Name: generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00
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Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional 18CDA34110293 (M-T.Z.) de la American Heart Association (AHA), los premios AVIF y SVRF de La American Heart Association (M-T.Z.), las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 y R01HL096962 (I.D.). El Dr. Ming-Tao Zhao también recibió el apoyo de fondos iniciales del Instituto de Investigación Abigail Wexner en el Nationwide Children's Hospital.

Los protocolos experimentales y el consentimiento informado para sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en el Nationwide Children's Hospital.
1. Preparación de medios de cultivo celular, soluciones y reactivos
<ol><li>Preparar medios PBMC<ol>
<li>Mezclar 20 ml de medios de cultivo PBMC basales (1x) y 0,52 ml de suplemento. Añadir 20 μL de SCF y FLT3 cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 y EPO cada uno (concentración de s...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Hinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin+mutations+in+iPS+cells+define+sarcomere+insufficiency+as+a+cause+of+dilated+cardiomyopathy.">Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy.</a> Science. 349 (6251), 982-986 (2015).</li><li>Deacon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+interactions+of+genetic+variants+in+human+cardiomyopathy.">Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).</li><li>Gifford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligogenic+inheritance+of+a+human+heart+disease+involving+a+genetic+modifier.">Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier.</a> Science. 364 (6443), 865-870 (2019).</li><li>Lo Sardo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+role+of+the+most+impactful+cardiovascular+risk+locus+through+haplotype+editing.">Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing.</a> Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+cardiomyocytes+for+precision+medicine:+where+are+we+now.">Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now.</a> Stem Cells. 38, 822-833 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells:+from+developmental+biology+to+therapeutic+applications.">Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Zhao, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+resemblance+of+differentiated+cells+derived+from+isogenic+human+iPSCs+and+SCNT-derived+ESCs.">Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined,+albumin-free+human+cardiomyocyte+generation.">Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation.</a> Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+ipsc-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+develop+from+distinct+mesoderm+populations.">Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+promotes+pacemaker+cell+specification+of+cardiac+mesodermal+cells+derived+from+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt5b+signaling+directs+outlying+Nkx2.5++mesoderm+into+pacemaker+cardiomyocytes.">Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes.</a> Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+atrial+and+ventricular+myocytes+from+human+embryonic+stem+cells+by+alternating+retinoid+signals.">Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals.</a> Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).</li><li>Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banking+human+induced+pluripotent+stem+cells:+lessons+learned+from+embryonic+stem+cells.">Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+notch+signaling+promotes+cardiomyocyte+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+heart+through+Wnt+pathway+antagonism.">Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism.</a> Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).</li><li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+cardiac+growth+and+size.">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).</li><li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes.">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li><li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes.">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li></ol>

Durante la reprogramación de iPSC, es fundamental cultivar PBMC durante 1 semana hasta que se agranden con núcleos y citoplasma claros. Debido a que los PBMC no proliferan, un número de células apropiado para la transducción viral es importante para una reprogramación exitosa de iPSC. El número celular de PBMC, la multiplicidad de la infección (MOI) y el título del virus deben considerarse y ajustarse para alcanzar los resultados óptimos de transducción. Para la diferenciación cardíaca, la densidad de siembr...

