Name: observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 und P01 AI042288 finanziert. Diese Forschung wurde mit Unterstützung des Netzwerks für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), ein kollaboratives Typ-1-Diabetes-Forschungsprojekt, das von JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) und dem Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) gesponsert wird. Der Inhalt und die geäußerten Ansichten liegen in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die offizielle Ansicht von nPOD wider. Organ Procurement Organizations (OPO), die mit nPOD zusammenarbeiten, um Forschungsressourcen bereitzustellen, sind unter http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ aufgeführt. Vielen Dank an Dr. Kevin Otto, University of Florida, für die Bereitstellung des Vibratoms, das zur Erzeugung von Mausscheiben verwendet wird.

ANMERKUNGEN: Alle experimentellen Protokolle mit Mäusen wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Florida (201808642) genehmigt. Menschliche Pankreasschnitte von Gewebespendern beiderlei Geschlechts wurden über die Gewebebank Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) der University of Florida gewonnen. Die menschliche Bauchspeicheldrüse wurde von zertifizierten Organbeschaffungsorganisationen, die mit nPOD zusammenarbeiten, in Übereinstimmung mit den Organspendegesetzen und -vorschrift...

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	<li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders.">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li><li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics,+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes.">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li><li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes:+etiology+and+reversibility.">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li><li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases.">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Panzer, J. K., Cohrs, C. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis.">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).</li><li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis.">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li><li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes.">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li><li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration.">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).</li><li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+persisting+&#946;+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis.">Dysfunction of persisting &#946; cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).</li><li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology.">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li><li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li><li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses.">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li><li>Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).</li><li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine,+porcine,+and+bovine+islets.">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices.">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li><li>G&#225;l, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice.">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).</li><li>Sto&#382;er, A., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Sto&#382;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices.">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).</li><li>Fr&#252;h, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization.">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).</li><li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion.">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations.">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li><li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ.">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2012).</li></ol>

Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung von Pankreasscheiben und die Verfahren, die für die Verwendung der Scheiben in funktionellen und immunologischen Studien erforderlich sind, zu erläutern. Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von lebenden Pankreasscheiben. Es gibt jedoch mehrere kritische Schritte, die wesentlich sind, damit das Gewebe während der beschriebenen Experimentprotokolle lebensfähig und nützlich bleibt. Es ist unerlässlich, schnell zu arbeiten. Die Zeitspanne zwischen der Injektion der Bau...

Die Beteiligung der Bauchspeicheldrüse ist pathognomonisch bei Krankheiten wie Pankreatitis, T1D und T2D1,2,3. Die Untersuchung der Funktion in isolierten Inseln beinhaltet in der Regel die Entfernung der Inseln aus ihrer Umgebung4. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts wurde entwickelt, um die Untersuchung von Pankreasgewebe unter Beibehaltung intakter Inselmikroumgebungen zu ermöglichen und die Verwendung von stressigen Inselisolationsverfahren zu vermeiden5,6,7. Pankreasgewebeschnitte aus menschlichem Spendergewebe wurden erfolgreich zur Untersuchung von T1D verwendet und haben Prozesse des Betazellverlustes und der Funktionsstörung zusätzlich zur Immunzellinfiltration gezeigt8,9,10,11,12,13. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts kann sowohl auf Maus- als auch auf menschliches Pankreasgewebe angewendet werden5,6,8. Menschliche Pankreasgewebeschnitte aus Organspendergewebe werden durch eine Zusammenarbeit mit dem Netzwerk für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD) gewonnen. Mausscheiben können aus einer Vielzahl verschiedener Mausstämme generiert werden.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf nicht-fettleibige Diabetiker-Rekombination aktivierendes Gen-1-null (NOD. Rag1-/-) und T-Zell-Rezeptor transgen (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) Mausstämme. NICKEN. Rag1-/- Mäuse können aufgrund einer Störung des rekombinationsaktivierenden Gens 1 (Rag1)14 keine T- und B-Zellen entwickeln. NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β Mäuse werden als Modell für beschleunigten Typ-1-Diabetes verwendet, da sie einen einzigen T-Zell-Klon produzieren, der auf ein Epitop von Insulin abzielt, was zu einer konsistenten Inselinfiltration und einer schnellen Krankheitsentwicklung führt15. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt Verfahren für funktionelle und immunologische Studien mit lebenden Pankreasschnitten von Mensch und Maus durch die Anwendung konfokaler Mikroskopieansätze. Die hierin beschriebenen Techniken umfassen Lebensfähigkeitsbewertungen, Identifizierung und Lokalisierung von Inselchen, zytosolische Ca2+ -Aufzeichnungen sowie Färbung und Identifizierung von Immunzellpopulationen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#3 Style Scalpel Handle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-100</td>
			<td>HEPES Buffer, 1M Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Untreated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>301029</td>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 305109</td>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverglass-bottom Petri dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>199898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>CaCl2 (dihydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Pinhole&#8201;= 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512&#8201;&#215;&#8201;512 pixel resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>C6H12O6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddiH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 35 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather No. 10 Surgical Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7204410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluo-4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Control Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>45198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>C8H18N2O4S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-395-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-7440</td>
			<td>&#160;Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34705</td>
			<td>Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers, 2-Ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>This kit contains the calcein-AM live cell dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>MgSO4 (heptahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Heated Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-1</td>
			<td>Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>GE</td>
			<td>JES1460DSWW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 Paintbrush</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10269140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td>Imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overnight imaging chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20012050</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-labeled insulin tetramer</td>
			<td>Emory Tetramer Research Core</td>
			<td>sequence YAIENYLEL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71998</td>
			<td>For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque low melting-point agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50101</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor (dynamic imaging)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4 (monohydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Adapter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SA-20MW-AL</td>
			<td>To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>IC90 E MSV266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S34857</td>
			<td>blue-fluorescent nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357575</td>
			<td>Falcon&#8482; Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VCS-8</td>
			<td>System for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td>Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices

