Name: workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum berlin
Uploaded: 2021-03-03T14:00:00
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हम उन कई उपयोगकर्ता समूहों का शुक्रिया अदा करते हैं जिन्होंने एचजेडबी में सीएफएस अभियानों का प्रदर्शन किया है। उनकी प्रतिक्रिया के कारण हमारे कार्यप्रवाह में वृद्धिशील सुधार हुआ। हम मारबर्ग विश्वविद्यालय में दवा डिजाइन समूह और मैक्स चतुर्थ में FragMAX समूह का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, के रूप में करीबी सहयोग बेहतर सीएफएस के लिए कई विकास बहुत तेजी के लिए नींव थे । हम जर्मन संघीय शिक्षा और विज्ञान मंत्रालय (BMBF) द्वारा समर्थन के लिए आभारी हैं, परियोजनाओं Frag2Xtal और Frag4Lead (संख्या 05K13M1 और 05K16M1) के माध्यम से । हम इसके अतिरिक्त iNEXT-डिस्कवरी, परियोजना संख्या 871037, यूरोपीय आयोग के क्षितिज २०२० कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से समर्थन के लिए आभारी हैं ।

<ol>
	<li>Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+on:+the+impact+of+fragments+on+drug+discovery.">Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).</li><li>Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+exploration+of+chemical+space+by+fragment-based+screening.">Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).</li><li>Erlanson, D. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).</li><li>Wollenhaupt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F2X-Universal+and+F2X-Entry:+Structurally+Diverse+Compound+Libraries+for+Crystallographic+Fragment+Screening.">F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening.</a> Structure. 28 (6), 694-706 (2020).</li><li>. EU OPENSCREEN fragment library Available from: <a target="_blank" href="https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html">https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html</a> (2020)</li><li>Pearce, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-crystal+method+for+extracting+obscured+crystallographic+states+from+conventionally+uninterpretable+electron+density.">A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density.</a> Nature Communications. 8, 15123 (2017).</li><li>Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitated+crystal+handling+using+a+simple+device+for+evaporation+reduction+in+microtiter+plates.">Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates.</a> Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).</li><li>Mueller, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macromolecular+crystallography+beamlines+at+BESSY+II+of+the+Helmholtz-Zentrum+Berlin:+Current+status+and+perspectives.">The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives.</a> The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).</li><li>Oscarsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MXCuBE2:+The+dawn+of+MXCuBE+collaboration.">MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).</li><li>Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+fine+&#966;-slicing+for+single-photon-counting+pixel+detectors.">Optimal fine &#966;-slicing for single-photon-counting pixel detectors.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).</li><li>Lima, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragMAX:+The+fragment-screening+platform+at+the+MAX+IV+Laboratory.">FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. 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C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+ligand+fitting+by+core-fragment+fitting+and+extension+into+density.">Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).</li><li>Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+modelling+of+ligand+binding+requires+an+ensemble+of+bound+and+unbound+states.">Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).</li><li>Collins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Eleven+-+Achieving+a+Good+Crystal+System+for+Crystallographic+X-Ray+Fragment+Screening.">Chapter Eleven - Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening.</a> Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Cuttitta, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+transfer+of+protein+crystals+from+agarose+pedestals+to+micromeshes+for+high-throughput+screening.">Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).</li><li>Moreno-Chicano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structures+of+protein-ligand+complexes+at+room+temperature+using+serial+femtosecond+crystallography.">High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).</li></ol>

EasyAccess फ्रेम के बारे में एक पेटेंट आवेदन हेल्महोल्ट्ज़-Zentrum बर्लिन द्वारा जर्मन पेटेंट और ट्रेडमार्क कार्यालय के साथ पंजीकरण संख्या DE 10 2018 111 478.8 के साथ दायर किया गया है। इसके अतिरिक्त, पीसीटी मार्ग के माध्यम से एक अंतरराष्ट्रीय पेटेंट आवेदन, जर्मन पेटेंट की प्राथमिकता का उपयोग कर, दायर किया गया है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#181;L pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet, 100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP4861000791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blow dryer</td>
			<td>TH-Geyer</td>
			<td>9.106 788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal containing crystallization plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Contains crystals to be soaked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>various, e.g. 
			M5-L18SP-75LD</td>
			<td>250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyAccess Frame</td>
			<td>HZB</td>
			<td></td>
			<td>The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2X-Entry Screen plate</td>
			<td>HZB</td>
			<td></td>
			<td>Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glas spot plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1406506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>At least a filled up 5 L can</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage can</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic crystal wand</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate</td>
			<td>SwissCI</td>
			<td>3W96TLP-UVP</td>
			<td>For mock-soaked crystals (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EKT6.1</td>
			<td>25 ml volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample tracking template</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. 
			xlsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>BA825SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil for microtiter plates</td>
			<td>GreinerBioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shelved puck shipping canes (for Unipucks)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-065</td>
			<td>2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soaking solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>At least 5 ml are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soaking solution including cryo-protectant, 150&#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissues&#160;</td>
			<td>Roth (Kimberly Clark Professional)</td>
			<td>AA64.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport dewar (Whartington dry shipper)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>TW-CX100</td>
			<td>2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck foam dewars with lid</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-022</td>
			<td>two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol 
			if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck starter set</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-UPSK001</td>
			<td>Can be provided by the HZB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td>14 unipucks; can be provided by the HZB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum berlin

