Name: workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum berlin
Uploaded: 2021-03-03T14:00:00
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Wir danken den zahlreichen Nutzergruppen, die CFS-Kampagnen am HZB durchgeführt haben. Ihr Feedback führte zur schrittweisen Verbesserung unseres Workflows. Wir danken der Drug Design Group an der Universität Marburg und der FragMAX Group am MAX IV, denn die enge Zusammenarbeit war die Grundlage für mehrere Entwicklungssprünge für verbesserte CFS. Wir danken für die Unterstützung durch das Bundesministerium für Bildung und Wissenschaft (BMBF) über die Projekte Frag2Xtal und Frag4Lead (Nummern 05K13M1 und 05K16M1). Darüber hinaus sind wir dankbar für die Unterstützung über iNEXT-Discovery, Projektnummer 871037, gefördert durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission.

1.Einweichen von Kristallen
<ol><li>Nehmen Sie die Siebplatte (hier eine F2X-Entry Screen Plate, Abbildung 2)aus dem -20 °C Gefrierschrank und legen Sie sie für ca. 30 min auf die Bank/den Tisch, um sie auf Raumtemperatur vorzuwärmen und so Kondensationsfeuchtigkeit zu vermeiden.</li>
	<li>Ordnen Sie den Arbeitsplatz mit zwei eng angeordneten Mikroskopen und allen benötigten Werkzeugen an (Abbildung 3A). Die Materialien sind in der Materialtabelleaufgeführt.</li>
	<li>Wählen Sie 3-4 Schlaufen der entsprechenden Größe für den Transfer der einzuweichenden Kristalle und platzieren Sie sie in der Nähe der Mikroskope.</li>
	<li>Füllen Sie die Glasfleckplattenhohlräume mit deionisiertem oder destilliertem Wasser.</li>
	<li>Bereiten Sie 5 ml Einweichlösung vor.</li>
	<li>Schneiden Sie den auf Raumtemperatur vorgewärmten Beutel der Siebplatte auf.</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckel und die Folie von der Siebplatte, während Sie die Platte auf der Bank / dem Tisch halten.</li>
	<li>Dekantieren Sie die 5 ml Einweichlösung im Reagenzbehälter.</li>
	<li>Füllen Sie jeden der 96 Behälter mit 40 μL Einweichlösung mit der 12-Kanal-Pipette.</li>
	<li>Legen Sie den EasyAccess Frame auf die Siebplatte und befestigen Sie ihn mit den mitgelieferten Klemmen, indem Sie sie auf die linke und rechte Seite des Geräts schieben. HINWEIS: Der EasyAccess Frame ist ein spezielles Gerät zur Handhabung mehrerer Kristalle, das am HZB14entwickelt wurde. Es ermöglicht einen einfachen Zugang zu jedem Brunnen, indem die beweglichen Fliesen verschoben werden, während die anderen Brunnen vor Verdunstung geschützt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Siebplatte (inkl. EasyAccess Frame) unter das erste Mikroskop und die Kristallisationsplatte inklusive der einzuweichenden Kristalle unter das zweite Mikroskop.</li>
	<li>Schieben Sie das Bohrrohr A1 der Siebplatte auf, indem Sie die jeweilige Acrylglasfliese des EasyAccess Rahmens entweder mit einem Finger oder dem mitgelieferten Stiftwerkzeug bewegen.</li>
	<li>0,4 μL Einweichlösung aus dem Reservoir in den Fragmentbrunnen (obere linke Linse) mit einer frischen Pipettenspitze geben. Überprüfen Sie durch das Mikroskop, ob der Tropfen das getrocknete Fragment bedeckt, damit es sich auflösen kann. HINWEIS: Alternativ kann dieser Schritt mit einem Pipettierroboter vor der Montage des EasyAccess Rahmens durchgeführt werden. Auf diese Weise konnten die einweichenden Tropfen aller Brunnen in einem automatischen Verfahren platziert werden. Die Autoren empfehlen jedoch, die Einweichlösung direkt vor dem Einweichschritt wie beschrieben hinzuzufügen, um sicherzustellen, dass das Fragment langsam und in Gegenwart des Kristalls solubiliert. Dadurch wird vermieden, dass der Kristall beim Transfer in einen Tropfen mit hoher Fragmentkonzentration einen plötzlichen Schock erfährt.</li>
	<li>Unter dem zweiten Mikroskop die Dichtfolie der Kristallisationsplatte an einer der Vertiefungen, die die Zielkristalle enthalten, aufschneiden.</li>
	<li>Übertragen Sie zwei Kristalle mit einer entsprechend großen Schlaufe, die auf dem Kristallstab montiert ist, auf die Vertiefung A1 der Siebplatte unter dem ersten Mikroskop.</li>
	<li>Waschen Sie die Schlaufe in der vorbereiteten Glasfleckplatte und trocknen Sie sie durch sanftes Berühren des Gewebes. Tun Sie dies nach jedem Transfer, um eine Kreuzkontamination mit fragmenthaltigen Einweichlösungen zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie das Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Kristalle richtig platziert wurden.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Brunnen fort (z. B. B1).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.13-1.18 mit allen 96 Vertiefungen der Siebplatte, bis jeder Einweichtropfen zwei Kristalle enthält.</li>
	<li>Entfernen Sie die Siebplatte (inkl. EasyAccess Frame) unter dem Mikroskop und legen Sie sie auf die Bank/den Tisch.</li>
	<li>Entfernen Sie den EasyAccess-Rahmen von der Siebplatte.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Siebplatte mit Siegelfolie und legen Sie sie in den Kristallisationsinkubator bzw. Schrank, wo die Kristalle gezüchtet wurden.</li>
	<li>Inkubieren für die optimierte Einweichzeit. Übernachtung ist in der Regel bequem.</li>
	<li>(optional) Herstellung von ca. 40 Apokristallen (d.h. Mock Soaking)<ol>
<li>Nehmen Sie eine MRC-3-Linse 96-Well-Low-Profile-Kristallisationsplatte und füllen Sie zwei Säulen mit 40 μL Einweichlösung pro Vertiefung mit der 12-Kanal-Pipette.</li>
		<li>Legen Sie den EasyAccess-Rahmen auf die Kristallisationsplatte und befestigen Sie ihn mit den mitgelieferten Klemmen, indem Sie sie auf die linke und rechte Seite des Geräts schieben.</li>
		<li>Schieben Sie die Acrylglasfliese von Brunnen A1 auf.</li>
		<li>Legen Sie 0,4 μL Einweichlösung in jede der beiden linken Linsen des Brunnens.</li>
		<li>Übertragen Sie 2-3 Kristalle auf jeden Tropfen. Nach jedem Transfer die Schlaufe in der vorbereiteten Glasfleckplatte waschen und durch sanftes Berühren des Gewebes trocknen.</li>
		<li>Wechseln Sie zum nächsten Brunnen (z. B. B1).</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.24.4-1.24.6, bis etwa 40 Kristalle für die Inkubation bereit sind.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kristallisationsplatte (inkl. EasyAccess Frame) unter dem Mikroskop auf die Bank/den Tisch und entfernen Sie den EasyAccess Frame.</li>