El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas por humanos ha revolucionado la medicina cardiovascular moderna1,2. Las iPSC humanas son capaces de autorrenovarse y generar todos los tipos de células en el corazón, incluidos los cardiomiocitos, las células endoteliales, las células del músculo liso y los fibroblastos cardíacos. Los cardiomiocitos derivados de iPSC para pacientes (iPSC-CM) pueden servir como recursos indefinidos para modelar enfermedades cardiovasculares genéticamente hereditarias (ECV) y probar la seguridad cardíaca de nuevos medicamentos3. En particular, los iPSC-CM de los pacientes están bien preparados para investigar etiologías genéticas y moleculares de las ECV que se derivan de defectos en los cardiomiocitos, como el síndrome de QT largo4 y la miocardiopatía dilatada (DCM)5. Combinados con la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9, los iPSC-CM de los pacientes han abierto una vía sin precedentes para comprender la compleja base genética de las ECV, incluidos los defectos cardíacos congénitos (CHD)6,7,8. Los iPSC-CM humanos también han exhibido potenciales para servir como fuentes de células autólogas para reponer el miocardio dañado durante un ataque cardíaco9. En los últimos años, se ha vuelto primordial generar iPSC-CM humanos de alta calidad con subtipos definidos (auricular, ventricular y nodal) para la regeneración cardíaca y las pruebas de drogas10.
La diferenciación cardíaca de las iPSC humanas ha avanzado mucho en la última década. Los métodos de diferenciación han pasado de la diferenciación espontánea basada en el cuerpo embrionario (EB) a la diferenciación cardíaca químicamente definida y dirigida11. Las moléculas de señalización clave esenciales para el desarrollo embrionario del corazón, como Wnt, BMP, Nodal y FGF, se manipulan para mejorar la diferenciación de los cardiomiocitos de las iPSC humanas10,12. Los avances significativos incluyen la modulación secuencial de la señalización Wnt (activación seguida de inhibición) para la generación robusta de cardiomiocitos a partir de iPSCs humanas13,14. Se han explorado recetas de diferenciación cardíaca definidas químicamente para facilitar la producción a gran escala de cardiomiocitos de latido15,16, que tienen el potencial de actualizarse a la producción a nivel industrial y clínico. Además, la expansión robusta de los primeros iPSC-CM humanos se logra mediante la exposición a la activación constitutiva de Wnt utilizando un pequeño producto químico (CHIR99021)17. Más recientemente, los cardiomiocitos específicos del subtipo se generan a través de la manipulación de las vías de señalización de ácido retinoico (AR) y Wnt en ventanas de diferenciación específicas durante el compromiso del linaje de cardiomiocitos de iPSCs humanas18,19,20,21,22.
En este protocolo, detallamos un procedimiento de trabajo para la generación robusta y proliferación de CM humanos originados en células mononucleares de sangre periférica del paciente. Presentamos protocolos para 1) reprogramar PBMC humanos a iPSCs, 2) generación robusta de cardiomiocitos de latidos a partir de iPSCs humanos, 3) expansión rápida de iPSC-CMs tempranos, 4) caracterización molecular de iPSC-CMs humanos, y 5) medición electrofisiológica de iPSC-CM humanos a nivel de una sola célula por pinza de parche. Este protocolo cubre los procedimientos experimentales detallados para convertir las células sanguíneas de los pacientes en cardiomiocitos que golpean.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microelectrode Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>362753</td>
			<td>Blood cell separation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Sendai virus reprogramming kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1200B</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050</td>
			<td>RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>E8 media for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Snythesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 7.0</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology data acquisition &#38; analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EPO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FLT3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639011</td>
			<td>PBMC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444964</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217703</td>
			<td>CM dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>iPSC dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and expansion of human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells

La generación de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre ha atraído un gran interés en la medicina de precisión sobre las enfermedades cardiovasculares. La diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) está modulada por vías de señalización definidas que son esenciales para el desarrollo del corazón embrionario. Se han desarrollado numerosos métodos de diferenciación cardíaca en plataformas 2-D y 3-D con diversas eficiencias y rendimiento de cardiomiocitos. Esto ha desconcertado a los investigadores fuera del campo, ya que la variedad de estos métodos puede ser difícil de seguir. Aquí presentamos un protocolo integral que elabora una generación y expansión robustas de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Primero describimos un protocolo de reprogramación iPSC de alta eficiencia a partir de la muestra de sangre de un paciente utilizando vectores del virus de Sendai no integrados. A continuación, detallamos un pequeño método de diferenciación monocapa mediado por moléculas que puede producir cardiomiocitos de latido robusto a partir de la mayoría de las líneas iPSC humanas. Además, se introduce un protocolo de expansión de cardiomiocitos escalable utilizando una molécula pequeña (CHIR99021) que podría expandir rápidamente los cardiomiocitos derivados del paciente para aplicaciones de grado industrial y clínico. Al final, se representan protocolos detallados para la identificación molecular y la caracterización electrofisiológica de estos iPSC-CM. Esperamos que este protocolo sea pragmático para principiantes con conocimientos limitados sobre desarrollo cardiovascular y biología de células madre.

Reprogramación de iPSC humanos desde PBMC Después del precultivo con medios sanguíneos completos durante 7 días, los PBMC se vuelven grandes con núcleos y citoplasma visibles(Figura 1B),lo que indica que están listos para la transfección del virus. Después de la transfección con los factores de reprogramación del virus de Sendai, los PBMC se someterán a un proceso de reprogramación epigenética durante otra semana. Por lo gener...

