Name: observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

この研究は、NIH助成金R01 DK123292、T32 DK108736、UC4 DK104194、UG3 DK122638、およびP01 AI042288によって資金提供されました。この研究は、糖尿病を有する膵臓臓器提供者のためのネットワークの支援を受けて行われました (nPOD;RRID:SCR_014641)、JDRF(nPOD:5-SRA-2018-557-Q-R)とレオナM.&ハリーB.ヘルムズリー慈善信託(グラント#2018PG-T1D053)が主催する共同1型糖尿病研究プロジェクト。表現された内容と見解は著者の責任であり、必ずしもnPODの公式見解を反映しているわけではありません。nPODと提携し、研究リソースを提供する臓器調達機関(OPO)を http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ に掲載しています。マウススライスの生成に使用されるビブラートを提供してくれた、フロリダ大学のケビン・オットー博士に感謝します。

注:マウスを使用するすべての実験的プロトコルは、フロリダ大学動物ケア使用委員会(201808642)によって承認されました。両方の男女の組織ドナーからのヒト膵臓切片は、糖尿病を有する膵臓ドナー(nPOD)組織バンク、フロリダ大学の組織バンクのためのネットワークを介して得られた。ヒト膵臓は、臓器提供法および規制に従ってnPODと提携する認定臓器調達機関によってカダベリック臓器提供...

<ol>
	<li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders.">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li><li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics,+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes.">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li><li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes:+etiology+and+reversibility.">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li><li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases.">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Panzer, J. K., Cohrs, C. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis.">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).</li><li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis.">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li><li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes.">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li><li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration.">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).</li><li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+persisting+&#946;+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis.">Dysfunction of persisting &#946; cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).</li><li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology.">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li><li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li><li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses.">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li><li>Fish, R., Danneman, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine,+porcine,+and+bovine+islets.">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices.">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li><li>G&#225;l, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice.">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).</li><li>Sto&#382;er, A., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Sto&#382;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices.">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).</li><li>Fr&#252;h, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization.">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).</li><li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion.">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations.">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li><li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ.">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2012).</li></ol>

このプロトコルの目的は、膵臓スライスの生成と機能および免疫学的研究でスライスを採用するために必要な手順を説明することです。生きた膵スライスを使用するには多くの利点があります。しかし、記載された実験プロトコルの間に組織が生存可能で有用であり続けるために不可欠ないくつかの重要なステップがあります。迅速に作業することが不可欠です。膵臓を注入し、ビブラート?...