		<li>Verschließen Sie die Kristallisationsplatte mit Einer Dichtfolie und legen Sie sie in den oben genannten Kristallisationsinkubator oder Schrank.</li>
		<li>Inkubieren Sie für die gleiche Zeit wie die Siebplatte.</li>
	</ol></li>
</ol>2.Ernte von Kristallen
<ol><li>Nehmen Sie die Inkubationsplatte(n) aus dem Inkubator bzw. Schrank heraus.</li>
	<li>Ordnen Sie den Arbeitsplatz mit einem Mikroskop und allen benötigten Werkzeugen an (Abbildung 3B). Die Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Unipuck-Schaum-Dewar mit 3 Unipuck-Deckeln (d.h. Probengehäusen) vor und füllen Sie ihn mit flüssigem Stickstoff (LN2). HINWEIS: Beachten Sie die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen für die Arbeit mit LN2 (d. h. tragen Sie eine Schutzbrille und verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung). Es ist am besten, LN2 mehrmals während der Sitzung frisch zu bekommen, um Wasserkondensation in der LN2 Speicherdose zu vermeiden. Stellen Sie während des gesamten folgenden Verfahrens sicher, dass die LN2-Ebene im Schaum-Dewar immer den oberen Rand des Dewars erreicht. Stellen Sie außerdem sicher, dass der LN2 eisfrei ist. ersetzen häufig den LN2 (z. B. einmal alle 45 Minuten) oder spätestens dann, wenn sich Eis ansammelt. Dann füllen Sie den zweiten Schaumtau und übertragen Unipucks darauf. Entleeren Sie den eisigen Schaum und entfernen Sie Resteis und Feuchtigkeit mit dem Föhn.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folie von der Siebplatte und legen Sie den EasyAccess Frame darauf.</li>
	<li>Schiebe gut A1 auf.</li>
	<li>Ernte zwei Kristalle aus dem Tropfen und kühle sie in LN2 (einzeln) ab, indem du sie mit einer schnellen vertikalen Bewegung in den LN2 tauchst und dann die Probe in die richtige Puckposition einführst. Machen Sie relevante Notizen auf dem Probenverfolgungsblatt.</li>
	<li>Kryoschutzschritt (falls für die Zielkristalle erforderlich). Führen Sie in diesem Fall diesen Schritt anstelle von 2.6 aus.<ol>
<li>Legen Sie 0,4 μL Einweichlösung einschließlich Kryoschutzmittel auf die untere linke Linse des Brunnens.</li>
		<li>Ziehen Sie die Schlaufe mit einem Kristall, der vom Tropfen in der oberen linken Linse montiert ist, langsam durch die Lösung in der unteren linken Linse, während Sie den Kristall in der Schleife halten, und dann blitzkühl in LN2. Ernte auf diese Weise zwei Kristalle. HINWEIS: Stellen Sie in den Schritten 2.6 und 2.7 sicher, dass die Zeit, in der sich der Kristall in der Schleife befindet und der Luft ausgesetzt ist, sehr kurz gehalten wird. Das Eintauchen (d.h. der vertikale Abfall der Probein den LN2-gefüllten Dewar) sollte so schnell wie möglich erfolgen. Dies gewährleistet eine hohe Probenqualität und die Vermeidung von Eisringen in den Daten. Verfolgen Sie die Proben (d. H. Beachten Sie, ob Kristalle Schäden haben usw.), um entweder Duplikate für die folgenden Röntgenmessungen zu priorisieren, verwenden Sie die Vorlage dafür. Auch wenn Kristalle durch das Einweichen Risse, "Haare" oder andere Defekte aufweisen, können sie dennoch verwendet werden und sollten immer geerntet werden. Falls Kristalle in mehrere Stücke zerbrechen, sollten zwei der größten / am besten aussehenden Stücke geerntet werden. Abbildung 5 zeigt einige Beispiele, wie solche Kristalle aussehen können. Alle gezeigten Kristalle ergaben in der jeweiligen Kampagne11noch nützliche Datensätze, die unterstreichen, dass es sich lohnt, Kristalle nach der Einweichbehandlung zu ernten, auch wenn erhebliche morphologische Veränderungen aufgetreten sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gehen Sie zum nächsten Brunnen und wiederholen Sie die Schritte 2.5 - 2.6./2.7, bis alle drei Pucks gefüllt sind.</li>
	<li>Fügen Sie die Unipuck-Basen nach dem Vorkühlen in LN 2 auf die Deckelhinzu.</li>
	<li>Lagern Sie die Unipucks in Lagerregalen in einem Transport- oder Lagerdewar.</li>
	<li>Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis alle Vertiefungen der Siebplatte verarbeitet sind.</li>
	<li>(optional) Wenn nachgeweichte Kristalle zubereitet wurden, ernten Sie sie auf ähnliche Weise wie zuvor beschrieben. HINWEIS: Wenn zwei Kristalle für jede der 96 Bedingungen der Siebplatte blitzgekühlt werden könnten, gibt es Platz für 32 mock-getränkte Apo-Kristalle, um die 14 Unipucks zu füllen.</li>
	<li>Lagern Sie die Unipucks bis zur Messung in LN2.</li>
</ol>3.Datenerhebung
<ol><li>Übertragen Sie die Unipucks auf die Beamline BL14.1. Wenn SPINE-Pucks in Schritt 2 verwendet wurden, übertragen Sie sie auf beamline BL14.2.</li>
	<li>Führen Sie Standardmessungen an der Beamline unter Verwendung der unten angegebenen spezifischen Empfehlungen durch. Details zur Anlage und zum Experimentsteuerungsprogramm MXCuBE2 wurden zuvorvorgestellt 15,16. Abbildung 4 zeigt das Innere der Versuchsstälche der Beamlines BL14.1 und BL14.2 sowie einen Beispiel-Screenshot der MXCuBE2-Steuerungssoftware an der beamline BL14.1.<ol>
<li>Um die Zeiteffizienz und den Durchsatz zu maximieren, überspringen Sie die Sammlung von Testbildern. Der Abstand von Probe zu Detektor wird auf einen Wert festgelegt, der für die in früheren Experimenten ermittelte obere Auflösungsgrenze des Kristallsystems geeignet ist. Wenn die Datenerfassungsstrategie vorher nicht optimiert wurde, sammeln Sie 1800 Bilder von jeweils 0,2 Grad mit einer Belichtungszeit von 0,1 s pro Bild.</li>
		<li>Testen Sie idealerweise die Datenerfassungsstrategie in früheren Experimenten mit mock-getränkten Apokristallen. Für höhere Symmetrieraumgruppen ergeben 1200 Bilder oder sogar 900 Bilder (d.h. 240° bzw. 180°) bereits komplette Datensätze mit guten Statistiken, unabhängig vom Startwinkel der Datenerhebung. HINWEIS: Höhere Redundanz und feinere Slicing können zu einer überlegenen Datenqualitätführen 17. Die Verwendung dieser hier vorgeschlagenen Strategie "genug, aber nicht mehr" ist jedoch ein hervorragender Kompromiss zwischen Qualität, Datenerfassungszeit sowie Rechenanforderungen für die spätere Analyse. Auf die beschriebene Weise sind an den Beamlines BL14.1 und BL14.2 200 Datensammlungen in 24 Stunden gut möglich. Dennoch sollten Proben priorisiert werden.</li>