Lebende Pankreasgewebeschnitte ermöglichen die Untersuchung der Physiologie und Funktion von Inseln im Kontext einer intakten Inselmikroumgebung. Die Scheiben werden aus lebendem Pankreasgewebe von Mensch und Maus hergestellt, das in Agarose eingebettet ist und mit einem Vibratom geschnitten wird. Diese Methode ermöglicht es dem Gewebe, die Lebensfähigkeit und Funktion aufrechtzuerhalten und die zugrunde liegenden Pathologien wie Typ-1-Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) zu erhalten. Die Slice-Methode ermöglicht neue Richtungen bei der Untersuchung der Bauchspeicheldrüse durch die Aufrechterhaltung der komplexen Strukturen und verschiedener interzellulärer Wechselwirkungen, die das endokrine und exokrine Gewebe der Bauchspeicheldrüse umfassen. Dieses Protokoll zeigt, wie man Färbung und Zeitraffermikroskopie von lebenden endogenen Immunzellen in Pankreasschnitten zusammen mit Bewertungen der Inselphysiologie durchführt. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verfeinert werden, um Immunzellpopulationen zu erkennen, die für Inselzellantigene spezifisch sind, wobei wichtige Histokompatibilitäts-Komplex-Multimer-Reagenzien verwendet werden.

Dieses Protokoll liefert lebende Pankreasgewebeschnitte, die sowohl für Funktionsstudien als auch für Immunzellaufnahmen geeignet sind. Das Erscheinungsbild der Scheiben sowohl im Hellfeld als auch unter reflektiertem Licht ist in Abbildung 1A,B dargestellt. Wie bereits erwähnt, können Inseln in Scheiben gefunden werden, die reflektiertes Licht aufgrund ihrer erhöhten Granularität verwenden, die aufgrund ihres Insulingehalts auftritt (Abbildung 1C<...