膵臓の関与は、膵炎、T1D、およびT2D1,2,3などの疾患に対する病理性である。孤立した小島における機能の研究は、通常、周囲の環境4から小島を除去することを含む。生きた膵臓組織スライス法は、膵臓組織の研究を可能にし、膵臓の微小環境をそのまま維持し、ストレスの多い膵島分離手順の使用を回避するために開発されました。ヒトドナー組織からの膵組織スライスはT1Dの研究に成功し、免疫細胞浸潤に加えてベータ細胞喪失および機能不全のプロセスを実証した8,9,10,11,12,13。生きた膵臓組織スライス法は、マウスおよびヒト膵組織の両方に適用することができる5,6,8。臓器提供組織からのヒト膵臓組織スライスは、糖尿病を有する膵臓臓器提供者ネットワーク(nPOD)との共同研究を通じて得られる。マウススライスは、さまざまなマウス株から生成することができます。
このプロトコルは、非肥満糖尿病-再結合活性化遺伝子-1-ヌル(NOD.ラグ1---)およびT細胞受容体トランスジェニック(AI4)(NOD.ラグ1-/-.AI4 α/β)マウス株。頷く。Rag1-/- マウスは、組換え活性化遺伝子1(Rag1)14の破壊によりT細胞およびB細胞を発達させることができない。頷く。ラグ1-/-.AI4 α/β マウスは、インスリンのエピトープを標的とする単一のT細胞クローンを産生し、一貫した小地浸潤および急速な疾患開発をもたらすため、加速1型糖尿病のモデルとして使用されます15。ここで取り上げたプロトコルは、共焦点顕微鏡法の適用を通じて、生きたヒトおよびマウス膵スライスを用いた機能および免疫学的研究の手順を説明する。本明細書に記載されている技術には、生存率評価、小口同定および位置、細胞細胞細胞Ca2+ 記録、ならびに免疫細胞集団の染色および同定が含まれる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#3 Style Scalpel Handle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-100</td>
			<td>HEPES Buffer, 1M Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Untreated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>301029</td>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 305109</td>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverglass-bottom Petri dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>199898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>CaCl2 (dihydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Pinhole&#8201;= 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512&#8201;&#215;&#8201;512 pixel resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>C6H12O6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddiH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 35 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather No. 10 Surgical Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7204410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluo-4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Control Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>45198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>C8H18N2O4S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-395-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-7440</td>
			<td>&#160;Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34705</td>
			<td>Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers, 2-Ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>This kit contains the calcein-AM live cell dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>MgSO4 (heptahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Heated Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-1</td>
			<td>Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>GE</td>
			<td>JES1460DSWW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 Paintbrush</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10269140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td>Imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overnight imaging chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20012050</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-labeled insulin tetramer</td>
			<td>Emory Tetramer Research Core</td>
			<td>sequence YAIENYLEL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71998</td>
			<td>For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque low melting-point agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50101</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor (dynamic imaging)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4 (monohydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Adapter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SA-20MW-AL</td>
			<td>To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>IC90 E MSV266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S34857</td>
			<td>blue-fluorescent nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357575</td>
			<td>Falcon&#8482; Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VCS-8</td>
			<td>System for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td>Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices

生きた膵臓組織スライスは、膵島の生理学と、無傷の膵島微小環境の文脈での機能の研究を可能にする。スライスはアガロースに埋め込まれた生きたヒトおよびマウス膵臓組織から調製され、ビブラートメを使用して切断される。この方法は、組織が1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)などの基礎的な病理を維持することに加えて、生存率と機能を維持することを可能にする。このスライス法は、膵臓の内分泌組織と外分泌組織を構成する複雑な構造および様々な細胞間相互作用の維持を通じて、膵臓の研究における新たな方向性を可能にする。このプロトコルは膵臓のスライス内の生きた内因性免疫細胞の染色およびタイムラプス顕微鏡を、膵臓生理学の評価と共に行う方法を示す。さらに、この手法は、主要な組織適合性複合体多体試薬を用いて、小島細胞抗原に特異的な免疫細胞集団を識別するように精製することができる。

このプロトコルは、機能研究と免疫細胞の記録の両方に適した生きた膵臓組織スライスを生み出す。明視野と反射光の下の両方でスライスの外観を図1A,Bに示します。議論したように、小島は、インスリン含有量(図1C)のために発生する粒度の増加による反射光を使用したスライスに見つけることができ、反射光が使用される場合にはバ...

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Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