		<li>Sammeln Sie zunächst Beugungsdatensätze für eine Probe pro Fragmentbedingung, basierend auf der Priorisierung in Schritt 2.6./2.7 (d. h. sammeln Sie die Daten für das höher priorisierte Duplikat).</li>
		<li>Für die Experimente in 3.2.3, bei denen die Datenerfassung fehlgeschlagen ist, die Beugung verloren ging oder schwere Eisringe auftraten, sammeln Sie Daten für die zweite doppelte Probe des jeweiligen Fragmentzustands.</li>
		<li>Sammeln Sie Beugungsdatensätze von Apokristallen (sofern gemäß den Schritten 1.24 und 2.12 vorbereitet).</li>
		<li>Sammeln Sie Beugungsdatensätze der verbleibenden Duplikate jeder Fragmentbedingung.</li>
		<li>Passen Sie im MXCuBE2-Programm die Datensatzidentifikatoren einer CFS-Kampagne an folgendes Muster an: <protein>-<library>-[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (z. B. MyProtein-F2XEntry-B05a, wobei "B05" für den Brunnen (d. H. Die Fragmentbedingung im Bildschirm) und das folgende "a" für das erste Duplikat steht.)</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Datenverarbeitung
<ol><li>Für die Datenanalyse der CFS-Kampagne verwenden Sie FragMAXapp, eine webbasierte Lösung zur Steuerung einer Multiplex-Analyse zur Verarbeitung von Auto-Refinement und PanDDA-Trefferauswertung von CFS-Daten18 (Lima et al. FragMAXapp, unveröffentlichte Daten). In der am HZB eingesetzten FragMAXapp-Version stehen folgende Programme/Pipelines zur Verfügung: XDSAPP19, Xia2-DIALS und Xia2-XDS20, fspipeline7, DIMPLE21, Phenix LigFit22, PanDDA13,23. Verwenden Sie ein gut verfeinertes Inputmodell des Zielproteins als Input für die automatische Verfeinerung; Andernfalls führen Sie eine sorgfältige Verfeinerung eines hochauflösenden, mit Mock getränkten Kristalls durch, der während der Kampagne gesammelt wurde. HINWEIS: Ein Schlüsselelement für die Trefferidentifikation ist PanDDA. Details werden in den jeweiligenPublikationen 13,23erläutert. Kurz gesagt, PanDDA berechnet automatisch Elektronendichtekarten eines Datensatzes in einer CFS-Kampagne. Diese werden dann als unverbindliche Fragmentbedingungen angenommen und gemittelt, um das sogenannte Grundzustandsmodell zu erzeugen. Das Grundzustandsmodell wird dann verwendet, um lokale Diskrepanzen zwischen jeder Elektronendichtekarte und der Grundzustandskarte unter Verwendung von Voxel-assoziierten Z-Scores abzuleiten. Für Gebiete mit hohen Z-Werten wird dann durch fein abgestimmte Subtraktion der Grundzustandsdichte von der jeweiligen Karte eine sogenannte PanDDA-Karte erstellt. Dies verbessert die Sichtbarkeit von Fragmentbindungsereignissen weitgehend.</li>
	<li>Um das Ergebnis von PanDDA zu maximieren, verwenden Sie einen zweistufigen Ansatz. Erstens, einen PanDDA-Lauf (pandda.analyse) mit Standardeinstellungen durchführen. Selbst wenn mock-getränkte Kristalle gesammelt wurden, wird ihre Identität nicht als Parameter einbezogen (was dennoch möglich ist), um eine unvoreingenommene Generierung des Grundzustandsmodells durch PanDDA aus allen verfügbaren Daten zu ermöglichen. Anschließend werden die Ausgabedaten vom Anwender über eine sogenannte PanDDA-Inspektion in Coot24ausgewertet. Hier sollten Treffer mit relativ hoher Sicherheit notiert werden, die den ersten Schritt abschließen.</li>
	<li>Führen Sie zweitens den Schritt pandda.analyse erneut aus, ohne die vorläufigen Treffer (die im ersten Schritt ermittelt wurden) aus dem Grundzustandsmodell über die Befehlszeilenoption --exclude_from_characterisation="<list-of-bound-dataset-ids>". Weitere Details finden Sie auf den PanDDA-Hilfeseiten (https://pandda.bitbucket.io/). Auf diese Weise werden Datensätze, die klare Treffer sind und somit das Grundzustandsmodell verschleiern würden, wenn sie enthalten wären, nicht berücksichtigt. Dies führt zu einem verbesserten Grundzustandsmodell und damit zu insgesamt verbesserten Ergebnissen. Schließlich wird eine gründliche PanDDA-Inspektion durchgeführt, um die Trefferidentifikation abzuschließen. HINWEIS: FragMAXapp enthält auch eine Ausgabeoption, um die modellierten gebundenen Zustände zu speichern oder Daten für die PDB-Übermittlung vorzubereiten, weitere Details finden Sie auf den FragMAX-Webseiten (https://fragmax.github.io/).</li>
</ol>

<ol>
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Eine Patentanmeldung zum EasyAccess Frame hat das Helmholtz-Zentrum Berlin beim Deutschen Patent- und Markenamt unter der Registrierungsnummer DE 10 2018 111 478.8 eingereicht. Darüber hinaus wurde eine internationale Patentanmeldung über den PCT-Weg unter Verwendung der Priorität des deutschen Patents eingereicht.

Für eine erfolgreiche CFS-Kampagne ist es unerlässlich, die beschriebenen Voraussetzungen einzuhalten (siehe Einführung). Für das reproduzierbare Wachstum vieler gut beugbarer Kristalle wird ein zuverlässiges Kristallisationssystem benötigt, und eine gut verfeinerte Struktur wird als Input-Apo-Modell für die automatisierte Verfeinerung benötigt. Es ist auch wichtig zu überprüfen, ob die Zielstelle auf dem Protein (aktive Stelle oder Grenzflächenbereich) für Fragmente im Kristallgitter zugänglich ist. Entscheidend ist, die Einweichbedingungen im Vorfeld zu optimieren, um sicherzustellen, dass das Einweichen die Kristallqualität nicht wesentlich verschlechtert. Die Vernachlässigung dieser Aspekte wird sehr wahrscheinlich zu einem suboptimalen Experiment führen, das von begrenztem Nutzen sein wird und im schlimmsten Fall eine Wiederholung des gesamten Experiments erfordert.
Das oben beschriebene Protokoll beschreibt die Verfahren, die während einer Standard-CFS-Kampagne befolgt werden. Wenn alle Voraussetzungen erfüllt sind, sollten mindestens 90% aller eingeweichten Kristalle in einem Beugungsexperiment eine hohe Beugung aufweisen. Ist dies nicht der Fall, können sich die Einweichzeiten auf wenige Stunden oder sogar Minuten verkürzen. Aufgrund der guten Löslichkeit der meisten Fragmente sollte dies ausreichen, um anständige Belegungswerte zu erhalten. Außerdem führt eine typische CFS-Kampagne zu einer Trefferquote von etwa 10% oder mehr. Für die F2X-Entry Screen Validierungskampagnen11 und laufende Nutzerkampagnen mit gleicher Bibliothek wurden noch höhere Trefferquoten beobachtet (20% und mehr, Daten nicht gezeigt).
