Name: observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

이 작품은 NIH 보조금 R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, P01 AI042288에 의해 지원되었다. 이 연구는 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크의 지원으로 수행되었습니다 (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)가 후원하는 공동 타입-1 당뇨병 연구 프로젝트, 레오나 M. & 해리 B. 헬름슬리 자선 신탁 (그랜트 #2018PG-T1D053). 표현된 내용과 견해는 저자의 책임이며 반드시 nPOD에 대한 공식 적인 견해를 반영하지는 않습니다. 연구 자원을 제공하기 위해 nPOD와 협력하는 장기 조달 조직 (OPO)은 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ 나열됩니다. 마우스 조각을 생성하는 데 사용되는 진동을 제공 해 준 플로리다 대학교 케빈 오토 박사에게 감사드립니다.

참고 : 마우스를 사용하는 모든 실험 프로토콜은 플로리다 동물 관리 및 사용위원회 (201808642)의 대학에 의해 승인되었다. 두 남녀의 조직 기증자에서 인간의 췌장 섹션 당뇨병을 가진 췌장 장기 기증자에 대 한 네트워크를 통해 얻은 (nPOD) 조직 은행, 플로리다 대학. 인간 췌장은 장기 기증 법률 및 규정에 따라 nPOD와 협력하는 공인 기관 조달 조직에 의해 cadaveric 장기 기증자로부터 수확되었으며 플...

<ol>
	<li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders.">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li><li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics,+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes.">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li><li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes:+etiology+and+reversibility.">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li><li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases.">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Panzer, J. K., Cohrs, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+persisting+&#946;+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis.">Dysfunction of persisting &#946; cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).</li><li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology.">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li><li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li><li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses.">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li><li>Fish, R., Danneman, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine,+porcine,+and+bovine+islets.">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices.">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li><li>G&#225;l, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice.">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).</li><li>Sto&#382;er, A., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Sto&#382;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices.">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).</li><li>Fr&#252;h, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization.">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).</li><li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion.">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations.">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li><li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ.">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2012).</li></ol>

이 프로토콜의 목적은 기능및 면역학적 연구에서 슬라이스를 사용하는 데 필요한 췌장 슬라이스 생성과 절차를 구체화하는 것입니다. 라이브 췌장 슬라이스를 사용하는 데는 많은 이점이 있습니다. 그러나, 조직이 기술된 실험 프로토콜 도중 실행 가능하고 유용한 상태를 유지하는 데 필수적인 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 신속하게 작업하는 것이 필수적입니다. 췌장을 주입하고 진동에 조?...

췌장의 참여는 췌장염, T1D 및 T2D1,2,3과 같은 질병에 대한 병증이다. 격리된 섬에서의 기능에 대한 연구는 일반적으로 주변 환경에서 섬을 제거하는 것을 포함한다4. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 그대로 있는 유일학 소환경을 유지하고 스트레스가 많은 아슬렛 격리 절차의 사용을 피하면서 췌장 조직의 연구를 가능하게 하기 위하여 개발되었다5,6,7. 인간 기증자 조직에서 췌장 조직 조각 은 성공적으로 T1D를 연구하는 데 사용되었으며 면역 세포 침투 외에 베타 세포 손실 및 기능 장애의 과정을 입증했습니다8,9,10,11,12,13. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 마우스와 인간 췌장 조직 5,6,8 모두에 적용될 수 있다. 장기 기증자 조직에서 인간 췌장 조직 조각 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크와의 협력을 통해 얻어진다 (nPOD). 마우스 슬라이스는 다양한 마우스 균주로부터 생성될 수 있다.
이 프로토콜은 비 비만 당뇨병 재조합 활성화 유전자-1-null (NOD)에 초점을 맞출 것이다. Rag1/-) 및 T 세포 수용체 형질화(AI4) (NOD. Rag1/-. AI4 α/β) 마우스 균주. 끄덕이다. Rag1/-- 마우스는 재조합 활성화 유전자 1 (Rag1)14에 있는 중단 때문에 T와 B 세포를 개발할 수 없습니다. 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β 마우스는 인슐린의 에피토프를 표적으로 하는 단일 T 세포 클론을 생성하기 때문에 가속형 1당뇨병을 위한 모델로 사용되며, 그 결과 일관된 축색 침투및 급속한 질병 개발15가 발생한다. 여기에 소개된 프로토콜은 공초점 현미경 접근법의 적용을 통해 살아있는 인간 및 마우스 췌장 조각을 사용하여 기능및 면역학 연구를 위한 절차를 설명합니다. 본 원에 기술된 기술은 생존 가능성 평가, 아슬렛 식별 및 위치, 세포성 Ca2+ 기록뿐만 아니라 면역 세포 집단의 염색 및 식별을 포함한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#3 Style Scalpel Handle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-100</td>
			<td>HEPES Buffer, 1M Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Untreated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>301029</td>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 305109</td>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverglass-bottom Petri dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>199898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>CaCl2 (dihydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Pinhole&#8201;= 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512&#8201;&#215;&#8201;512 pixel resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>C6H12O6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddiH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 35 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather No. 10 Surgical Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7204410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluo-4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Control Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>45198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>C8H18N2O4S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-395-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-7440</td>
			<td>&#160;Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34705</td>
			<td>Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers, 2-Ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>This kit contains the calcein-AM live cell dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>MgSO4 (heptahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Heated Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-1</td>
			<td>Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>GE</td>
			<td>JES1460DSWW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 Paintbrush</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10269140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td>Imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overnight imaging chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20012050</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-labeled insulin tetramer</td>
			<td>Emory Tetramer Research Core</td>
			<td>sequence YAIENYLEL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71998</td>
			<td>For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque low melting-point agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50101</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor (dynamic imaging)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4 (monohydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Adapter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SA-20MW-AL</td>
			<td>To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>IC90 E MSV266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S34857</td>
			<td>blue-fluorescent nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357575</td>
			<td>Falcon&#8482; Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VCS-8</td>
			<td>System for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td>Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices

살아있는 췌장 조직 조각은 그대로 있는 작은 액상 미세 환경의 맥락에서 islet 생리학 및 기능의 연구를 허용합니다. 슬라이스는 아가로즈에 내장된 살아있는 인간과 마우스 췌장 조직에서 제조되고 진동기를 사용하여 절단합니다. 이 방법을 사용하면 조직이 타입-1(T1D) 및 타입-2 당뇨병(T2D)과 같은 근본적인 병리를 보존하는 것 외에도 생존력과 기능을 유지할 수 있게 한다. 상기 슬라이스 방법은 췌장의 내분비 및 외신 조직을 포함하는 복잡한 구조및 각종 세포간 상호작용의 유지를 통해 췌장의 연구에서 새로운 방향을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 췌장 생리학의 평가와 함께 췌장 슬라이스 내에서 살아있는 내인성 면역 세포의 염색 및 시간 경과 현미경 검사를 수행하는 방법을 보여줍니다. 또한, 이러한 접근법은 주요 조직적합성 복합-다중머 시약을 사용하여 아슬레 세포 항원을 특이화하여 면역세포 집단을 분별하기 위해 정제될 수 있다.

이 프로토콜은 기능 성 연구 와 면역 세포 기록 모두에 적합한 살아있는 췌장 조직 조각을 산출합니다. 밝은 필드와 반사된 빛의 슬라이스 모양은 그림 1A, B에 표시됩니다. 논의된 바와 같이, 섬은 인슐린 함량(도 1C)으로 인해 발생하는 세분성 으로 인해 반사된 빛을 사용하여 슬라이스에서 발견될 수 있으며, 반사광이 사용될 때 배경 조직?...

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Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