本研究は、膵島の生理学と膵島免疫細胞相互作用の研究に生きた膵臓組織スライスを適用することを示す。

膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

私たちのプロトコルは、免疫細胞相互作用が小水機能に与える影響に答えるのに役立ちます。膵臓の生きた組織スライス法は、膵島の生理学と機能を研究しながら、基礎となる病理および天然の微小環境を維持することを可能にする。この方法は、膵炎、I型糖尿病、II型糖尿病などの膵臓疾患の疾患プロセスに関する洞察を提供する可能性があります。まず、ブレード幅を超えないように、サンプルホルダーのブロックを配置し、ビブラートメがゆっくりと動いたときにブレードが可能な限り少ない距離で進むことができるようにします。標本ホルダーにスーパーグルーのラインを適用し、接着剤ディスペンサーの端を使用して薄い層を作り、組織ブロックを接着剤に反転させ、組織に近い側が上向きになるようにします。ブロックを軽く押し下げ、接着剤を3分間乾燥させます。次に、ねじでビブラートメにプレートを取り付け、ブレードがブロックの長さ、そしてかろうじてそれらの上を移動するようにブレードの高さと距離を調整します。ブロックを鉗子で軽く動かして接着剤が乾燥したことを確認し、ブレードが覆われるまで細胞外溶液でビブラートメトレイを満たします。ビブラートオムを120マイクロメートルの厚さのスライスを作り、それを開始し、その後、組織ブロックから外れるスライスを観察します。彼らはそれらの下にペイントブラシや鉗子を配置することによってブロックから浮かぶときにスライスを持ち上げ、3ミリモルDグルコースとトリプシン阻害剤を含むクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液にスライスを置きます。スライスを含むプレートをロッカーに置き、室温で25RPMで1時間インキュベートします。スライスを長く保つ必要がある場合は、スライスを15ミリリットルのスライス培地に入れ、プレートをインキュベーターに入れる。同じ日の研究のために摂氏37度で調製したスライスをインキュベートするか、実験の前に少なくとも1時間摂氏37度まで一晩で摂氏24度で培養されたスライスを移します。記録の少なくとも1時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、ステージトップインキュベーターを摂氏37度に平衡化します。ステージ上のスライスを含むカバーガラス底ペトリ皿を固定します。明視野モードで10Xの目標を設定して顕微鏡を焦点を当て、スライス内のオレンジ色の茶色の楕円形を探すことによって、明るいフィールドモードを使用して島を見つけます。顕微鏡のタッチスクリーンコントローラのCSボタンを押して、顕微鏡を共焦点イメージングに切り替えます。反射率を使用して小島を表示するには、638レーザー検出器とPMT検出器をオンにします。レーザーパワーを1~2%に設定し、ノッチフィルタをオフにします。405ナノメートルレーザーとPMT検出器を使用して、核酸染色を観察します。CD8抗体検出用のハイブリッド検出器と488ナノメートルレーザーおよびハイブリッド検出器はインスリン四量体を見る。ステージコントローラのXとYノブを使用して、視野に関心のある小地を中央に配置します。目的の小地が見つかったら、20Xの目標に切り替えてズームインし、小子がフレームの大部分を占めます。小地のzスタックを取り、その後、細胞が生きていると任意の周囲の免疫細胞が焦点を当てている最高の光学セクションを見つけます。XYZTモードで記録するように顕微鏡を設定し、数時間の期間にわたって20分ごとに選択したステップのZスタックを記録するように設定を最適化します。膵臓組織スライス中の膵島を、明視野と反射光顕微鏡を用いて可視化した。小島のインスリンは粒度を増加させ、大量の反射光の吸収を引き起こし、小島の視認性を高める。生きたヒト膵臓組織スライスの生存率を染色によって評価した。生細胞は緑色で示され、死んだ細胞は青で示されます。生存率のもう一つの肯定的な指標は、観察可能な基底活動である。生きた膵スライスに細胞透過性カルシウム指標を積んだとき、マウスとヒトの両方の膵臓スライスでグルコース刺激が観察された。グルコース刺激時の個々の細胞の蛍光も定量化した。インタクトおよび病気の小島は、ジチゾン染色および反射光顕微鏡を用いて観察された。病気の小島は、免疫細胞浸潤と細胞死のために粒度を失い始める。免疫細胞集団は、CD8抗体およびインスリン四量体染色を使用して同定することができる。共染色は、細胞がインスリン抗原を特異的に標的とするエフェクターT細胞であることを示す。この手順で覚えておくべきことの最も重要なことは、溶液プロテアーゼ阻害剤のスライスを常に保持することです。この手順に従って、免疫細胞実験における多数の機能性を、免疫細胞相互作用および小子機能の効果を研究することを可能にすることができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

アン<em&gt;エクスビボ</em急性脳スライスにおけるオリゴデンドロサイト指向T細胞攻撃の&gt;モデル

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

精密カットライブ肺樹状細胞を可視化するために、マウスの肺スライスを

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivoひと免疫不全ウイルス 1 における抗癌剤感受性との人間のリンパ組織と女性の性器粘膜の感染症

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

ヒトの膵島抗体の電気化学発光アッセイ

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓フローサイトメトリーを用いた排水における制御性 T 細胞サブセットの定量

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...