टुकड़ा स्क्रीनिंग एक तकनीक है कि ligand डिजाइन के लिए आशाजनक शुरुआती अंक की पहचान करने में मदद करता है । यह देखते हुए कि लक्ष्य प्रोटीन के क्रिस्टल उपलब्ध हैं और प्रजनन उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे विवर्तन गुणों को प्रदर्शित करते हैं, क्रिस्टलोग्राफी इसकी संवेदनशीलता के कारण टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए सबसे पसंदीदा तरीकों में से एक है। इसके अतिरिक्त, यह टुकड़े के बाध्यकारी मोड की विस्तृत 3डी जानकारी प्रदान करने वाली एकमात्र विधि है, जो बाद में तर्कसंगत यौगिक विकास के लिए महत्वपूर्ण है। विधि का नियमित उपयोग उपयुक्त खंड पुस्तकालयों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, बड़ी संख्या में नमूनों को संभालने के लिए समर्पित साधन, तेजी से विवर्तन मापन के लिए अत्याधुनिक सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन और परिणामों के विश्लेषण के लिए काफी हद तक स्वचालित समाधान।
यहां, हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन (एचजेडबी) में क्रिस्टलीय खंड स्क्रीनिंग (सीएफएस) का संचालन करने के तरीके पर पूर्ण व्यावहारिक कार्यप्रवाह और शामिल उपकरण प्रस्तुत किए गए हैं। इस कार्यप्रवाह से पहले, क्रिस्टल भिगोने की स्थिति के साथ-साथ डेटा संग्रह रणनीतियों को प्रजनन योग्य क्रिस्टलीय प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जाता है। फिर, आम तौर पर एक से दो दिन की प्रक्रिया में, एक ९६ सदस्यीय सीएफएस केंद्रित पुस्तकालय सूखे तैयार करने के लिए उपयोग प्लेटों के रूप में प्रदान की १९२ क्रिस्टल, जो तो फ़्लैश कर रहे है व्यक्तिगत रूप से ठंडा सोख कार्यरत है । अंतिम विवर्तन प्रयोगों को बर्लिन-एडलरशोफ (जर्मनी) में एचजेडबी द्वारा संचालित बीएसएसवाई द्वितीय इलेक्ट्रॉन स्टोरेज रिंग में रोबोट-माउंटिंग समर्थित बीमलाइन BL14.1 और BL14.2 पर एक दिन के भीतर किया जा सकता है। क्रिस्टलीय डेटा का प्रसंस्करण, प्रोटीन संरचनाओं का शोधन, और हिट पहचान समर्पित सर्वरों पर विशेष सॉफ्टवेयर पाइपलाइनों का उपयोग करके तेजी से और काफी हद तक स्वचालित है, जिसके लिए कम उपयोगकर्ता इनपुट की आवश्यकता होती है।
HZB में सीएफएस वर्कफ्लो का उपयोग नियमित स्क्रीनिंग प्रयोगों को सक्षम बनाता है । यह अधिक शक्तिशाली बांधने, औषधीय या जैव रासायनिक अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी विकसित करने के लिए शुरू अंक के रूप में टुकड़ा हिट की सफल पहचान के लिए संभावना बढ़ जाती है ।