Ein allgemeiner Vorbehalt des kristallographischen Fragmentscreenings ist das Vorhandensein kristallographischer Kontaktstellen. Diese könnten entweder a priori bekannte aktive Stellen verschließen (vor dem Screening zu überprüfen, siehe oben), oder diese Kontaktstellen bieten oft auch Taschen und Hot Spots, an denen sich Fragmente binden können. Solche Fragmenttreffer sind Artefakte des Kristallisationsgitters und binden wahrscheinlich nicht an das Protein in Lösung. Diese Ereignisse treten in der Regel häufiger in Einweichexperimenten auf als in Kokristallisationsexperimenten (wahrscheinlich aufgrund der höheren Fragmentkonzentrationen, die in Einweichexperimenten verwendet werden). Nach bisherigen Erfahrungen machen sie jedoch in der Regel nur einen geringen Teil der erzielten Treffer aus. In der F2X-Entry Screen-Validierungskampagne mit Endothiapepsin (EP) und dem spleißosomalen Protein-Protein-Komplex von Prp8RNaseH und Aar2 (AR) traten die meisten Treffer beispielsweise an vielversprechenden Stellenauf 11. Für EP befanden sich 27 der 37 beobachteten Bindungsereignisse an der aktiven Stelle (d.h. der Peptidspalte dieser Protease). Die 10 Fernbindungsereignisse umfassen zwei lösungsmittelexponierte Bindungsereignisse und acht Kristallkontaktbindungsereignisse (entsprechend fünf eindeutigen Treffern). Der Ausschluss dieser Kristallkontakt-Treffer würde immer noch eine Gesamtrate von 24% Unique Hits für die EP-Kampagne widerspiegeln. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Bindungsereignisse, die von einer bekannten aktiven Stelle entfernt sind (außer Kristallkontaktbindemitteln), möglicherweise auch interessant sein könnten (z. B. das Aufdecken neuer Hot Spots oder allosterischer Stellen des Proteins). Für die AR-Kampagne (in derselben Publikation) befanden sich von den 23 beobachteten Bindungsereignissen sieben an Kristallkontakten, eines an der direkten Grenzfläche der beiden Proteine, sieben an bekannten Protein-Protein-Interaktionsstellen mit anderen Bindungspartnern des größeren biologischen Kontextes (daher unterschiedliche Aufbaustadien des Spleißosoms), acht Bindungsereignisse zeigten zwei Hot Spots auf AR mit noch unbekannter Funktion und eines an einer lösungsmittelexponierten Oberfläche von Prp8RnaseH. Ohne die Ereignisse an Kristallkontakten und dem Prp8RnaseH-Singleton beträgt die Anzahl der potenziell nützlichen Bindungsereignisse 15 (entsprechend 14 eindeutigen Treffern), also eine Trefferquote von 15,6%. Diese Treffer können Ausgangspunkte für das Design von Protein-Protein-Interaktionsmodulatoren oder für Werkzeugverbindungen sein, die darauf abzielen, die beiden entdeckten Aar2-Hotspots zu erforschen. Zusammengenommen, auch im Einklang mit durchgeführten Nutzerkampagnen, muss oft nur ein geringer Teil der Treffer im kristallographischen Fragmentscreening als Artefakte außer Acht gelassen werden. Dies wird aber auch weitgehend zielabhängig sein.
Wenn die Trefferquote signifikant niedriger ist, kann dies auf eines der folgenden Probleme im Zusammenhang mit dem Zielprotein hinweisen. So wurde beispielsweise in einer CFS-Kampagne gegen eine virale Cysteinprotease eine Trefferquote von nur 3% beobachtet (Daten nicht gezeigt). Es stellte sich heraus, dass das verwendete Protein wahrscheinlich an seiner aktiven Stelle chemisch modifiziert war. In einem solchen Fall kann ein anderes Proteinpräparat das Problem lösen. Wenn Kristalle sehr DMSO-Intolerant sind, kann der F2X-Entry Screen auch ohne DMSO verwendet werden, obwohl die Ergebnisse bis zu einem gewissen Grad abweichen können. Die meisten Treffer, die in Gegenwart von DMSO erzielt wurden, werden auch in dessen Abwesenheit angezeigt. Es wird auch einige Treffer geben, die in Abwesenheit von DMSO nicht beobachtet werden können, obwohl sie in seiner Gegenwart beobachtet werden können. Und schließlich wird es einige geben, die nur in Abwesenheit von DMSO auftauchen.
Die größte Schwierigkeit tritt auf, wenn das Protein bei der Substanzbindung eine induzierte Passformbewegung erfährt. Höchstwahrscheinlich toleriert das Kristallgitter die Proteinbewegung nicht und die Kristalle zerfallen. In einem solchen Fall besteht die einzige Wahl darin, auf die Co-Kristallisation des Proteins und der Fragmente zurückzugreifen. Dies kann jedoch zu neuen Kristallformen führen. Daher wird ein Großteil der Automatisierung des gesamten Prozesses nicht mehr effizient funktionieren. Glücklicherweise ist bei den meisten CFS-Kampagnen, die bisher am HZB durchgeführt wurden, ein solches Problem nicht aufgetreten. Es kann sein, dass die schwache Bindung eines Fragments nicht genügend Energie liefert, um eine Proteinbewegung zu induzieren, insbesondere wenn die kristallisierte Konformation durch Kristallpackungskräfte stabilisiert wird.
Eine weitere schwerwiegende Einschränkung der Methode, auf die die Autoren bisher gestoßen sind, ist, wenn der Kristallisationscocktail (und damit die Einweichlösung) flüchtige Verbindungen enthält. Dann wird es nahezu unmöglich, das gesamte Kristallhandling sinnvoll durchzuführen.
Verschiedene Proteine können mehr oder weniger medikamentöse Stellen enthalten. Zum Beispiel werden Protein-Protein-Interaktionen in der Regel durch ausgedehnte flache Oberflächen vermittelt, die schwieriger zu zielen sind. Die Trefferrate der Fragmentbindung hängt daher wahrscheinlich von der Struktur der molekularen Oberfläche des Proteins ab. Im Extremfall enthält ein Protein möglicherweise keine geeigneten Oberflächen-Hotspots, die als Zielstellen für die Fragmentbindung dienen. So ergeben sich trotz eines akribisch durchgeführten Experiments keine Fragmenttreffer aus dem Screening. Auf eine solche Situation sind die Autoren jedoch bisher nicht gestoßen.
Grundsätzlich kann mit dem oben beschriebenen Protokoll der Kristalleinweich- und Ernteteil einer CFS-Kampagne in jedem Labor durchgeführt werden, das für die Kristallhandhabung ausgestattet ist. Dies unterscheidet die Methodik am HZB von anderen CFS-Einrichtungen und kann in einigen Fällen von Vorteil sein. Können die Kristalle beispielsweise an einem anderen Ort nicht einfach nachproduziert werden oder ist die Reise der Experimentatoren eingeschränkt (z.B. in einer weltweiten Pandemiesituation), wird den Anwendern am HZB daher das gesamte Equipment (Pucks, Werkzeuge, EasyAccess Frame, Probenhalter etc.) als tragbares Set zur Verfügung gestellt.
Die Anforderungen an eine große Anzahl von Probenhaltern und kryogenen Lagerkapazitäten werden jedoch in dedizierten CFS-Einrichtungen noch bequemer erfüllt. Darüber hinaus spricht die Notwendigkeit der Erfassung vieler Beugungsdatensätze stark für die Lokalisierung dieser Anlagen in der Nähe von Beamlines, die auf einen hohen Probendurchsatz ausgerichtet sind. Beispiele hierfür sind die Beamlines I04-1 an der Diamond Light Source und der dazugehörigen XChem-Anlage in UK8,25, die MASSIF-Beamlines an der ESRF in Frankreich26 oder die FragMAX-Anlage an der BioMAX-Beamline bei MAX IV in Schweden18.
