Name: observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

इस काम को एनआईएच अनुदान R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, और P01 AI042288 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। यह शोध मधुमेह (nPOD) के साथ अग्नाशयी अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के समर्थन के साथ किया गया था; RRID: SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) द्वारा प्रायोजित एक सहयोगी टाइप 1 मधुमेह अनुसंधान परियोजना, और लियोना एम और हैरी बी हेल्मस्ले चैरिटेबल ट्रस्ट (ग्रांट #2018PG-T1D053)। व्यक्त की गई सामग्री और विचार लेखकों की जिम्मेदारी हैं और जरूरी नहीं कि एनपीओडी के आधिकारिक दृष्टिकोण को प्रतिबिंबित करें। अनुसंधान संसाधन प्रदान करने के लिए एनपीओडी के साथ साझेदारी करने वाले अंग खरीद संगठनों (ओपीओ) को http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ पर सूचीबद्ध किया गया है। आप डॉ केविन Otto, फ्लोरिडा विश्वविद्यालय, माउस स्लाइस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया vibratome प्रदान करने के लिए धन्यवाद.

नोट्स: चूहों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल फ्लोरिडा पशु देखभाल और उपयोग समिति (201808642) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किए गए थे। दोनों लिंगों के ऊतक दाताओं से मानव अग्नाशयी वर्गों मधुमेह (n...

<ol>
	<li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders.">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li><li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics,+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes.">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li><li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes:+etiology+and+reversibility.">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li><li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases.">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Panzer, J. K., Cohrs, C. 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M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration.">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).</li><li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+persisting+&#946;+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis.">Dysfunction of persisting &#946; cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).</li><li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology.">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li><li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li><li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses.">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li><li>Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).</li><li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine,+porcine,+and+bovine+islets.">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices.">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li><li>G&#225;l, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice.">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).</li><li>Sto&#382;er, A., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Sto&#382;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices.">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).</li><li>Fr&#252;h, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization.">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).</li><li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion.">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations.">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li><li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ.">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2012).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अग्न्याशय स्लाइस की पीढ़ी और कार्यात्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में स्लाइस को नियोजित करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को स्पष्ट करना है। लाइव अग्नाशयी स्लाइस का उपय?...

अग्न्याशय की भागीदारी अग्नाशयशोथ, T1D, और T2D1, 2,3 जैसे रोगों के लिए pathognomonic है। पृथक आइलेट्स में फ़ंक्शन के अध्ययन में आमतौर पर उनके आसपास के वातावरण से आइलेट्स को हटाना शामिल होता है। जीवित अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि को अग्नाशय के ऊतकों के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था, जबकि बरकरार आइलेट माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने और तनावपूर्ण आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं के उपयोग से बचने के लिए 5,6,7। मानव दाता ऊतक से अग्नाशय के ऊतक स्लाइस का सफलतापूर्वक T1D का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है और प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ 8,9,10,11,12,13 के अलावा बीटा सेल हानि और शिथिलता की प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया है। लाइव अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि दोनों माउस और मानव अग्नाशय ऊतक 5,6,8 करने के लिए लागू किया जा सकता है। अंग दाता ऊतकों से मानव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस मधुमेह (nPOD) के साथ अग्नाशय अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के साथ एक सहयोग के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं। माउस स्लाइस विभिन्न माउस उपभेदों की एक किस्म से उत्पन्न किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल जीन-1-नल (NOD) को सक्रिय करने वाले गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन पर ध्यान केंद्रित करेगा। Rag1-/-) और टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक (AI4) (NOD) Rag1-/-. AI4 α/β) माउस उपभेदों. सिर हिलाना। Rag1-/- चूहे पुनर्संयोजन-सक्रिय जीन 1 (Rag1)14 में व्यवधान के कारण टी और बी कोशिकाओं को विकसित करने में असमर्थ हैं। सिर हिलाना। Rag1-/-. एआई 4 α / β चूहों का उपयोग त्वरित टाइप 1 मधुमेह के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है क्योंकि वे एक एकल टी सेल क्लोन का उत्पादन करते हैं जो इंसुलिन के एक एपिटोप को लक्षित करता है, जिसके परिणामस्वरूप लगातार आइलेट घुसपैठ और तेजी से रोग विकास होता है। यहां चित्रित प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के आवेदन के माध्यम से लाइव मानव और माउस अग्नाशय के स्लाइस का उपयोग करके कार्यात्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। यहां वर्णित तकनीकों में व्यवहार्यता आकलन, आइलेट पहचान और स्थान, साइटोसोलिक Ca2 + रिकॉर्डिंग, साथ ही साथ प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के धुंधला और पहचान शामिल हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#3 Style Scalpel Handle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-100</td>
			<td>HEPES Buffer, 1M Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Untreated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>301029</td>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 305109</td>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverglass-bottom Petri dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>199898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>CaCl2 (dihydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Pinhole&#8201;= 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512&#8201;&#215;&#8201;512 pixel resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>C6H12O6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddiH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 35 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather No. 10 Surgical Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7204410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluo-4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Control Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>45198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>C8H18N2O4S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-395-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-7440</td>
			<td>&#160;Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34705</td>
			<td>Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers, 2-Ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>This kit contains the calcein-AM live cell dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>MgSO4 (heptahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Heated Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-1</td>
			<td>Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>GE</td>
			<td>JES1460DSWW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 Paintbrush</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10269140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td>Imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overnight imaging chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20012050</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-labeled insulin tetramer</td>
			<td>Emory Tetramer Research Core</td>
			<td>sequence YAIENYLEL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71998</td>
			<td>For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque low melting-point agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50101</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor (dynamic imaging)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4 (monohydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Adapter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SA-20MW-AL</td>
			<td>To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>IC90 E MSV266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S34857</td>
			<td>blue-fluorescent nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357575</td>
			<td>Falcon&#8482; Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VCS-8</td>
			<td>System for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td>Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices

लाइव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस आइलेट फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं और एक बरकरार आइलेट माइक्रोएन्वायरमेंट के संदर्भ में कार्य करते हैं। स्लाइस जीवित मानव और माउस अग्नाशय के ऊतकों से तैयार किए जाते हैं जो एगरोज में एम्बेडेड होते हैं और एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके काटते हैं। यह विधि ऊतक को टाइप 1 (टी 1 डी) और टाइप 2 मधुमेह (टी 2 डी) जैसे अंतर्निहित विकृति को संरक्षित करने के अलावा व्यवहार्यता और कार्य को बनाए रखने की अनुमति देती है। स्लाइस विधि जटिल संरचनाओं और विभिन्न अंतरकोशिकीय इंटरैक्शन के रखरखाव के माध्यम से अग्न्याशय के अध्ययन में नई दिशाओं को सक्षम बनाती है जिसमें अग्न्याशय के अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन ऊतक शामिल होते हैं। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आइलेट फिजियोलॉजी के आकलन के साथ अग्नाशय के स्लाइस के भीतर जीवित अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के धुंधला और समय-अंतराल माइक्रोस्कोपी कैसे किया जाए। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स-मल्टीमर अभिकर्मकों का उपयोग करके आइलेट सेल एंटीजन के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को समझने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल कार्यक्षमता अध्ययन और प्रतिरक्षा सेल रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उपयुक्त जीवित अग्नाशयी ऊतक स्लाइस उत्पन्न करेगा। ब्राइटफील्ड और परावर्तित प्रकाश के तहत दोनों में स्लाइस उपस्थिति <strong class="xfi...

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Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

यह अध्ययन आइलेट फिजियोलॉजी और आइलेट-प्रतिरक्षा सेल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए लाइव अग्नाशयी ऊतक स्लाइस के आवेदन को प्रस्तुत करता है।

लाइव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस में आइलेट फ़ंक्शन और आइलेट-इम्यून सेल इंटरैक्शन का अवलोकन करना

