</td>
			<td>CM dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>iPSC dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells

단일 혈액 무승부에서 환자 특정 심근세포생성은 심혈관 질환에 대한 정밀 의학에 엄청난 관심을 끌고 있습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 심장 분화는 배아 심장 발달에 필수적인 정의된 신호 경로에 의해 변조됩니다. 2D 및 3D 플랫폼에 대한 수많은 심장 분화 방법은 다양한 효율성과 심근세포 수율로 개발되었습니다. 이러한 방법의 다양성은 따라하기 어려울 수 있기 때문에 이것은 필드 외부 의아해 수사관이있다. 여기서 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 환자 특정 심근 세포의 견고한 생성 및 확장을 정교하게 하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 먼저 비통합 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 고효율 iPSC 재프로그래밍 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 대부분의 인간 iPSC 라인에서 박동하는 심근세포를 강력하게 생성할 수 있는 작은 분자 매개 단층 분화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 확장 가능한 심근세포 팽창 프로토콜은 산업 및 임상 등급 응용을 위해 환자 유래 심근세포를 빠르게 확장할 수 있는 작은 분자(CHIR99021)를 사용하여 도입된다. 결국, 이러한 iPSC-CM의 분자 식별 및 전기 생리학적 특성화를 위한 상세한 프로토콜이 묘사된다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 발달과 줄기 세포 생물학에 대한 제한된 지식을 가진 초보자를 위한 실용적일 것으로 기대합니다.

PBMC에서 인간 iPSC 리프로그래밍 7일 동안 완전한 혈액 매체를 통해 사전 배양 후, PBMC는 눈에 보이는 핵과 세포질(도1B)으로커져 바이러스 이식에 대한 준비가 되었음을 나타냅니다. 센다이 바이러스 재프로그래밍 인자와 의전 후, PBMC는 또 다른 주 동안 후생 유전학 재프로그래밍 과정을 받게됩니다. 전형적으로, 우리는 1 x 105 PB...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

이것은 포괄적인 프로토콜 시설, 원시 부스트 생성, 및 말초 혈액 단핵 세포에서 환자 특정, 배양을 두드리는 것을 사용합니다. 이 전술은 재현 가능하고 따르기 쉽습니다. 그리고 줄기 세포 발라드, 또는 심장 혈관 의학에 특별한 전문을 필요로하지 않습니다.우리의 프로토콜은 심혈관 질병을 모델링하고 새로운 약의 심장 독성을 시험하는 데 사용할 수있는 단일 혈액 무승부에서 환자 특정 심근세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 줄기 세포 재프로그래밍 유지 보수 및 지시 된 분화를 위해 오랜 노력을 필요로한다. 그러나, 당신은 정말 당신의 노력을 주셔서 감사합니다.접시에 심장 근세포가 뛰는 것을 볼 때. 인간 iPSC 식민지가 90% 이상의 합류에 도달하면, 37°C에서 DPBS에서 0.5 밀리리터의 1밀리리터로 세포를 치료하기 전에 DPBS의 3밀리리터로 각각 잘 헹구는 다. 5~8분 후에 는 iPSC 통과 매체1밀리리터를 각 웰에 넣고 수동으로 세포를 빼낸다.개별 우물에 세포의 600 ~ 900 마이크로 리터를 전송하는 것은 37 섭씨 와 5 %의 이산화탄소에서 하룻밤 배양을위한 지하 멤브레인 코팅 여섯 우물 플레이트가 있습니다. 그런 다음 3~4일 동안 매일 2밀리리터의 완전한 E8 배지로 문화를 새로 고칩니다. 문화가 합류에 도달하면 배지를 심근 세포 분화 배지의 2 밀리리터로 대체하십시오.둘째 날에는 초중제를 심근세포 분화 배지 1개 2밀리리터로 교체하십시오. 셋째 날에는 초중제를 심근세포 분화 배지 3의 밀리리터 2개로 교체하십시오. 5일째.상체를 심근세포 분화 배지 1의 2밀리리터로 교체하십시오. 7일에서 10일째에, 상체를 심근세포 분화 매체 4의 2밀리리터로 교체하십시오. 11일과 13일.수축 세포가 관찰될 때, 상체를 심근세포 분화 배지 5의 2밀리리터로 교체하십시오. 15일, 17일, 19일, 21일. 상체를 심근세포 분화 매체 4의 2밀리리터로 교체하십시오.7 일 당 완전한 혈액 배지와 사전 배양 후, PBMC의 눈에 보이는 핵과 세포질로 큰 된다 그들은 센다이 바이러스 재프로그래밍 요인으로 트랜스 페트에 대 한 준비가 표시. 소개 시 완전한 E8 매체. 완전히 다시 프로그래밍 된 세포는 식민지를 연결하고 형성하기 시작합니다.4~5개의 구절 후에, 고도로 순수한 iPSC 식민지는 관찰된 아주 몇몇 분화한 세포와 재프로그래밍된 세포에서 형성될 것입니다. 이 단계에서, 세포의 대부분은 OCT4와 NANOG 양성 그들의 pluripoteny의 표시. 심근세포는 보통 12일간의 분화 후에 관찰됩니다.포도당 기아 후, iPSC 심근세포는 상호 작용된 심장 트로포닌 T 및 알파 액틴 발현을 가진 정렬된 사코프레 구조를 나타내고, 자발적인 구타 및 정렬된 사코프레 구조를 나타낸다. 식민지는 트로포닌 T 표현에 의해 입증 된 대로 그들의 순도 유지. iPSC 심근세포는 성인 심근세포에 비해 상대적으로 미숙하지만.그들은 도매 패치, 클램프에 의해 측정된 작업 잠재력과 같은 심실 및 심방적 을 보여줍니다. 심실 심근세포는 MYOSin 광 사슬 2를 표현하는 반면, 심방 iPSC 심근세포는 NR2F2 발현으로 표시됩니다. Wnt 활성화는 세포 분열을 자극하고 세포 주기 조절기의 발현을 촉진합니다.흥미롭게도, Wnt 활성화는 또한 이 증식 능력이 시간이 지남에 따라 감소하더라도, 대조군에 비해 두 개의 통로에 대한 초기 iPSC 심근세포의 강력한 증식을 유도합니다. IPSC 재프로그래밍 벡터가 IPSC 재프로그래밍에 매우 중요하기 때문에 IPSC 재프로그래밍 벡터가 도입되기 전에 PBMS가 명확한 핵 및 세포질로 확대되는지 확인하십시오. 환자 특정 심근세포는 체외에서 심혈관 질환을 모델링하고 심장 줄기 세포 치료를 위한 수많은 기증자 세포를 제공하는 데 유용합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

연구

발생학

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...