In Zukunft könnte man sich vorstellen, CFS-Experimente ohne die Notwendigkeit einer Kristallhandhabung zu entwerfen. Erste Fortschritte in dieser Richtung wurden berichtet. Zum Beispiel durch akustischen Flüssigkeitstransfer, der das Mischen sowohl der kristallhaltigen Lösungen als auch der Fragmentlösungen direkt auf netzartigen Probenhaltern ermöglicht27. Ein anderer Ansatz wurde für das XFEL-basierte Liganden-Screening verwendet. In einem Proof-of-Principle-Experiment wurde eine Kristallaufschlämmung in Charge hergestellt und die Erfassung von Einweich- und Beugungsdaten auf einem Silizium-Fix-Target-Chip28durchgeführt. Diese Ansätze befinden sich jedoch noch in der Entwicklung und sind weit davon entfernt, auf eine breite Palette von Proteinzielen anwendbar oder für CFS-Einrichtungen routinemäßig machbar zu sein.
Mit dem Protokoll in dieser Arbeit wurden detaillierte Anweisungen zur erfolgreichen Durchführung von CFS-Kampagnen am HZB (und anderswo) skizziert und allgemeine Anleitungen und nützliche praktische Tipps zur Vorbereitung und Durchführung solcher Experimente mit höheren Erfolgschancen gegeben. Letztendlich tragen bessere Quoten und Erfolgsraten beim CFS-Screening wesentlich dazu bei, effizient Ansatzpunkte für die nachgelagerte Entwicklung von Werkzeugverbindungen oder Wirkstoffkandidaten zu schaffen.

Der erste Schritt in der Arzneimittelentwicklung ist das Screening von Verbindungen gegen ein zielgerichteter Ziel. Traditionell werden große Wirkstoffbibliotheken in der Größenordnung von 100.000-1.000.000 Einträgen in biochemischen Hochdurchsatz-Assays in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Diese Strategie wurde durch das fragmentbasierte Arzneimitteldesign (FBDD) ergänzt, eine neuere Methode, die in den letzten 20 Jahren einen steilen Anstieg nahm und aufgrund mehrerer inhärenter Vorteile der Methode1zu einer Mainstream-Strategie wurde, um qualitativ hochwertige Lead-Kandidaten zu generieren. Der Begriff "Fragment" bezieht sich auf ein kleines organisches Molekül, das typischerweise weniger als 20 Nicht-Wasserstoff- oder schwere Atome (HAs) enthält. Damit ist ein Fragment deutlich kleiner als die wirkstoff- oder bleiähnlichen Moleküle (in der Regel weniger als 30 HAs), die im herkömmlichen Hochdurchsatz-Screening untersucht werden. Fragmente sind bindemittel mit schwacher Affinität. Im Vergleich zu größeren Molekülen sind Fragmente jedoch vielseitiger, da selbst eine kleine Sammlung von ihnen den jeweiligen chemischen Raum von Molekülen gleicher Größe besser darstellen kann2. Auch die Entwicklung von Fragment-Screening-Treffern in Bleimoleküle ist wesentlich effektiver als die Optimierung bereits größererMoleküle 2,3,4,5. Das heißt, bis eine ausreichende Sensitivität des Nachweises möglich ist, kann das Screening von Fragmenten effizient eingesetzt werden und liefert qualitativ hochwertige Ansatzpunkte für die weitere Entwicklung von Verbindungen. Mehrere biophysikalische Methoden können für das Fragmentscreening angewendet werden, die beliebtesten sind Kernspinresonanz, Röntgenkristallographie, Oberflächenplasmonenresonanz und thermische Verschiebungsassays. Diese Methoden werden entweder parallel oder sequenziell eingesetzt, mit dem Ziel, das Vertrauen in die Treffer zu erhöhen und die Anzahl der falsch positiven bzw. falsch negativen Ergebnisse zu reduzieren. Eine kürzlich durchgeführte Vergleichsstudie6 legte jedoch nahe, dass sequentielle Screening-Kaskaden aufgrund der geringen Überschneidung zwischen den verschiedenen Methoden vermieden werden sollten.
Die Röntgenkristallographie ist eine etablierte Methode zur Strukturbestimmung am atomaren Detail, wurde aber kürzlich auch als Werkzeug für Screening-Zwecke entwickelt7,8. Da Proteinkristalle hohe Fragmentkonzentrationen (z.B. 100 mM) tolerieren, kann das kristallographische Fragmentscreening (CFS) mit anderen biophysikalischen Methoden zum Screening von Fragmenten konkurrieren oder diese sogar als Screening-Methode im ersten Schritt übertreffen6,9. Eine wichtige Voraussetzung für CFS ist jedoch ein validiertes Kristallisationssystem des Zielproteins, das Reproduzierbar Kristalle mit Beugungseigenschaften mit einer beträchtlich hohen Auflösung liefert, typischerweise besser als 2 Å.
Ein exklusiver Vorteil von CFS im Vergleich zu allen anderen Fragment-Screening-Methoden ist die Bereitstellung detaillierter 3D-Informationen über den Bindungsmodus der identifizierten Fragmente. Diese Strukturinformationen sind absolut entscheidend für die rationale Optimierung der Fragmenttreffer auf höheraffine Bindemittel. Etablierte Ausarbeitungsstrategien wachsen, verschmelzen und verknüpfen Fragmenttreffer5. Dadurch wird von Anfang an ein relativ hoher Ligandenwirkungsgrad gewährleistet, die Einführung unnötiger oder räumlich nicht geeigneter Gruppen vermieden werden, wodurch die Kosten für die chemische Synthese gesenkt werden. Alles in allem hat CFS konkurrenzlose Vorteile als Startstrategie für das Arzneimitteldesign.
Da ein bestimmtes biologisches Ziel die hohen Anforderungen von CFS an die Kristallqualität erfüllt, gibt es einige Hauptfaktoren, die die Chancen auf ein erfolgreiches Ergebnis solcher Screening-Kampagnen maximieren. Es hängt von der Qualität der verwendeten Fragmentbibliothek, von einem effizienten Workflow zur Durchführung der Experimente vor dem Beugungsexperiment, von Synchrotron-Beamlines mit ausreichender Automatisierungs- und Datenerfassungsgeschwindigkeit sowie von Mitteln und Wegen zur weitgehend automatisierten Datenverarbeitung und -analyse ab. Hier wird der komplette Workflow von den Kristall-Soaking-Experimenten bis zur Trefferidentifikation dargestellt, so wie er an den makromolekularen Kristallographie-Beamlines an BESSY II erfolgreich etabliert ist (Abbildung 1). Die Einrichtung steht akademischen und industriellen Nutzern für die Zusammenarbeit offen. Darüber hinaus können sich akademische Nutzer von EU-Ländern außerhalb Deutschlands unkompliziert über das Projekt iNEXT Discovery um Fördermittel bewerben.