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Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Diese Studie präsentiert die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten auf die Untersuchung der Inselphysiologie und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Unser Protokoll wird dazu beitragen, die Auswirkungen von Immunzellinteraktionen auf die Inselfunktionalität zu beantworten. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts ermöglicht es, die Physiologie und Funktion der Inseln zu untersuchen, während die zugrunde liegenden Gewebe und die native Mikroumgebung erhalten bleiben. Diese Methode könnte Einblicke in die Krankheitsprozesse von Pankreaserkrankungen wie Pankreatitis, Typ-I-Diabetes und Typ-II-Diabetes geben.Ordnen Sie zunächst die Blöcke auf dem Probenhalter so an, dass sie die Klingenbreite nicht überschreiten, um sicherzustellen, dass sich die Klinge bei langsamer Bewegung des Vibratoms so weit wie möglich vorwärts bewegen kann. Tragen Sie eine Linie VonKleber auf den Probenhalter auf, machen Sie eine dünne Schicht mit dem Ende des Leimspenders und drehen Sie dann die Gewebeblöcke auf den Kleber, so dass die Seite in der Nähe des Gewebes nach oben zeigt. Drücken Sie die Blöcke vorsichtig nach unten und lassen Sie den Kleber drei Minuten trocknen.Als nächstes befestigen Sie die Platte mit einer Schraube am Vibratom und stellen Sie die Klingenhöhe und den zurückgelegten Weg so ein, dass sich die Klinge über die Länge der Blöcke und nur knapp darüber bewegt. Stupsen Sie die Blöcke vorsichtig mit der Pinzette an, um zu überprüfen, ob der Kleber getrocknet ist, und füllen Sie dann die Vibrationsschale mit einer gekühlten extrazellulären Lösung, bis die Klinge bedeckt ist. Stellen Sie das Vibratom ein, um Scheiben von 120 Mikrometer Dicke zu machen und starten Sie es, dann beobachten Sie die Scheiben, die von den Gewebeblöcken kommen.Heben Sie die Scheiben an, wenn sie vom Block schwimmen, indem Sie einen Pinsel oder eine Pinzette darunter legen und die Scheiben in den Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer legen, der drei Millimolar D-Glucose und Trypsin-Inhibitor enthält. Legen Sie die Platten mit den Scheiben auf eine Wippe und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde bei 25 U / min. Wenn die Scheiben länger aufbewahrt werden müssen, legen Sie die Scheiben in 15 Milliliter Scheibenkulturmedium und legen Sie die Platte in einen Inkubator.Inkubieren Sie die vorbereiteten Scheiben bei 37 Grad Celsius für Studien am selben Tag oder übertragen Sie die Scheiben, die bei 24 Grad Celsius über Nacht kultiviert werden, mindestens eine Stunde vor dem Experiment auf 37 Grad Celsius. Schalten Sie das Mikroskop mindestens eine Stunde vor der Aufnahme ein und balancieren Sie den Bühnen-Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius. Befestigen Sie die Boden petrischale des Deckglases mit der Scheibe auf der Bühne.Fokussieren Sie das Mikroskop, indem Sie das 10-fache Objektiv in den Hellfeldmodus stellen, und lokalisieren Sie die Inseln im Hellfeldmodus, indem Sie nach orangebraun gefärbten Ovalen innerhalb der Scheibe suchen. Schalten Sie das Mikroskop auf konfokale Bildgebung um, indem Sie die CS-Taste auf dem Touchscreen-Controller des Mikroskops drücken. Um die Inseln mit Reflexion zu betrachten, schalten Sie den Laserdetektor 638 und den PMT-Detektor ein.Stellen Sie die Laserleistung zwischen eins und 2% ein und schalten Sie die Kerbfilter aus. Verwenden Sie den 405-Nanometer-Laser und den PMT-Detektor, um die Nukleinsäurefärbung zu beobachten. Der Hybriddetektor für den CD8-Antikörpernachweis und der 488-Nanometer-Laser und Hybriddetektor zur Betrachtung des Insulintetramers.Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden ist, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt. Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel und finden Sie dann die besten optischen Abschnitte, in denen die Zellen am Leben sind und alle umgebenden Immunzellen im Fokus stehen.Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet, und optimieren Sie die Einstellungen, um alle 20 Minuten über einen Zeitraum von mehreren Stunden einen Z-Stack der ausgewählten Schritte aufzuzeichnen. Die Inseln in einem Pankreasgewebeschnitt wurden mittels Hellfeld- und Auflichtmikroskopie visualisiert. Das Insulin in den Inseln erhöht die Granularität und verursacht die Absorption großer Mengen an reflektiertem Licht, wodurch die Sichtbarkeit der Inseln erhöht wird.Die Lebensfähigkeit eines lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitts wurde durch Färbung beurteilt. Die lebenden Zellen sind grün und die toten Zellen blau dargestellt. Ein weiterer positiver Indikator für die Lebensfähigkeit ist die beobachtbare Basalaktivität.Wenn eine lebende Pankreasscheibe mit einem zelldurchlässigen Kalziumindikator beladen wurde, wurde eine Glukosestimulation sowohl in Maus- als auch in menschlichen Pankreasscheiben beobachtet. Die Fluoreszenz einzelner Zellen während der Glukosestimulation wurde ebenfalls quantifiziert. Intakte und erkrankte Inseln wurden mittels Dithizonfärbung und Auflichtmikroskopie beobachtet.Die erkrankten Inseln beginnen aufgrund von Immunzellinfiltration und Zelltod an Granularität zu verlieren. Immunzellpopulationen können mittels CD8-Antikörpern und Insulintetramer-Färbung identifiziert werden. Die Co-Färbung zeigt an, dass es sich bei den Zellen um Effektor-T-Zellen handelt, die speziell auf das Insulinantigen abzielen.Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die Scheiben jederzeit in Lösungen proteaseinhibitor zu halten. Nach diesem Verfahren können zahlreiche Funktionalitäten in Immunzellexperimenten durchgeführt werden, die es ermöglichen, die Wirkung von Immunzellinteraktionen und Inselfunktion zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...