Name: observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Esta pesquisa foi realizada com o apoio da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), um projeto colaborativo de pesquisa de diabetes tipo 1 patrocinado pela JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e o Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Os conteúdos e opiniões expressos são de responsabilidade de seus autores e não refletem necessariamente a visão oficial do nPOD. As Organizações de Aquisição de Órgãos (OPO) em parceria com a nPOD para fornecer recursos de pesquisa estão listadas em http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Obrigado ao Dr. Kevin Otto, universidade da Flórida, por fornecer o vibratome usado para gerar fatias de rato.

NOTAs: Todos os protocolos experimentais que utilizam camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida (201808642). Seções pancreáticas humanas de doadores de tecidos de ambos os sexos foram obtidas através da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD), universidade da Flórida. A pancreata humana foi colhida de doadores cadavéricos de órgãos por organizações certificadas de aquisição de órgãos em parceria com a nPOD de acordo com as ...

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	<li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders.">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li><li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics,+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes.">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li><li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes:+etiology+and+reversibility.">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li><li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases.">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Panzer, J. K., Cohrs, C. 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M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration.">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).</li><li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+persisting+&#946;+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis.">Dysfunction of persisting &#946; cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).</li><li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology.">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li><li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li><li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses.">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li><li>Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).</li><li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine,+porcine,+and+bovine+islets.">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices.">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li><li>G&#225;l, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice.">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).</li><li>Sto&#382;er, A., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Sto&#382;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices.">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).</li><li>Fr&#252;h, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization.">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).</li><li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion.">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations.">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li><li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ.">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2012).</li></ol>

O objetivo deste protocolo é explicar a geração de fatias de pâncreas e os procedimentos necessários para empregar as fatias em estudos funcionais e imunológicos. Há muitos benefícios em usar fatias pancreáticas vivas. No entanto, existem várias etapas críticas que são essenciais para que o tecido permaneça viável e útil durante os protocolos de experimento descritos. É imperativo trabalhar rapidamente. O tempo entre injetar o pâncreas e gerar as fatias no vibratome deve ser minimizado para manter a viab...

O envolvimento do pâncreas é pathognomônico a doenças como pancreatite, T1D e T2D1,2,3. O estudo da função em ilhotas isoladas geralmente envolve a remoção das ilhotas de seu ambiente circundante4. O método de fatia de tecido pancreático vivo foi desenvolvido para permitir o estudo do tecido pancreático, mantendo microambientes intactos de ilhotas e evitando o uso de procedimentos estressantes de isolamento de ilhotas5,6,7. Fatias de tecido pancreático do tecido doador humano têm sido usadas com sucesso para estudar T1D e demonstraram processos de perda e disfunção de células beta, além da infiltração de células imunes8,9,10,11,12,13. O método de fatia de tecido pancreático vivo pode ser aplicado tanto no tecido pancreático humano5,6,8. As fatias de tecido pancreático humano de tecidos doadores de órgãos são obtidas através de uma colaboração com a Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD). As fatias do mouse podem ser geradas a partir de uma variedade de cepas diferentes de mouse.
Este protocolo se concentrará na recombinação diabética não obesa ativando gene-1-nulo (NOD). Rag1-/-) e receptor de células T transgênicos (AI4) (NOD. Rag1-/-. Cepas de camundongos AI4 α/β). ACENO. Os camundongos são incapazes de desenvolver células T e B devido a uma interrupção no gene ativador de recombinação 1 (Rag1)14. ACENO. Rag1-/-. Camundongos aI4 α/β são usados como modelo para diabetes tipo 1 acelerado porque produzem um único clone de células T que tem como alvo um epítope de insulina, resultando em infiltração consistente de ilhotas e desenvolvimento rápido de doenças15. O protocolo aqui apresentado descreve procedimentos para estudos funcionais e imunológicos utilizando fatias pancreáticas humanas e de camundongos vivas através da aplicação de abordagens de microscopia confocal. As técnicas aqui descritas incluem avaliações de viabilidade, identificação e localização de ilhotas, registros citosóicos do Ca2+, bem como coloração e identificação de populações de células imunes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#3 Style Scalpel Handle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-100</td>
			<td>HEPES Buffer, 1M Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Untreated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>301029</td>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 305109</td>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverglass-bottom Petri dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>199898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>CaCl2 (dihydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Pinhole&#8201;= 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512&#8201;&#215;&#8201;512 pixel resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>C6H12O6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddiH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 35 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather No. 10 Surgical Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7204410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluo-4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Control Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>45198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>C8H18N2O4S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-395-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-7440</td>
			<td>&#160;Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34705</td>
			<td>Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers, 2-Ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>This kit contains the calcein-AM live cell dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>MgSO4 (heptahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Heated Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-1</td>
			<td>Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>GE</td>
			<td>JES1460DSWW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 Paintbrush</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10269140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td>Imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overnight imaging chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20012050</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-labeled insulin tetramer</td>
			<td>Emory Tetramer Research Core</td>
			<td>sequence YAIENYLEL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71998</td>
			<td>For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque low melting-point agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50101</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor (dynamic imaging)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4 (monohydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Adapter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SA-20MW-AL</td>
			<td>To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>IC90 E MSV266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S34857</td>
			<td>blue-fluorescent nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357575</td>
			<td>Falcon&#8482; Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VCS-8</td>
			<td>System for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td>Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices

As fatias vivas de tecido pancreático permitem o estudo da fisiologia da ilhota e funcionam no contexto de um microambiente de ilhotas intactos. As fatias são preparadas a partir de tecido pancreático humano vivo e rato embutido em agarose e cortado usando um vibratome. Este método permite que o tecido mantenha viabilidade e função, além de preservar patologias subjacentes como diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D). O método de fatia permite novas direções no estudo do pâncreas através da manutenção das estruturas complexas e de diversas interações intercelulares que compõem os tecidos endócrinos e exócrinos do pâncreas. Este protocolo demonstra como realizar a coloração e microscopia de lapso de tempo de células imunes endógenas vivas dentro de fatias pancreáticas, juntamente com avaliações da fisiologia da ilhota. Além disso, essa abordagem pode ser refinada para discernir populações de células imunes específicas para antígenos de células ilhotas usando grandes reagentes complexos-multimers de histocompatibilidade.

Este protocolo produzirá fatias de tecido pancreático ao vivo adequadas tanto para estudos de funcionalidade quanto para gravações de células imunes. A aparência de fatia em campo brilhante e sob luz refletida são mostradas na Figura 1A,B. Como discutido, as ilhotas podem ser encontradas em fatias usando luz refletida devido à sua granularidade aumentada que ocorre devido ao seu teor de insulina (Figura 1C) e são claramente observadas e...