F2X-एंट्री स्क्रीन11के पहले रिपोर्ट किए गए सत्यापन अभियानों के हिस्से के रूप में, मैक्स IV में बायोमैक्स बीमलाइन पर तीन अभियान आयोजित किए गए थे और एक अभियान एचजेडबी में बीमलाइन BL14.1 पर आयोजित किया गया था। बाद के अभियान में, एक भिगोने वाली स्थिति का उपयोग करके F2X-प्रवेश स्क्रीन स्थितियों का एक विशेष सेट जिसमें डीएमएसओ शामिल नहीं था, खमीर Aar2 के प्रोटीन-प्रोटीन परिसर और खमीर Prp8 (एआर) के RNaseH जैसे डोमेन के खिलाफ जांच की गई थी। शर्तों के चयनित सेट हिट है कि एक भिगोने डीएमएसओ11युक्त हालत में एआर के खिलाफ F2X प्रवेश स्क्रीन के एक पहले अभियान में पाया गया शामिल हैं, (यानी, HZB में प्रदर्शन अभियान में उन हिट फिर से DMSO की अनुपस्थिति में जांच की गई) । चित्रा 7 प्रसंस्करण के लिए XDSAPP के FragMAXapp संयोजन के साथ डेटा का विश्लेषण करने के बाद प्राप्त हिट का अवलोकन दिखाता है, ऑटो-शोधन के लिए एफएसपाइपलाइन और बाद में पैन्डडीए का उपयोग करके हिट खोज।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig01.jpg"> चित्रा 1:हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन में विशेष वातावरण पर ध्यान केंद्रित करने के साथ क्रिस्टलीय खंड-स्क्रीनिंग (सीएफएस) प्रयोग के कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig02.jpg"> चित्रा 2:F2X-एंट्री स्क्रीन का निर्माण और पैकेजिंग। ९६-यौगिक स्क्रीन एक 3 लेंस ९६-अच्छी तरह से एमआरसी कम प्रोफ़ाइल प्लेट, पन्नी और वैक्यूम पैक के साथ सील पर उपलब्ध है । स्क्रीन के 96 यौगिकों प्रत्येक कुएं के तीन लेंस में से दो में DMSO समाधान से सूख रहे हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig03.jpg"> चित्रा 3:HZB तैयारी प्रयोगशाला में सीएफएस कार्यक्षेत्र की फोटोग्राफी । एके लिए आवश्यक उपकरणों की विधानसभाएं ) भिगोने और बीके लिए) क्रिस्टल हार्वेस्टिंग प्रदर्शित की जाती हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig04.jpg"> चित्रा 4:डेटा संग्रह अंत स्टेशनों और नियंत्रण सॉफ्टवेयर। A)HZB-MX बीमलाइन BL14.1 (बाएं) और BL14.2 (दाएं)15के प्रायोगिक हच की तस्वीर । B)MXCuBE2 प्रयोग नियंत्रण इंटरफेस16 का स्क्रीनशॉट BL14.1 पर विवर्तन डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया । BL14.2 पर एक बहुत ही इंटरफेस का उपयोग किया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>  
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig05.jpg"> चित्रा 5:डेटा संग्रह से पहले क्रायोजेनिक वातावरण में कुछ क्रिस्टलीय नमूनों के फोटोग्राफिक स्नैपशॉट। यह टुकड़ा भिगोने और क्रिस्टल संचयन प्रदर्शन के बाद क्रिस्टल के मॉर्फोलोजी की परिवर्तनशीलता दिखाता है। इन तस्वीरों को F2X-एंट्री स्क्रीन सत्यापन11के हिस्से के रूप में वहां एकत्र किए गए एआर नमूनों के लिए बायोमैक्स बीमलाइन (मैक्स चतुर्थ सिंक्रोट्रॉन, लुंड, स्वीडन) पर लिया गया था । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig06.jpg"> चित्रा 6:सुविधाजनक डेटा विश्लेषण के लिए HZB में स्थापित FragMaxApp18 का स्क्रीनशॉट। लीमा एट अल में अधिक जानकारी, FragMAXapp, अप्रकाशित डेटा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig07.jpg"> चित्रा 7:सीएफएस अभियान F2X-प्रवेश बनाम एआर (DMSO के बिना) के परिणामों का अवलोकन । एआर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को कार्टून व्यू में दिखाया गया है, जिसमें Aar2 रंग ग्रे में और RNaseH-Prp8 के नीले रंग के डोमेन के साथ दिखाया गया है । अभियान के टुकड़े हिट तत्व रंगों में रंग रहे हैं (सी - पीला, हे - लाल, एन - नीला, एस - नारंगी, सीएल - प्रकाश सियान)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig07large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
अनुपूरक सूचना। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.xlsx" target="_blank">इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन में क्रिस्टलोग्राफिक टुकड़ा स्क्रीनिंग समर्पित यौगिक पुस्तकालयों, क्रिस्टल हैंडलिंग टूल, तेजी से डेटा संग्रह सुविधाओं और काफी हद तक स्वचालित डेटा विश्लेषण के साथ एक वर्कफ्लो का उपयोग करके किया जाता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम संरचना-आधारित लिगांड डिजाइन के लिए आशाजनक शुरुआती अंक प्रदान करने के लिए ऐसे प्रयोगों के उत्पादन को अधिकतम करना चाहता है।

हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन में क्रिस्टलीय टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए कार्यप्रवाह और उपकरण

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके टुकड़े नामक छोटे कार्बनिक यौगिकों की स्क्रीनिंग उन अणुओं की पहचान करने के लिए एक कुशल विधि है जो दवा की खोज या जैव रासायनिक उपकरण यौगिक विकास के लिए अंक शुरू कर रहे हैं। क्रिस्टलीय टुकड़ा स्क्रीनिंग न केवल पहचान से पता चला है, लेकिन यह भी कहां और कैसे टुकड़े अध्ययन के तहत प्रोटीन की सतह पर बांध । इस तकनीक का उपयोग हर जैव रासायनिक या चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक प्रोटीन लक्ष्य पर किया जा सकता है जिसके लिए उपयुक्त प्रोटीन क्रिस्टल उगाए जा सकते हैं।परिणामों की गुणवत्ता नमूने की हैंडलिंग की गुणवत्ता से परिचित रूप से जुड़ी हुई है। हमारा मानना है कि निम्नलिखित दृश्य प्रदर्शन शोधकर्ताओं को उच्च गुणवत्ता वाले प्रयोगों को पूरा करने में मदद करेगा। प्रक्रिया का प्रदर्शन तजना बार्थेल, एक डॉक्टरेट शोधकर्ता और मेरी प्रयोगशाला में पीएचडी के छात्र होंगे ।शुरू करने के लिए, स्क्रीनिंग प्लेट के बैग को कमरे के तापमान से पहले गर्म करें, फिर स्क्रीनिंग प्लेट से ढक्कन और पन्नी को हटा दें। रिएजेंट जलाशय में पांच मिलीलीटर भिगोने वाले समाधान को कम करें। फिर प्लेट के 96 जलाशयों में से प्रत्येक को 12 चैनल पिपेट का उपयोग करके भिगोने वाले समाधान के 40 माइक्रोलीटर के साथ भरें।स्क्रीनिंग प्लेट के शीर्ष पर आसान पहुंच फ्रेम रखें और उन्हें डिवाइस के बाएं और दाईं ओर फिसलने से शामिल क्लैंप के साथ सुरक्षित करें। स्क्रीनिंग प्लेट और आसान एक्सेस फ्रेम को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और स्लाइड फ्रेम के संबंधित ऐक्रेलिक ग्लास टाइल को स्थानांतरित करके पहले अच्छी तरह से खोलें। जलाशय से एक ताजा पिपेट टिप का उपयोग करके अच्छी तरह से युक्त टुकड़े में भिगोने वाले समाधान के 0.4 माइक्रोलीटर जोड़ें।सुनिश्चित करें कि बूंद सूखे-परित टुकड़े को कवर करती है। क्रिस्टलीकरण प्लेट रखें जिसमें दूसरे माइक्रोस्कोप के नीचे सबसे बड़ा क्रिस्टल होता है और एक कुएं में सीलिंग फॉइल को खोलता है। उचित आकार के लूप का उपयोग करके, पहले माइक्रोस्कोप के नीचे स्क्रीनिंग प्लेट के कुएं में क्रिस्टल स्थानांतरित करें।लूप को तैयार ग्लास स्पॉट प्लेट में धोएं, फिर इसे धीरे-धीरे टिश्यू को छूकर सुखा लें। क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए हर हस्तांतरण के बाद ऐसा करें। यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि क्रिस्टल को ठीक से रखा गया है।दूसरे क्रिस्टल के लिए प्रक्रिया दोहराएं। अगले कुएं पर जाएं, और शेष सभी कुओं के लिए प्रक्रिया दोहराएं। क्रिस्टल के बाद स्क्रीनिंग प्लेट में सभी ९६ कुओं को स्थानांतरित कर दिया गया है, माइक्रोस्कोप के नीचे से आसान पहुंच फ्रेम के साथ स्क्रीनिंग प्लेट को हटा दें और इसे बेंच या टेबल पर रखें ।फिर स्क्रीनिंग प्लेट से आसान एक्सेस फ्रेम निकालें, सीलिंग फॉयल के साथ स्क्रीनिंग प्लेट को सील करें, और इसे पहले अनुकूलित भिगोने वाले समय के लिए इनक्यूबेट करने के लिए क्रिस्टलीकरण इनक्यूबेटर या अलमारी में रखें। इनक्यूबेशन के दो घंटे पर्याप्त है, लेकिन रात ोंरात अधिक सुविधाजनक हो सकता है । यूनिपक फोम देवर को तीन यूनिपक ढक्कन के साथ तैयार करें और इसे जमीन पर रखते हुए, तरल नाइट्रोजन से आधा भरें।