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

हमारा प्रोटोकॉल उस प्रभाव का जवाब देने में मदद करेगा जो प्रतिरक्षा सेल इंटरैक्शन आइलेट कार्यक्षमता पर पड़ता है। लाइव अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि आइलेट फिजियोलॉजी और फ़ंक्शन के लिए अध्ययन करने की अनुमति देती है, जबकि ऊतकों को अंतर्निहित विकृति और देशी माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखती है। यह विधि अग्नाशय की बीमारियों की रोग प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, जैसे अग्नाशयशोथ, टाइप I मधुमेह और टाइप II मधुमेह।शुरू करने के लिए, नमूना धारक पर ब्लॉकों को इस तरह से व्यवस्थित करें कि वे ब्लेड की चौड़ाई से अधिक न हों, यह सुनिश्चित करते हुए कि जब वाइब्रेटोम धीरे-धीरे चलता है तो ब्लेड कम से कम संभव दूरी को आगे बढ़ा सकता है। नमूना धारक पर सुपर गोंद की एक पंक्ति लागू करें, गोंद डिस्पेंसर के अंत का उपयोग करके एक पतली परत बनाएं, फिर ऊतक ब्लॉकों को गोंद पर फ्लिप करें ताकि ऊतक के करीब की ओर पक्ष ऊपर की ओर हो। धीरे से ब्लॉकों को नीचे धकेलें और गोंद को तीन मिनट के लिए सूखने दें।इसके बाद, प्लेट को एक पेंच के साथ वाइब्रेटोम में संलग्न करें और ब्लेड की ऊंचाई और यात्रा की जा रही दूरी को समायोजित करें ताकि ब्लेड ब्लॉकों की लंबाई पर और उनके ऊपर मुश्किल से चलता है। धीरे से संदंश के साथ ब्लॉकों को नज करें ताकि यह जांच सकें कि गोंद सूख गया है, और फिर ब्लेड को कवर किए जाने तक एक ठंडा एक्स्ट्रासेल्युलर समाधान के साथ वाइब्रेटोम ट्रे को भरें। 120 माइक्रोमीटर मोटाई के स्लाइस बनाने के लिए वाइब्रेटोम सेट करें और इसे शुरू करें, फिर ऊतक ब्लॉकों से आने वाले स्लाइस का निरीक्षण करें।स्लाइस को उठाएं जब वे उनके नीचे एक पेंटब्रश या संदंश रखकर ब्लॉक से तैरते हैं और स्लाइस को क्रेब्स-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर में रखते हैं जिसमें तीन मिलीमोलर डी-ग्लूकोज और ट्रिप्सिन इनहिबिटर होते हैं। एक रॉकर पर स्लाइस युक्त प्लेटों को रखें और 25 आरपीएम पर एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। यदि स्लाइस को लंबे समय तक रखने की आवश्यकता है, तो स्लाइस को स्लाइस संस्कृति माध्यम के 15 मिलीलीटर में रखें और प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें।उसी दिन के अध्ययन के लिए तैयार स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें या प्रयोग से पहले कम से कम एक घंटे के लिए रात भर में 24 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें। रिकॉर्डिंग से कम से कम एक घंटे पहले माइक्रोस्कोप पर स्विच करें और स्टेज टॉप इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक संतुलित करें। कवर ग्लास नीचे पेट्री मंच पर टुकड़ा युक्त पकवान सुरक्षित.Brightfield मोड में 10X उद्देश्य की स्थापना करके माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें और स्लाइस के भीतर नारंगी भूरे रंग के अंडाकार की तलाश करके उज्ज्वल क्षेत्र मोड का उपयोग करके आइलेट्स का पता लगाएं। माइक्रोस्कोप के टच स्क्रीन नियंत्रक पर सीएस बटन दबाकर माइक्रोस्कोप को कॉन्फोकल इमेजिंग पर स्विच करें। परावर्तकता का उपयोग कर आइलेट्स को देखने के लिए, 638 लेजर डिटेक्टर और पीएमटी डिटेक्टर को चालू करें।एक और 2% के बीच लेजर पावर सेट करें और पायदान फिल्टर बंद कर दें। न्यूक्लिक एसिड दाग का निरीक्षण करने के लिए 405 नैनोमीटर लेजर और पीएमटी डिटेक्टर का उपयोग करें। CD8 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए हाइब्रिड डिटेक्टर और इंसुलिन टेट्रामर को देखने के लिए 488 नैनोमीटर लेजर और हाइब्रिड डिटेक्टर।चरण नियंत्रक के एक्स और वाई knobs का उपयोग कर दृश्य के क्षेत्र में रुचि के आइलेट केंद्र. एक बार ब्याज का एक आइलेट स्थित होने के बाद, 20X उद्देश्य पर स्विच करें और ज़ूम इन करें ताकि आइलेट अधिकांश फ्रेम ले ले। आइलेट का एक जेड-स्टैक लें, फिर सबसे अच्छे ऑप्टिकल वर्गों को ढूंढें जहां कोशिकाएं जीवित हैं और किसी भी आसपास की प्रतिरक्षा कोशिकाएं ध्यान में हैं।XYZT मोड में रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें और कई घंटों की अवधि में हर 20 मिनट में चयनित चरणों के जेड-स्टैक को रिकॉर्ड करने के लिए सेटिंग्स को ऑप्टिमाइज़ करें। एक अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में आइलेट्स को ब्राइटफील्ड और परावर्तित प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की गई थी। आइलेट्स में इंसुलिन ग्रैन्युलैरिटी को बढ़ाता है और बड़ी मात्रा में परावर्तित प्रकाश के अवशोषण का कारण बनता है, जिससे आइलेट्स की दृश्यता बढ़ जाती है।एक जीवित मानव अग्नाशय ऊतक टुकड़ा की व्यवहार्यता धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था। जीवित कोशिकाओं को हरे रंग में और मृत कोशिकाओं को नीले रंग में इंगित किया जाता है। व्यवहार्यता के लिए एक और सकारात्मक संकेतक अवलोकन योग्य बेसल गतिविधि है।जब एक जीवित अग्नाशयी टुकड़ा एक सेल पारगम्य कैल्शियम संकेतक के साथ लोड किया गया था, तो ग्लूकोज उत्तेजना माउस और मानव अग्नाशय के स्लाइस दोनों में देखी गई थी। ग्लूकोज उत्तेजना के दौरान व्यक्तिगत कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति को भी परिमाणित किया गया था। अक्षुण्ण और रोगग्रस्त आइलेट्स को डाइथिज़ोन स्टेनिंग और परावर्तित प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया था।रोगग्रस्त आइलेट्स प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ और कोशिका मृत्यु के कारण ग्रैन्युलैरिटी खोना शुरू कर देते हैं। प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को सीडी 8 एंटीबॉडी और इंसुलिन टेट्रामर स्टेनिंग का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। सह-धुंधला इंगित करता है कि कोशिकाएं प्रभावकारी टी-सेल हैं जो विशेष रूप से इंसुलिन एंटीजन को लक्षित कर रही हैं।इस प्रक्रिया में याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि स्लाइस को हर समय समाधान प्रोटीज अवरोधक में रखना है। इस प्रक्रिया के बाद, प्रतिरक्षा सेल प्रयोगों में कई कार्यक्षमता का प्रदर्शन किया जा सकता है जो प्रतिरक्षा कोशिका इंटरैक्शन और आइलेट फ़ंक्शन के प्रभाव के लिए अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