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Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Nosso protocolo ajudará a responder o impacto que as interações com células imunes têm na funcionalidade da ilhota. O método de fatia de tecido pancreático vivo permite que a fisiologia e a função da ilhota sejam estudadas, mantendo os tecidos subjacentes às patologias e ao microambiente nativo. Esse método poderia fornecer insights sobre os processos da doença de doenças pancreáticas, como pancreatite, diabetes tipo I e diabetes tipo II.Para começar, organize os blocos no suporte da amostra de forma que eles não excedam a largura da lâmina, garantindo que a lâmina possa mover para a frente a distância menos possível quando o vibratome se mover lentamente. Aplique uma linha de super cola no suporte da amostra, fazendo uma camada fina usando a extremidade do distribuidor de cola, em seguida, vire os blocos de tecido sobre a cola para que o lado próximo ao tecido fique virado para cima. Empurre suavemente os blocos e deixe a cola secar por três minutos.Em seguida, conecte a placa ao vibratome com um parafuso e ajuste a altura e distância da lâmina que está sendo percorrida para que a lâmina se mova sobre o comprimento dos blocos e apenas pouco acima deles. Empurre suavemente os blocos com os fórceps para verificar secar a cola e, em seguida, encha a bandeja de vibratome com uma solução extracelular resfriada até que a lâmina esteja coberta. Coloque o vibratome para fazer fatias de 120 micrômetros de espessura e inicie-o, em seguida, observe as fatias saindo dos blocos de tecido.Levante as fatias quando flutuarem para fora do bloco colocando um pincel ou fórceps abaixo delas e coloque as fatias no tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo três milimães de glicose D e inibidor de trypsina. Coloque as placas contendo as fatias em um roqueiro e incubar em temperatura ambiente por uma hora a 25 RPM. Se as fatias precisarem ser mantidas por mais tempo, coloque as fatias em 15 mililitros de cultura de fatia e coloque a placa em uma incubadora.Incubar as fatias preparadas a 37 graus Celsius para estudos no mesmo dia ou transferir as fatias que são cultivadas a 24 graus Celsius durante a noite para 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes do experimento. Ligue o microscópio pelo menos uma hora antes da gravação e equilibre a incubadora superior do palco para 37 graus Celsius. Fixar a placa de vidro de vidro de cobertura contendo a fatia no palco.Concentre o microscópio definindo o objetivo de 10X no modo brightfield e localize as ilhotas usando o modo de campo brilhante procurando ovais cor-de-laranja dentro da fatia. Mude o microscópio para imagens confocal, pressionando o botão CS no controlador de tela de toque do microscópio. Para ver as ilhotas usando reflectância, ligue o detector de laser 638 e o detector PMT.Defina a potência do laser entre um e 2% e desligue os filtros de entalhe. Use o laser de 405 nanômetros e o detector PMT para observar a mancha de ácido nucleico. O detector híbrido para a detecção de anticorpos CD8 e o laser de 488 nanômetros e detector híbrido para visualizar o tetramer de insulina.Centralize a ilhota de interesse no campo de visão usando os botões X e Y do controlador de palco. Uma vez localizada uma ilhota de interesse, mude para o objetivo de 20X e amplie para que a ilhota assuma a maior parte do quadro. Pegue uma pilha de z da ilhota, então encontre as melhores seções ópticas onde as células estão vivas e todas as células imunes circundantes estão em foco.Defina o microscópio para gravar no modo XYZT e otimize as configurações para gravar uma pilha de z das etapas selecionadas a cada 20 minutos durante um período de várias horas. As ilhotas em uma fatia de tecido pancreático foram visualizadas usando campo brilhante e microscopia de luz refletida. A insulina nas ilhotas aumenta a granularidade e causa absorção de grandes quantidades de luz refletida, aumentando a visibilidade das ilhotas.A viabilidade de uma fatia de tecido pancreático humano vivo foi avaliada pela coloração. As células vivas são indicadas em verde e as células mortas em azul. Outro indicador positivo para viabilidade é a atividade basal observável.Quando uma fatia pancreática viva foi carregada com um indicador de cálcio permeável celular, a estimulação de glicose foi observada em fatias de camundongos e pancreáticos humanos. A fluorescência de células individuais durante a estimulação da glicose também foi quantificada. Ilhotas intactas e doentes foram observadas utilizando-se manchas de dithizone e microscopia de luz refletida.As ilhotas doentes começam a perder granularidade devido à infiltração de células imunes e morte celular. Populações de células imunes podem ser identificadas usando anticorpos CD8 e coloração de tetramer de insulina. A co-coloração indica que as células são efeitos ou células T que estão especificamente mirando o antígeno de insulina.A coisa mais crítica a ser lembrada neste procedimento é manter as fatias em soluções inibidoras de protease o tempo todo. Após esse procedimento, inúmeras funcionalidades em experimentos com células imunes podem ser realizadas permitindo que o efeito das interações com células imunes e a função de ilhotas sejam estudados.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Imunologia e Infecção

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...