Es gibt unabdingbare Voraussetzungen, um eine CFS-Kampagne starten und das in dieser Arbeit skizzierte Protokoll durchführen zu können: Es stehen gut beugerte Kristalle des Zielproteins zur Verfügung, die in großer Zahl reproduzierbar gezüchtet werden können, die bei Umgebungstemperatur stabil sind und die mit einem Kristallisationscocktail ohne hochflüchtige Inhaltsstoffe gezüchtet wurden. Eine weitere Voraussetzung ist die Eignung des Kristallgitters für das Experiment. In einem geeigneten Gitter müssen die interessanten Stellen des Zielproteins den Lösungsmittelkanälen zugewandt und somit zugänglich gemacht werden. Ein weiterer vorangegangener Schritt, der optional, aber dennoch sehr empfehlenswert ist, um den Erfolg im Workflow der CFS-Kampagne sicherzustellen, ist die Optimierung der Einweichbedingungen für das Experiment. Wichtige Benchmark-Statistiken sind hier die Beugungskraft des Kristalls und die relevanten Datenqualitätsindikatoren, die während des Datenskalierungsverfahrens ermittelt werden. Typische Zu optimierende Faktoren sind DMSO-Toleranz, Pufferkonzentration und Kryoschutzmittel. Obwohl DMSO keine strenge Voraussetzung ist, wie weiter unten beschrieben, kann DMSO als Co-Lösungsmittel dazu beitragen, die Fragmentlösung zu erhöhen. Typische Tests sollten das Einweichen von 0, 3, 6 oder 10% (v / v) DMSO über Nacht umfassen. Eine Erhöhung der Pufferkonzentration auf 200 oder 300 mM trägt dazu bei, einen Verlust der Beugungsqualität durch gelegentliche pH-Verschiebungseffekte zu vermeiden, die sich aus den zu verwendenden hohen Fragmentkonzentrationen ergeben. Schließlich ist es entscheidend herauszufinden, ob und welches zusätzliche Kryoprotektivum benötigt wird und ob es bereits in den Einweichzustand aufgenommen werden kann. In vielen Fällen wird jedoch kein zusätzliches Kryoschutzmittel benötigt, da DMSO selbst als Kryoschutzmittel wirken kann. Wenn ja, spart dies einen Bearbeitungsschritt im letzten Experiment. Die meisten Kristalle benötigen weniger Kryoschutzmittel, wenn sie auf entsprechend großen Schleifen blitzgekühlt werden, wodurch die umgebende Mutterlauge so weit wie möglich minimiert oder vermieden wird. In seltenen Fällen ist jedoch eine Schicht der Mutterlauge tatsächlich notwendig, um eine Beschädigung des Kristalls beim Abkühlen zu verhindern.
Die Anzahl der treffer in einer CFS-Kampagne ist nicht nur abhängig von der Häkbarkeit des Zielproteins und der Eignung des Kristallgitters (siehe oben), sondern auch von der Qualität der Bibliothek. Die Bibliotheksqualität umfasst zwei Aspekte: die Auswahl der Verbindungen für die Bibliothek und die Konfektionierung der Verbindungen (d.h. in welcher physikalischen Form sie für das Experiment präsentiert werden). Für die Compound-Selektion können verschiedene Strategien eingesetzt werden. Die meisten Bibliotheksentwürfe beinhalten die Maximierung der chemischen Vielfalt der Fragmente. Ein strategischer Fokus könnte darin bestehen, die chemische Traktierbarkeit der Fragmente für das Follow-up-Design einzubeziehen, die beispielsweise in der Diamond-SGC-iNEXT-Poised Library10angewendet wurde. Ein weiterer strategischer Schwerpunkt für das Bibliotheksdesign könnte darin bestehen, die Darstellung des kommerziell verfügbaren chemischen Raums von Fragmenten durch form- und pharmakophorbasiertes Clustering zu maximieren, wie die am HZB11entwickelten F2X-Bibliotheken veranschaulichen. Genauer gesagt wurden die 1103-gliedrige F2X-Universal Library und die repräsentative 96-Compound-Teilmenge für erste CFS-Kampagnen, die als F2X-Entry Screen bezeichnet wird, entwickelt und der F2X-Entry Screen wurde erfolgreich validiert11. Der F2X-Entry Screen ist die erste Wahl für CFS-Kampagnen am HZB. Anschließend können größere Kampagnen mit der F2X-Universal Library oder der 1056-mitgliedigen EU-OPENSCREEN-Fragmentbibliothek12 durchgeführt werden, die ebenfalls am HZB angeboten wird. Derzeit stehen diese Bibliotheken den Nutzern der makromolekularen Kristallographie-Beamlines des Synchrotrons BESSY II in Berlin auf Basis eines Kooperationsvertrages kostenlos zur Verfügung. Das gilt auch für Nutzer über iNEXT Discovery-Vorschläge. Darüber hinaus steht der F2X-Entry Screen allen interessierten Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern auf Basis einer Materialtransfervereinbarung zur Verfügung.
In Bezug auf die physische Präsentation einer Bibliothek werden üblicherweise zwei Ansätze verfolgt: Die Fragmente werden entweder als DMSO-Stammlösungen verwendet oder die Fragmente werden getrocknet und auf gebrauchsfertigen Platten immobilisiert. Am HZB werden sowohl der F2X-Entry Screen als auch die nichtflüchtigen Verbindungen der F2X-Universal Library als getrocknete Compounds in einer 3-Linsen-96-Well-MRC-Low-Profile-Kristallisationsplatte präsentiert. Die Präsentation der in Kristallisationsplatten immobilisierten Fragmente hat zwei entscheidende Vorteile: Erstens ermöglicht sie den Transport der Siebplatten in das Heimlabor des Anwenders. Daher können die hier vorgestellten Einweich- und Kristallhandhabungsschritte des Workflows (Schritte 1-3) überall durchgeführt werden. Zweitens kann eine DMSO-freie Lösung eingesetzt werden. DMSO-sensitive Targets können so einfach gescreent werden, wobei die erwarteten Trefferquoten weitgehend beibehalten werden11. DMSO erhöht jedoch die Fragmentlöslichkeit, daher lohnt es sich, die DMSO-Toleranz eines Kristallsystems der Wahl vorher zu überprüfen, wie oben beschrieben.
Das unten beschriebene Protokoll beschreibt ein typisches Experiment mit einem 96-Compound-Bildschirm wie dem F2X-Entry Screen. Dazu müssen etwa 250 Kristalle rechtzeitig vorbereitet werden, um frisch verwendet zu werden. Es ist sehr ratsam, die Einweichen für alle 96 Verbindungen doppelt vorzubereiten. Es wird empfohlen, aber optional, zusätzliche Mock-Soaks vorzubereiten, die später bei der Datenanalyse mit dem PanDDA-Ansatz (Pan-Data Density Analysis) zur Trefferidentifikationhelfen 13. Mock-Soaks sind definiert als Einweichexperimente an Proteinkristallen, bei denen die gleiche Einweichlösung wie das Fragment für die gleiche Inkubationszeit verwendet wird, aber keine Fragmente vorhanden sind. Wenn die Einweichlösung der Kristallisationsbedingung entspricht, können die Kristalle direkt aus der Kristallisationsplatte gewonnen werden.
Abhängig von den Fähigkeiten des Roboter-Probenwechssels müssen möglicherweise unterschiedliche Puckformate verwendet werden. Derzeit müssen Proben für die HZB-betriebene Beamline BL14.1 im Unipuck-Format vorbereitet werden, Proben für die HZB-betriebene Beamline BL14.2 im SPINE-Puckformat. In diesem Protokoll wird die Vorbereitung im Unipuck-Format vorausgesetzt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#181;L pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet, 100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP4861000791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blow dryer</td>
			<td>TH-Geyer</td>
			<td>9.106 788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal containing crystallization plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Contains crystals to be soaked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>various, e.g. 