आधे भरे देवर को बेंच पर ले जाएं, और उसे पूरी तरह से किनारे पर भर दें। पूरे प्रयोग के दौरान इसे ऊपरी किनारे पर भर रखें, और तरल नाइट्रोजन को अक्सर बदलें। इनक्यूबेटर से स्क्रीनिंग प्लेट को पुनः प्राप्त करें और इसकी पन्नी निकालें।शीर्ष पर आसान पहुंच फ्रेम रखें। स्लाइड पहले अच्छी तरह से खोलें। ड्रॉप से एक क्रिस्टल को काटें और एक तेज ऊर्ध्वाधर आंदोलन के साथ जल्दी से आगे बढ़नेवाला द्वारा तरल नाइट्रोजन में इसे ठंडा करें।उचित पक स्थिति में नमूना डालें, और नमूना ट्रैकिंग शीट पर प्रासंगिक नोट्स लें। दूसरे क्रिस्टल के लिए प्रक्रिया दोहराएं। अगले कुएं पर जाएं और अन्य क्रिस्टल की स्थिति को तब तक दोहराएं जब तक कि तीनों पक भरे न जाएं।तरल नाइट्रोजन में यूनिपक कुर्सियां को प्री-कूल करें, और उन्हें ढक्कन के शीर्ष पर जोड़ें। ट्रांसपोर्ट देवर या स्टोरेज देवर में स्टोरेज रैक में यूनिपक्स स्टोर करें। माप होने तक उन्हें क्रायोजेनिक तापमान पर तरल नाइट्रोजन में रखें।स्क्रीनिंग प्लेट में शेष नमूनों के लिए यूनिपक्स में क्रिस्टल की कटाई और भंडारण की एक ही प्रक्रिया दोहराएं। टुकड़ा भिगोने और क्रिस्टल हार्वेस्टिंग प्रदर्शन करने के बाद क्रिस्टल मॉर्फोलोजी की परिवर्तनशीलता यहां दिखाई जाती है। यहां तक कि क्रिस्टल जो कुछ हद तक खराब दिखते हैं, उन्हें शामिल किया गया था, क्योंकि वे अभी भी उपयोगी डेटा में परिणाम देते हैं।बीएसएसवाई द्वितीय सिंक्रोट्रॉन में बीमलाइन 14.1 और 14.2 पर डेटा एकत्र किया गया था। प्रत्येक नमूने के लिए विवर्तन डेटा संग्रह किया गया था। डेटा का विश्लेषण FragMAXapp का उपयोग करके किया गया था, प्रसंस्करण के लिए XDSAPP के संयोजन पर ध्यान केंद्रित, संरचना शोधन के लिए fspipeline, और हिट खोजने के लिए PenDA ।इसके परिणामस्वरूप डीएमएसओ मुक्त भिगोने की स्थिति का उपयोग करके एआर प्रोटीन परिसर पर 15 हिट हुए। एक ही लक्ष्य के खिलाफ F2X प्रवेश स्क्रीन के पिछले अभियान में, भिगोने की हालत में DMSO सहित, 20 हिट पाया गया । इसका मतलब यह है कि 75% हिट की पहचान की जा सकती है अगर DMSO को छोड़ दिया जाता है।प्रयोग की सफलता के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रक्रिया के हर कदम के दौरान क्रिस्टल को ठीक से और सावधानी से संभाला जाए। क्रिस्टलीय टुकड़ा स्क्रीनिंग एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक के लिए परिपक्व हो गई है, जिसे अक्सर शिक्षा और दवा उद्योग में लागू किया जाता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

स्मार्टफ़ोन द्वारा डीएनए फ्रेगमेंट पृथक्करण का वास्तविक समय ट्रैकिंग

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

न्यूनतम नमूना लेकिन अधिकतम स्वचालन मोड में एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

टुकड़ा आधारित लीड डिस्कवरी में स्क्रीनिंग के लिए नैनो-अंतर स्कैनिंग फ्लोरीमीटर

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

अनुवाद विनियमन में आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

एक समय में स्थिर स्थानीय संरचना एक α-सिन्यूक्लिन मोनोमर की पहचान करने के लिए समय-संकल्पित प्रोटीन-प्रेरित फ्लोरेसेंस एन्हांसमेंट का उपयोग करना

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफिक अध्ययन के लिए लिपिड मोनोलेयर विधि का उपयोग करके नमूना तैयारी

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...