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Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Se trata de instalaciones de protocolo integrales, generación de impulsos brutos y uso de cultivos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica. Estas tácticas son reproducibles y fáciles de seguir, especialmente para principiantes. Y no requiere, especial experiencia en baladas de células madre o medicina cardiovascular.Nuestro protocolo se puede utilizar para generar cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre que se puede utilizar para modelar enfermedades cardiovasculares y probar la toxicidad cardíaca de nuevos medicamentos. Este protocolo requiere un compromiso de mucho tiempo para el mantenimiento de la reprogramación de células madre y la diferenciación dirigida. Sin embargo, realmente aprecias tus esfuerzos.Cuando veas batir cardiomiocitos en el plato. Cuando las colonias humanas de iPSC alcancen más del 90% de confluencia, enjuague cada pozo con tres mililitros de DPBS antes de tratar las células con un mililitro de EDTA de 0,5 milimolares en DPBS por pozo a 37 grados Centígrados. Después de cinco a ocho minutos, agregue un mililitro de medio de paso iPSC a cada pozo y desaloje manualmente las células.Transfiera de 600 a 900 microlitros de las células a pozos individuales Que tienen una placa de seis pocillos recubierta de membrana basal para una incubación nocturna a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Luego refresque los cultivos con dos mililitros de medio E8 completo todos los días durante tres o cuatro días. Cuando el cultivo haya alcanzado la confluencia, reemplace el medio con dos mililitros de medio de diferenciación de cardiomiocitos, dos por pozo.En el segundo día, reemplace los sobrenadantes con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio uno. En el tercer día, reemplace los sobrenadantes con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio tres. El quinto día.Reemplace el sobrenadante con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio uno. En el día siete al 10, reemplace el sobrenadante con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio cuatro. Los días 11 y 13.Cuando se observen células contraídas, reemplace el sobrenadante con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio cinco. Los días 15, 17, 19 y 21. Sustituir el sobrenadante por dos mililitros de diferenciación cardiomiocitaria medio cuatro.Después del precultivo con medio sanguíneo completo por siete días, los PBMC se vuelven grandes con núcleos y citoplasma visibles que indican que están listos para la transfección con factores de reprogramación del virus de Sendai. Tras la introducción al medio E8 completo. Las células completamente reprogramadas se unirán y comenzarán a formar colonias.Después de cuatro a cinco pasajes, se formarán colonias de iPSC altamente puras a partir de las células reprogramadas con muy pocas células diferenciadas observadas. En esta etapa, la mayoría de las células son OCT4 y NANOG positivas indicativas de su pluripotenia. Los cardiomiocitos que golpean generalmente se observan después de 12 días de diferenciación.Después de la inanición de glucosa y el replanteo, los cardiomiocitos iPSC exhiben, latidos espontáneos y una estructura de sarcómero alineada con troponina T cardíaca intercalada y expresión de alfa actinina. Las colonias conservan su pureza como lo demuestra su expresión de troponina T. Aunque los cardiomiocitos iPSC son relativamente inmaduros en comparación con los cardiomiocitos adultos.Demuestran potenciales de acción similares a los ventriculares y auriculares medidos por parche al por mayor, pinza. Los cardiomiocitos ventriculares expresan miosina de cadena ligera dos, mientras que los cardiomiocitos iPSC auriculares están marcados por la expresión de NR2F2. La activación Wnt estimula la división celular y promueve la expresión de los reguladores del ciclo celular.Curiosamente, la activación de Wnt también induce la proliferación robusta de cardiomiocitos iPSC tempranos para dos pasajes en comparación con los controles, aunque esta capacidad proliferativa disminuye con el tiempo. Asegúrese de que los PBMS se amplíen con el nuclear y el citoplasma claros antes de que se introduzcan los vectores de reprogramación de iPSC, ya que la condición de los PBM es crítica para la reprogramación de iPSC. Los cardiomiocitos específicos del paciente son valiosos para modelar la enfermedad cardiovascular in vitro y para proporcionar una tonelada de células donantes para la terapia con células madre cardíacas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definido y escalable Generación de células hepatocitos como las de las células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...