우리의 프로토콜은 면역 세포 상호 작용이 islet 기능에 미치는 영향에 대답하는 데 도움이 될 것입니다. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 조직 생리학 및 기능을 연구할 수 있게 해 주며, 근본적인 병리및 기본 미세 환경을 유지한다. 이 방법은 췌장염, 타입-I 당뇨병 및 타입 II 당뇨병과 같은 췌장 병의 질병 프로세스에 대한 통찰력을 제공할 수 있었습니다.먼저, 시편 홀더에 블록을 블레이드 너비를 초과하지 않는 방식으로 정렬하여 진동이 느리게 움직일 때 블레이드가 가능한 최소 거리를 앞으로 이동할 수 있도록 합니다. 시편 홀더에 슈퍼 접착제 라인을 적용하여 접착제 디스펜서의 끝을 사용하여 얇은 층을 만든 다음 조직 블록을 접착제에 뒤집어 조직에 가까운 측면이 위쪽으로 향하도록 합니다. 블록을 부드럽게 밀어 3 분 동안 접착제를 건조하게.다음으로, 나사로 진동에 접시를 부착하고 블레이드가 블록의 길이를 넘어 겨우 그 위에 움직일 수 있도록 이동중인 블레이드 높이와 거리를 조정합니다. 덩어리를 집게로 부드럽게 움직여 접착제가 건조되었는지 확인한 다음, 블레이드가 덮일 때까지 차가운 세포 외 용액으로 진동 트레이를 채웁니다. 진동을 설정하여 120 마이크로미터 두께의 슬라이스를 만들고 시작한 다음 조직 블록에서 나오는 조각을 관찰합니다.페인트브러시나 집게를 아래에 놓고 블록에서 부동할 때 슬라이스를 들어 올리고, 3밀리몰러 D-포도당과 트립신 억제제를 함유한 크렙스 링거 중탄산염 버퍼에 슬라이스를 놓습니다. 슬라이스가 들어 있는 플레이트를 로커에 놓고 실온에서 25RPM에서 1시간 동안 배양합니다. 슬라이스를 더 오래 보관해야 하는 경우 슬라이스를 슬라이스 배양 배지 의 15 밀리리터에 놓고 접시를 인큐베이터에 놓습니다.같은 날 의 연구를 위해 37°C의 준비된 슬라이스를 배양하거나 실험 전 최소 한 시간 동안 섭씨 24도에서 섭씨 37도로 배양되는 슬라이스를 이송한다. 기록 하기 전에 적어도 한 시간 현미경을 전환 하 고 37 섭씨 37 도 무대 상단 인큐베이터를 평형. 무대의 슬라이스가 들어 있는 커버 글래스 하단 페트리 접시를 고정합니다.브라이트필드 모드에서 10X 목표를 설정하여 현미경에 초점을 맞추고 슬라이스 내에서 주황색 갈색 타원형을 찾아 밝은 필드 모드를 사용하여 섬을 찾습니다. 현미경의 터치 스크린 컨트롤러에 CS 버튼을 눌러 현미경을 공초점 이미징으로 전환합니다. 반사도를 사용하여 섬을 보려면 638 레이저 검출기 및 PMT 검출기를 켭니다.레이저 전원을 1~2% 설정하고 노치 필터를 끕니다. 405 나노미터 레이저 및 PMT 검출기를 사용하여 핵산 얼룩을 관찰한다. CD8 항체 검출및 488 나노미터 레이저 및 하이브리드 검출기를 위한 하이브리드 검출기는 인슐린 테트라머를 볼 수 있다.스테이지 컨트롤러의 X 및 Y 노브를 사용하여 시야에 관심 있는 별의 중심을 이용하여 센터. 관심 있는 것이 있으면 20X 목표로 전환하고 확대하여 이 점은 프레임의 대부분을 차지합니다. 아일렛의 z 스택을 가지고, 다음 세포가 살아 있고 모든 주변 면역 세포가 초점을 맞추고있는 최고의 광학 섹션을 찾을 수 있습니다.현미경을 XYZT 모드에서 기록하도록 설정하고 설정을 최적화하여 몇 시간 동안 20분마다 선택한 단계의 z 스택을 기록합니다. 췌장 조직 조각의 섬은 밝은 필드를 사용하여 시각화하고 빛 현미경 을 반사했다. 섬내 인슐린은 세분성을 증가시키고 다량의 반사된 빛의 흡수를 일으켜 섬의 가시성을 증가시킨다.살아있는 인간 췌장 조직 조각의 생존성은 염색에 의해 평가되었습니다. 살아있는 세포는 녹색으로 표시되고 죽은 세포는 파란색으로 표시됩니다. 생존가능성에 대한 또 다른 긍정적인 지표는 관찰 가능한 기초 활동입니다.살아있는 췌장 슬라이스가 세포 투과성 칼슘 지표로 로드되었을 때, 포도당 자극은 마우스와 인간 췌장 조각 모두에서 관찰되었다. 포도당 자극 중 개별 세포의 형광도 정량화되었다. 손상되지 않은 병은 디티존 염색 및 반사된 광 현미경 검사를 사용하여 관찰되었다.병에 걸린 섬은 면역 세포 침투 및 세포 죽음 때문에 세분성을 잃기 시작합니다. 면역 세포 인구는 CD8 항체 및 인슐린 테트라머 염색을 사용하여 확인할 수 있습니다. 공동 염색은 세포가 인슐린 항원을 구체적으로 표적으로 하는 이펙터 T 세포임을 나타낸다.이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 항상 용액 프로테아제 억제제에 슬라이스를 유지하는 것입니다. 이 절차에 따라 면역 세포 실험에 있는 수많은 기능은 면역 세포 상호 작용및 아슬렛 기능의 효력을 공부할 수 있도록 수행될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

연구

면역학 및 감염병학

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 Murine 췌 장 섬 세포 기반 검사

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...