			M5-L18SP-75LD</td>
			<td>250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyAccess Frame</td>
			<td>HZB</td>
			<td></td>
			<td>The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2X-Entry Screen plate</td>
			<td>HZB</td>
			<td></td>
			<td>Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glas spot plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1406506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>At least a filled up 5 L can</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage can</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic crystal wand</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate</td>
			<td>SwissCI</td>
			<td>3W96TLP-UVP</td>
			<td>For mock-soaked crystals (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EKT6.1</td>
			<td>25 ml volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample tracking template</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. 
			xlsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>BA825SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil for microtiter plates</td>
			<td>GreinerBioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shelved puck shipping canes (for Unipucks)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-065</td>
			<td>2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soaking solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>At least 5 ml are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soaking solution including cryo-protectant, 150&#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissues&#160;</td>
			<td>Roth (Kimberly Clark Professional)</td>
			<td>AA64.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport dewar (Whartington dry shipper)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>TW-CX100</td>
			<td>2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck foam dewars with lid</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-022</td>
			<td>two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol 
			if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck starter set</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-UPSK001</td>
			<td>Can be provided by the HZB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td>14 unipucks; can be provided by the HZB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum berlin

Fragment-Screening ist eine Technik, die hilft, vielversprechende Ansatzpunkte für das Ligandendesign zu identifizieren. Da Kristalle des Zielproteins verfügbar sind und reproduzierbar hochauflösende Röntgenbeugungseigenschaften aufweisen, gehört die Kristallographie aufgrund ihrer Empfindlichkeit zu den am meisten bevorzugten Methoden für das Fragmentscreening. Darüber hinaus ist es die einzige Methode, die detaillierte 3D-Informationen über den Bindungsmodus des Fragments liefert, was für die nachfolgende rationale Verbindungsentwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Der routinemäßige Einsatz der Methode hängt von der Verfügbarkeit geeigneter Fragmentbibliotheken, dedizierter Mittel zur Handhabung großer Probenzahlen, modernster Synchrotronstrahllinien für schnelle Beugungsmessungen und weitgehend automatisierten Lösungen für die Analyse der Ergebnisse ab.
Hier werden der komplette Praxisablauf und die darin enthaltenen Werkzeuge zur Durchführung des kristallographischen Fragmentscreenings (CFS) am Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB) vorgestellt. Vor diesem Workflow werden Kristalldurchweichbedingungen sowie Datenerfassungsstrategien für reproduzierbare kristallographische Experimente optimiert. Dann, typischerweise in einem ein- bis zweitägigen Verfahren, wird eine 96-gliedrige CFS-fokussierte Bibliothek, die als getrocknete gebrauchsfertige Platten bereitgestellt wird, verwendet, um 192 Kristalle einzuweichen, die dann einzeln blitzgekühlt werden. Die abschließenden Beugungsexperimente können innerhalb eines Tages an den roboterinbaugestützten Beamlines BL14.1 und BL14.2 am Elektronenspeicherring BESSY II des HZB in Berlin-Adlershof durchgeführt werden. Die Verarbeitung der kristallographischen Daten, die Verfeinerung der Proteinstrukturen und die Trefferidentifikation erfolgen schnell und weitgehend automatisiert mit speziellen Software-Pipelines auf dedizierten Servern, die wenig Benutzereingaben erfordern.
Die Nutzung des CFS-Workflows am HZB ermöglicht routinemäßige Screening-Experimente. Es erhöht die Chancen für eine erfolgreiche Identifizierung von Fragmenttreffern als Ausgangspunkt, um potentere Bindemittel zu entwickeln, die für pharmakologische oder biochemische Anwendungen nützlich sind.

Im Rahmen der bereits berichteten Validierungskampagnen des F2X-Entry Screen11wurden drei Kampagnen an der BioMAX Beamline am MAX IV und eine Kampagne an der Beamline BL14.1 am HZB durchgeführt. In der letztgenannten Kampagne wurde ein bestimmter Satz von F2X-Entry Screen-Bedingungen unter Verwendung einer Einweichbedingung, die kein DMSO enthielt, gegen den Protein-Protein-Komplex der Hefe Aar2 und die RNaseH-ähnliche Domäne der Hefe Prp8 (AR) untersucht. Der ausgewählte Satz von Bedingungen umfasst die Treffer, die in einer früheren Kampagne des F2X-Entry Screen gegen AR in einem einweichenden Zustand gefunden wurden, der DMSO11enthielt (d.h. in der am HZB durchgeführten Kampagne wurden diese Treffer in Abwesenheit von DMSO erneut überprüft). Abbildung 7 zeigt eine Übersicht der Treffer, die nach der Analyse der Daten mit der FragMAXapp-Kombination aus XDSAPP für die Verarbeitung, fspipeline für die automatische Verfeinerung und anschließender Treffersuche mit PanDDA erhalten wurden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs eines kristallographischen Fragment-Screening-Experiments (CFS) mit Fokus auf die spezielle Umgebung am Helmholtz-Zentrum Berlin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig01large.jpg" target="_blank">Eine größere Version dieser Abbildung finden Sie hier.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig02.jpg"> Abbildung 2: Formulierung und Verpackung des F2X-Entry Screen. Das 96-Compound-Sieb ist auf einer 3-Linsen-96-Well-MRC-Low-Profile-Platte erhältlich, die mit Folie versiegelt und vakuumverpackt ist. Die 96 Verbindungen des Siebes werden aus DMSO-Lösungen in zwei der drei Linsen jeder Vertiefung getrocknet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig03.jpg"> Abbildung 3: Fotografie der CFS-Werkbank im HZB-Vorbereitungslabor. Es werden Baugruppen der notwendigen Werkzeuge für A)Einweichen und für B)Kristallernte angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig04.jpg"> Abbildung 4: Datenerfassungsendstationen und Steuerungssoftware. A) Foto des Versuchsstalls der HZB-MX Beamlines BL14.1 (links) und BL14.2 (rechts)15. B) Screenshot der MXCuBE2-Experimentsteuerungsschnittstelle16, die bei BL14.1 zur Erfassung von Beugungsdaten verwendet wird. Bei BL14.2 wird eine sehr ähnliche Schnittstelle verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>  
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig05.jpg"> Abbildung 5: Fotografische Schnappschüsse einiger kristalliner Proben in kryogener Umgebung vor der Datenerhebung. Dies veranschaulicht die Variabilität der Morphologien der Kristalle nach dem Einweichen der Fragmente und der Kristallernte. Die Fotos wurden auf der BioMAX Beamline (MAX IV Synchrotron, Lund, Schweden) für AR-Proben aufgenommen, die dort im Rahmen der F2X-Entry Screen Validierung11gesammelt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig06.jpg"> Abbildung 6: Screenshot der am HZB installierten FragMaxApp18 zur komfortablen Datenanalyse. Mehr Details in Lima et al., FragMAXapp, unveröffentlichte Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig07.jpg"> Abbildung 7: Überblick über die Ergebnisse der CFS-Kampagne F2X-Entry vs. AR (ohne DMSO). Der AR-Proteinkomplex wird in der Cartoon-Ansicht gezeigt, wobei Aar2 grau und die RNaseH-ähnliche Domäne von Prp8 blau gefärbt ist. Die Fragmenttreffer der Kampagne sind in Elementfarben eingefärbt (C - gelb, O - rot, N - blau, S - orange, Cl - hell cyan). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Informationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin erfolgt über einen Workflow mit dedizierten Compound-Bibliotheken, Kristall-Handling-Tools, schnellen Datenerfassungsmöglichkeiten und weitgehend automatisierter Datenanalyse. Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, den Output solcher Experimente zu maximieren, um vielversprechende Ansatzpunkte für das nachgelagerte strukturbasierte Ligandendesign zu schaffen.

Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Das Screening kleinerer organischer Verbindungen, sogenannter Fragmente, mittels Röntgenkristallographie ist eine effiziente Methode zur Identifizierung von Molekülen, die Ausgangspunkte für die Wirkstoffforschung oder die Entwicklung biochemischer Werkzeugverbindungen sind. Das kristallographische Fragmentscreening ergab nicht nur die Identität, sondern auch, wo und wie sich die Fragmente auf der Oberfläche des untersuchten Proteins binden. Diese Technik kann auf jedem biochemisch oder medizinisch relevanten Proteinziel angewendet werden, für das geeignete Proteinkristalle gezüchtet werden können.Die Qualität der Ergebnisse ist eng mit der Qualität der Probenhandhabung verbunden. Wir glauben, dass die folgende visuelle Demonstration den Forschern helfen wird, qualitativ hochwertige Experimente durchzuführen. Demonstriert wird das Verfahren von Tatjana Barthel, Doktorandin und Doktorandin in meinem Labor.Schneiden Sie zunächst den auf Raumtemperatur vorgewärmten Beutel der Siebplatte auf und entfernen Sie dann den Deckel und die Folie von der Siebplatte. Dekantieren Sie die fünf Milliliter einweichende Lösung im Reagenzbehälter. Füllen Sie dann jeden der 96 Behälter der Platte mit 40 Mikrolitern Einweichlösung mit einer 12-Kanal-Pipette.Legen Sie den leicht zugänglichen Rahmen auf die Siebplatte und befestigen Sie ihn mit den mitgelieferten Klemmen, indem Sie sie auf die linke und rechte Seite des Geräts schieben. Legen Sie die Siebplatte und den leicht zugänglichen Rahmen unter das Mikroskop und schieben Sie den ersten Brunnen auf, indem Sie die jeweilige Acrylglasfliese des Rahmens bewegen. 0,4 Mikroliter Einweichlösung aus dem Reservoir mit einer frischen Pipettenspitze in das Fragment geben, das den Brunnen enthält.Stellen Sie sicher, dass der Tropfen das getrocknete Fragment bedeckt. Legen Sie die Kristallisationsplatte, die die größten Kristalle enthält, unter das zweite Mikroskop und schneiden Sie die Siegelfolie an einem der Vertiefungen auf. Übertragen Sie mit einer entsprechend großen Schlaufe einen Kristall unter dem ersten Mikroskop auf den Brunnen der Siebplatte.Waschen Sie die Schlaufe in der vorbereiteten Glasfleckplatte und trocknen Sie sie dann ab, indem Sie sie vorsichtig mit dem Gewebe berühren. Tun Sie dies nach jedem Transfer, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie das Mikroskop, um sicherzustellen, dass der Kristall richtig platziert wurde.Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Kristall. Fahren Sie mit der nächsten Bohrung fort und wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Brunnen. Nachdem die Kristalle auf alle 96 Vertiefungen in der Siebplatte übertragen wurden, entfernen Sie die Siebplatte zusammen mit dem leicht zugänglichen Rahmen unter dem Mikroskop und legen Sie sie auf die Bank oder den Tisch.Entfernen Sie dann den leicht zugänglichen Rahmen von der Siebplatte, versiegeln Sie die Siebplatte mit Siegelfolie und legen Sie sie in den Kristallisationsinkubator oder Schrank, um sie für die zuvor optimierte Einweichzeit zu inkubieren. Zwei Stunden Inkubation sind ausreichend, aber über Nacht kann bequemer sein. Bereiten Sie den Unipuck-Schaum Dewar mit drei Unipuck-Deckeln vor und füllen Sie ihn zur Hälfte mit flüssigem Stickstoff, um ihn auf dem Boden zu halten.Bewegen Sie den halbgefüllten Dewar auf die Bank und füllen Sie ihn vollständig bis zum Rand. Halten Sie es während des gesamten Experiments bis zum oberen Rand gefüllt und ersetzen Sie den flüssigen Stickstoff häufig. Holen Sie die Siebplatte aus dem Inkubator und entfernen Sie die Folie.Platzieren Sie den leicht zugänglichen Rahmen oben. Öffnen Sie den ersten Brunnen. Ernten Sie einen Kristall aus dem Tropfen und kühlen Sie ihn in flüssigem Stickstoff ab, indem Sie ihn mit einer schnellen vertikalen Bewegung eintauchen.Legen Sie die Probe in die richtige Puckposition ein und machen Sie relevante Notizen auf dem Probenverfolgungsblatt. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Kristall. Gehen Sie zum nächsten Brunnen und wiederholen Sie die Positionierung anderer Kristalle, bis alle drei Pucks voll sind.Kühlen Sie die Unipuck-Basen in flüssigem Stickstoff vor und fügen Sie sie auf die Deckel hinzu. Lagern Sie die Unipucks im Lagerregal in einem Transport-Dewar oder Lager-Dewar. Bewahren Sie sie bis zur Messung in flüssigem Stickstoff bei kryogenen Temperaturen auf.Wiederholen Sie den gleichen Vorgang der Ernte und Lagerung der Kristalle in Unipucks für die verbleibenden Proben in der Siebplatte. Die Variabilität der Kristallmorphologien nach Durchführung der Fragmenteinweichung und Kristallernte wird hier gezeigt. Sogar Kristalle, die etwas verschlechtert aussehen, wurden aufgenommen, da sie immer noch zu nützlichen Daten führen.Die Daten wurden an den Beamlines 14.1 und 14.2 am Synchrotron BESSY II gesammelt. Für jede Probe wurde eine Beugungsdatenerfassung durchgeführt. Die Daten wurden mit FragMAXapp analysiert, wobei der Schwerpunkt auf der Kombination von XDSAPP für die Verarbeitung, fspipeline für die Strukturverfeinerung und PenDA für die Treffersuche lag.Dies führte zu 15 Treffern auf den AR-Proteinkomplex unter Verwendung einer DMSO-freien Einweichbedingung. In einer früheren Kampagne des F2X-Einstiegsbildschirms gegen das gleiche Ziel, einschließlich DMSO im durchnässten Zustand, wurden 20 Treffer gefunden. Das bedeutet, dass 75% der Treffer identifiziert werden können, wenn DMSO weggelassen wird.Für den Erfolg des Experiments ist es entscheidend, dass die Kristalle bei jedem Schritt des Eingriffs richtig und sorgfältig behandelt werden. Das kristallographische Fragmentscreening hat sich zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt, die häufig in der Wissenschaft und in der pharmazeutischen Industrie angewendet wird.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Echtzeit-Tracking der DNA-Fragment-Trennung durch Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Forschung

Biochemie

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

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The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

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Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...