गतिशील लाइव सेल इमेजिंग के लिए मेजबान पैथोजन सहभागिता के अध्ययन के लिए एक ऑप्टिकल जाल का प्रयोग करें

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Vacuolar टूटना की सिंगल सेल माप intracellular रोगज़नक़ों की वजह

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Photoactivated एकल अणु ट्रैकिंग का प्रयोग लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत Visualizing

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में एक Oligodendrocyte का निर्देशन टी-सेल हमले के मॉडल

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

जीन या ड्रग थेरेपी में उपयोग के लिए लक्ष्य निर्धारण एचआईवी -1 उत्पादन प्रभावकारिता और आरएनए की विषाक्तता का मूल्यांकन

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

प्रेसिजन कटौती माउस फेफड़े स्लाइस लाइव फेफड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं कल्पना करने के लिए

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

पूर्व वीवो मानव लसीकावत् ऊतक और मादा जननांग म्यूकोसा के मानव इम्यूनो वायरस 1 और Histoculture के साथ संक्रमण

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

मानव टाप एंटीबॉडी के लिए Electrochemiluminescence परख

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Diabetogenic पर्यावरणीय रसायनों के लिए एक Murine अग्नाशय टाप सेल आधारित स्क्रीनिंग

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

मूरीन थाइमस, अग्नाशय Draining लिम्फ नोड और प्लीहा प्रवाह cytometry का उपयोग में नियामक टी सेल सबसेट का निर्धारण

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...